诱导型IL-18前药的制作方法

背景技术：

1、白细胞介素-18 (il-18)是在免疫系统中起关键作用的促炎细胞因子。已知其能够在被各种病原体感染后诱导细胞介导的免疫。il-18参与众多免疫应答，包括在t细胞和自然杀伤细胞中产生干扰素-γ (ifn-γ)。参见ihim等人, (2022), front immunol.,13:919973。

2、il-18有潜力用作抗癌药物，但其与抑制性诱饵受体il-18结合蛋白(il-18bp，其在肿瘤中常上调)的相互作用限制了其作为抗肿瘤剂的临床效用。参见deckers等人,(2023), nature, 1:286-3033。

3、不幸的是，由于细胞因子的生物学以及不能有效地靶向和控制其活性，细胞因子尚未在肿瘤治疗中实现所希望的临床优势。为了在细胞因子的预期作用部位(例如肿瘤微环境)达到所需的细胞因子水平，需要施用大量的细胞因子(即il-18)，这使这一问题更加严重。

4、诱导型il-12、il-2和干扰素前药已描述于以下国际公布号中：wo2019/222294、wo2019/222295、wo2019/222296、wo2021/097376。

5、对于治疗癌症的改进方法仍存在未满足的医学需求。

技术实现思路

1、本公开涉及诱导型il-18前药，其含有至少一条多肽链，并且如有需要，可含有两条或更多条多肽。诱导型il-18前药包含il-18多肽、il-18阻断元件、半衰期延长元件和蛋白酶可切割多肽接头。

2、本公开的诱导型il-18前药具有减弱的il-18受体激动剂活性，并且循环半衰期延长。通过阻断元件减弱诱导型il-18受体激动剂活性。半衰期延长元件也可有助于减弱，例如通过空间效应减弱。阻断元件能够通过与il-18非共价结合和/或空间阻断受体结合来阻断il-18的全部或部分受体激动剂活性。在蛋白酶可切割接头被切割后，释放具有活性(例如比il-18多肽前药更有活性)的il-18形式。通常，释放的il-18的活性是il-18多肽前药的至少10倍。优选地，释放的il-18的活性是诱导型il-18前药的至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少500倍、至少1000倍、至少约10,000倍或更高。

3、在诱导型il-18前药被切割后释放的il-18形式通常具有短的半衰期，其通常基本上类似于天然存在的细胞因子的半衰期。即使诱导型il-18前药的半衰期延长，毒性也会降低或消除，因为循环诱导型细胞因子前药的激动剂活性减弱并且活性il-18靶向所需的活性部位(例如肿瘤微环境)。

4、诱导型il-18前药可包含以下项中每一种的至少一者：il-18多肽[a]，即包含seqid no: 2-170、200-209或211-245中任一者的il-18多肽；[d] il-18阻断元件；半衰期延长元件[h]；和蛋白酶可切割多肽接头[l]。il-18多肽和il-18阻断元件或半衰期延长元件可通过蛋白酶可切割多肽接头可操作地连接，并且诱导型il-18前药具有减弱的il-18受体激活活性。诱导型il-18前药的il-18受体激活活性是含有通过切割蛋白酶可切割接头产生的il-18多肽的多肽的il-18受体激活活性的至多约1/10。

5、诱导型il-18前药可包含：il-18多肽[a]，即包含seq id no: 2-170、200-209或211-245中任一者的il-18多肽；[h]，半衰期延长元件，其包含seq id no: 602-606和608-654中的任一者，或与seq id no: 602-606和608-684中任一者的氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列；[d] il-18阻断元件；以及蛋白酶可切割多肽接头[l]，其包含seq idno: 354-379中的任一者或与选自由354-379组成的组的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

6、诱导型il-18前药可具有下式：

7、[a]-[l1]-[h]-[l2]-[d]；

8、[d]-[l2]-[h]-[l1]-[a]；

9、[a]-[l1]-[d]-[l2]-[h]；

10、[h]-[l2]-[d]-[l1]-[a]；

11、[h]-[l1]-[a]-[l2’]-[d]；或

12、[d]-[l1]-[a]-[l2’]-[h]。

13、[a]是il-18多肽，[d]是il-18阻断元件，[h]是半衰期延长元件，[l1]是蛋白酶可切割多肽接头，[l2]是任选蛋白酶可切割的多肽接头，并且[l2’]是蛋白酶可切割多肽接头。l2可为蛋白酶可切割多肽接头。l1或l2或l1和l2两者被两种或更多种不同的蛋白酶切割。

14、本文所公开的诱导型il-18前药可包含抗体的抗原结合片段作为il-18阻断元件。抗体的抗原结合片段可包含抗体轻链的至少抗原结合部分和互补抗体重链的至少抗原结合部分作为独立组分。诱导型il-18前药可包含：第一多肽，其包含il-18多肽、至少抗体轻链的抗原结合部分或抗体重链的抗原结合部分和半衰期延长元件；其中il-18多肽和抗体轻链的抗原结合部分或抗体重链的抗原结合部分和/或半衰期延长元件通过蛋白酶可切割接头可操作地连接；和第二多肽，其包含抗体重链或抗体轻链的至少抗原结合部分，该重链与第一多肽中的轻链互补，该轻链与第一多肽中的重链互补并与所述轻链一起形成il-18结合位点。

15、半衰期延长元件可为血清白蛋白结合结构域、血清白蛋白、转铁蛋白、或免疫球蛋白fc、或它们的片段。半衰期延长元件优选为血清白蛋白结合结构域。血清白蛋白结合结构域可为单结构域抗体片段(sdab)。当半衰期延长元件是sdab时，该sdab可包含seq id no:602-606和608-654中任一者的氨基酸序列，与seq id no: 602-606和608-654中任一者的氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。

16、il-18阻断结构域可为细胞因子多肽的同源受体的配体结合结构域或片段，或结合细胞因子多肽的抗体或抗体的抗原结合片段。抗体或抗原结合片段是结合细胞因子多肽的单结构域抗体、fab或scfv。优选地，抗体或抗原结合片段是fab。

17、阻断元件可包含含有seq id no: 172或seq id no: 174的氨基酸序列的抗体轻链(vl+cl)和含有seq id no: 171或seq id no: 173的氨基酸序列的抗体重链fab片段(vh+ch1)。

18、阻断元件可包含含有seq id no: 172或seq id no: 174的氨基酸序列的抗体轻链(vl+cl)和含有seq id no: 171或seq id no: 173的氨基酸序列的抗体重链fab片段(vh+ch1)。

19、阻断元件可包含：1)包含第一多肽的第一多肽链，该第一多肽包含seq id no:171的氨基酸序列或与seq id no: 171具有至少95%同一性的氨基酸序列或由其组成，和2)第二多肽，该第二多肽包含seq id no: 172或与seq id no: 172具有至少95%同一性的氨基酸序列或由其组成。

20、阻断元件可包含：1)包含第一多肽的第一多肽链，该第一多肽包含seq id no:173的氨基酸序列或与seq id no: 173具有至少95%同一性的氨基酸序列或由其组成，和2)第二多肽，该第二多肽包含seq id no: 174或与seq id no: 174具有至少95%同一性的氨基酸序列或由其组成。

21、阻断元件可包含：1)包含含有seq id no: 318的氨基酸序列的第一多肽的第一多肽链，和2)包含seq id no: 319或与seq id no: 319具有至少95%同一性的氨基酸序列的第二多肽。

22、阻断元件可包含：1)包含含有seq id no: 320的氨基酸序列的第一多肽的第一多肽链，和2)包含seq id no: 321的第二多肽。

23、阻断元件可包含：1)包含seq id no: 322的氨基酸序列的第一多肽链，和2)包含seq id no: 323的第二多肽。

24、本文所公开的阻断元件可为阻断元件1 (seq id no: 1033/seq id no: 1058)、阻断元件2 (seq id no: 1034/seq id no: 1059)、阻断元件3 (seq id no: 1035/seq idno: 1060)、阻断元件4 (seq id no: 1036/seq id no: 1061)、阻断元件5 (seq id no:1037/seq id no: 1062)、阻断元件6 (seq id no: 1038/seq id no: 1063)、阻断元件7(seq id no: 1039/seq id no: 1064)、阻断元件8 (seq id no: 1040/seq id no:1065)、阻断元件9 (seq id no: 1041/seq id no: 1066)、阻断元件10 (seq id no:1042/seq id no: 1067)、阻断元件11 (seq id no: 1043/seq id no: 1068)、阻断元件12(seq id no: 1044/seq id no: 1069)、阻断元件13 (seq id no: 1045/seq id no:1070)、阻断元件14 (seq id no: 1046/seq id no: 1071)、阻断元件15 (seq id no:1047/seq id no: 1072)、阻断元件16 (seq id no: 1048/seq id no: 1073)、阻断元件17(seq id no: 1049/seq id no: 1074)、阻断元件18 (seq id no: 1050/seq id no:1075)、阻断元件19 (seq id no: 1051/seq id no: 1076)、阻断元件20 (seq id no:1052/seq id no: 1077)、阻断元件21 (seq id no: 1053/seq id no: 1078)、阻断元件22(seq id no: 1054/seq id no: 1079)、阻断元件23 (seq id no: 1055/seq id no:1080)、阻断元件24 (seq id no: 1056/seq id no: 1081)或阻断元件25 (seq id no:1057/seq id no: 1082)。

25、本文所公开的il-18阻断元件抑制诱导型细胞因子前药对细胞因子多肽受体的激活。

26、蛋白酶可切割接头可包含能够被选自以下项的蛋白酶切割的序列：激肽释放酶、凝血酶、胃促胰酶、羧肽酶a、组织蛋白酶、弹性蛋白酶、pr-3、颗粒酶m、钙蛋白酶、基质金属蛋白酶(mmp)、adam、fap、纤溶酶原激活剂、半胱天冬酶、类胰蛋白酶或肿瘤蛋白酶。蛋白酶可切割接头可选自组织蛋白酶b、组织蛋白酶c、组织蛋白酶d、组织蛋白酶e、组织蛋白酶k、组织蛋白酶l或组织蛋白酶g。蛋白酶可切割接头可选自基质金属蛋白酶(mmp)，为mmp1、mmp2、mmp3、mmp8、mmp9、mmp10、mmp11、mmp12、mmp13或mmp14。蛋白酶可切割接头可包含独立地能够被蛋白酶切割的至少两个序列。蛋白酶可切割接头可包含合成序列。

27、蛋白酶可切割接头可包含选自由seq id no: 354-379组成的组的氨基酸序列或与选自由354-379组成的组的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。蛋白酶可切割接头可包含seq id no: 354的氨基酸序列。蛋白酶可切割接头可包含seq id no: 357的氨基酸序列。

28、本文所公开的诱导型il-18前药可为化合物1 (seq id no: 175/seq id no:187)、化合物2 (seq id no: 176/seq id no: 187)、化合物3 (seq id no: 177/seq idno: 187)、化合物4 (seq id no: 178/seq id no: 187)、化合物5 (seq id no: 179/seqid no: 187)、化合物6 (seq id no: 180/seq id no: 187)、化合物7 (seq id no: 181/seq id no: 187)、化合物8 (seq id no: 182/seq id no: 187)、化合物9 (seq id no:183/seq id no: 188)、化合物10 (seq id no: 184/seq id no: 188)、化合物11 (seq idno: 185/seq id no: 188)、或化合物12 (seq id no: 186/seq id no: 188)、化合物13(seq id no: 246/seq id no: 311)、化合物14 (seq id no: 247/seq id no: 312)、化合物15 (seq id no: 248/seq id no: 312)、化合物16 (seq id no: 249/seq id no:314)、化合物17 (seq id no: 250/seq id no: 313)、化合物18 (seq id no: 251/seq idno: 313)、化合物19 (seq id no: 252/seq id no: 313)、化合物20 (seq id no: 253/seq id no: 313)、化合物21 (seq id no: 254/seq id no: 313)、化合物22 (seq id no:255/seq id no: 311)、化合物23 (seq id no: 256/seq id no: 311)、化合物24 (seq idno: 257/seq id no: 313)、化合物25 (seq id no: 258/seq id no: 313)、化合物26(seq id no: 259/seq id no: 314)、化合物27 (seq id no: 260/seq id no: 314)、化合物28 (seq id no: 261/seq id no: 314)、化合物29 (seq id no: 262/seq id no:314)、化合物30 (seq id no: 263/seq id no: 313)、化合物31 (seq id no: 264/seq idno: 313)、化合物32 (seq id no: 265/seq id no: 315)、化合物33 (seq id no: 266/seq id no: 315)、化合物34 (seq id no: 267/seq id no: 315)、化合物35 (seq id no:268/seq id no: 315)、化合物36 (seq id no: 269/seq id no: 316)、化合物37 (seq idno: 270/seq id no: 316)、化合物38 (seq id no: 271/seq id no: 316)、化合物39(seq id no: 272/seq id no: 316)、化合物40 (seq id no: 273/seq id no: 315)、化合物41 (seq id no: 274/seq id no: 315)、化合物42 (seq id no: 275/seq id no:315)、化合物43 (seq id no: 276/seq id no: 315)、化合物44 (seq id no: 277/seq idno: 315)、化合物45 (seq id no: 278/seq id no: 315)、化合物46 (seq id no: 279/seq id no: 315)、化合物47 (seq id no: 280/seq id no: 315)、化合物48 (seq id no:281/seq id no: 317)、化合物49 (seq id no: 282/seq id no: 317)、化合物50 (seq idno: 283/seq id no: 317)、化合物51 (seq id no: 284/seq id no: 317)、化合物52(seq id no: 285/seq id no: 317)、化合物53 (seq id no: 286/seq id no: 317)、化合物54 (seq id no: 287/seq id no: 313)、化合物55 (seq id no: 288/seq id no:313)、化合物56 (seq id no: 289/seq id no: 313)、化合物57 (seq id no: 290/seq idno: 313)、化合物58 (seq id no: 291/seq id no: 313)、化合物59 (seq id no: 292/seq id no: 313)、化合物60 (seq id no: 293/seq id no: 313)、化合物61 (seq id no:294/seq id no: 313)、化合物62 (seq id no: 295/seq id no: 314)、化合物63 (seq idno: 296/seq id no: 314)、化合物64 (seq id no: 297/seq id no: 314)、化合物65(seq id no: 298/seq id no: 314)、化合物66 (seq id no: 299/seq id no: 314)、化合物67 (seq id no: 300/seq id no: 314)、化合物68 (seq id no: 301/seq id no:316)、化合物69 (seq id no: 302/seq id no: 316)、化合物70 (seq id no: 303/seq idno: 316)、化合物71 (seq id no: 304/seq id no: 316)、化合物72 (seq id no: 305/seq id no: 311)、化合物73 (seq id no: 306/seq id no: 315)、化合物74 (seq id no:307/seq id no: 315)、化合物75 (seq id no: 308/seq id no: 316)、化合物76 (seq idno: 309/seq id no: 316)或化合物77 (seq id no: 310/seq id no: 313)。

29、本文所公开的诱导型il-18前药可为化合物78、化合物79、化合物80、化合物81、化合物82、化合物83、化合物84、化合物85、化合物86、化合物87、化合物88、化合物89、化合物90、化合物91、化合物92、化合物93、化合物94、化合物95、化合物96、化合物97、化合物98、化合物99、化合物100、化合物101、化合物102、化合物103、化合物104、化合物105、化合物106、化合物107、化合物108、化合物109、化合物110、化合物111、化合物112、化合物113、化合物114、化合物115、化合物116、化合物117、化合物118、化合物119、化合物120、化合物121、化合物122、化合物123、化合物124、化合物125、化合物126、化合物127、化合物128、化合物129、化合物130、化合物131、化合物132、化合物133、化合物134、化合物134、化合物135、化合物136、化合物137、化合物138、化合物139、化合物140、化合物141、化合物142、化合物143、化合物144、化合物145、化合物146、化合物147、化合物148、化合物149、化合物150、化合物151、化合物152、化合物153、化合物154、化合物155、化合物156、化合物157、化合物158、化合物159、化合物160、化合物161、化合物162、化合物163、化合物164、化合物165、化合物166、化合物167、化合物168、化合物169、化合物170、化合物171、化合物172、化合物173、化合物174、化合物175、化合物176、化合物177、化合物178、化合物179、化合物180、化合物181、化合物182、化合物183、化合物184、化合物184、化合物185、化合物186、化合物187、化合物188、化合物189、化合物190、化合物191、化合物192、化合物193、化合物194、化合物195、化合物196、化合物197、化合物198、化合物199、化合物200、化合物201、化合物202、化合物203、化合物204、化合物205、化合物206、化合物207、化合物208、化合物209、化合物210、化合物211、化合物212、化合物213、化合物214、化合物215、化合物216、化合物217、化合物218、化合物219、化合物220、化合物221、化合物222、化合物223、化合物224、化合物225、化合物226、化合物227、化合物228、化合物229、化合物230、化合物231、化合物232、化合物233、化合物234、化合物235、化合物236、化合物237、化合物238、化合物239、化合物240、化合物241、化合物242、化合物243、化合物244、化合物245、化合物246、化合物247、化合物248、化合物249、化合物250、化合物251、化合物252、化合物253、化合物254、化合物255、化合物256、化合物257、化合物258、化合物259、化合物260、化合物261、化合物262、化合物263、化合物264、化合物265、化合物266、化合物267、化合物268、化合物269、化合物270、化合物271、化合物272、化合物273、化合物274、化合物275、化合物276、化合物277、化合物278或化合物279。

30、本文所公开的诱导型il-18前药可包含以下项中每一种的至少一者：a) il-18多肽[a]，其中il-18多肽包含seq id no: 2-170、200-209或211-245中的任一者；b)半衰期延长元件[h]，其中半衰期延长元件包含seq id no: 602-606和608-654中的任一者，或与seqid no: 602-606和608-684中任一者的氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列；c)il-18阻断元件[d]；和d)蛋白酶可切割接头[l]，其中蛋白酶可切割接头包含seq id no:355-379或426中的任一者或与选自由355-379或426组成的组的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。il-18多肽和il-18阻断元件或半衰期延长元件通过蛋白酶可切割多肽接头可操作地连接，并且诱导型il-18前药具有减弱的il-18受体激活活性，其中诱导型il-18前药的il-18受体激活活性是含有通过切割蛋白酶可切割接头产生的il-18多肽的多肽的il-18受体激活活性的至多约1/10。

31、本文所描述的诱导型il-18前药可包含il-18多肽、半衰期延长元件、il-18阻断元件和蛋白酶可切割接头，其中il-18阻断元件是抗体的抗原结合片段，其中抗原结合片段包含抗体轻链的至少抗原结合部分和互补抗体重链的至少抗原结合部分作为独立组分，并且诱导型il-18前药包含：i)第一多肽，其包含il-18多肽，其中il-18多肽包含seq id no: 2-170、200-209或211-245中的任一者；半衰期延长元件，其中半衰期延长元件包含seq idno: 602-606和608-654中的任一者，或与seq id no: 602-606和608-654中任一者的氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列；抗体重链的抗原结合部分，其中该重链的抗体结合部分包含seq id no: 171、173、318、320、331、322、329、330、337、339、353、354、655-660、662、664、733-736、738-742、820-823、875-877、920、966-969、1005、1006、1010或1011中的任一者；其中il-18多肽和抗体重链的抗原结合部分和/或半衰期延长元件通过蛋白酶可切割接头可操作地连接，其中蛋白酶可切割接头包含seq id no: 354-379中的任一者；和2)第二多肽，其包含抗体轻链的至少抗原结合部分，该轻链与第一多肽中的重链互补并与所述轻链一起形成il-18结合位点，其中抗体轻链包含seq id no: 172、174、187、188、311、312、314-316、319、321、323、815、816、862-872、1012-1016或1019中的任一者。

32、本公开还涉及一种核酸，其编码诱导型il-18前药。核酸可包含环状载体。核酸可包含dna。核酸可包含rna。本文公开了制备药物组合物的方法，其包括在适于表达和收集诱导型il-18前药的条件下培养宿主细胞。本文公开了一种核酸组合物，其包含一种或多种编码诱导型il-18前药的核酸序列。诱导型il-18前药包含以下项中每一种的至少一者：il-18多肽[a]；il-18阻断元件[d]；半衰期延长元件[h]；和蛋白酶可切割多肽接头[l]。il-18多肽和il-18阻断元件或半衰期延长元件通过蛋白酶可切割多肽接头可操作地连接，并且诱导型il-18前药具有减弱的il-18受体活性。

33、核酸组合物可包含编码含有两条多肽链的诱导型il-18前药的一个或多个核酸序列。诱导型il-18前药可包含抗体的抗原结合片段作为il-18阻断元件。抗体的抗原结合片段可包含抗体轻链的至少抗原结合部分和互补抗体重链的至少抗原结合部分作为独立组分。诱导型il-18前药可包含：第一多肽，其包含il-18多肽、至少抗体轻链的抗原结合部分或抗体重链的抗原结合部分和半衰期延长元件；其中il-18多肽和抗体轻链的抗原结合部分或抗体重链的抗原结合部分和/或半衰期延长元件通过蛋白酶可切割接头可操作地连接；和第二多肽，其包含抗体重链或抗体轻链的至少抗原结合部分，该重链与第一多肽中的轻链互补，该轻链与第一多肽中的重链互补并与所述轻链一起形成il-18结合位点。

34、本公开还涉及治疗方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的诱导型il-18前药、编码诱导型il-18前药的核酸、含有这种核酸的载体或宿主细胞，以及前述中任一者的药物组合物。通常，受试者患有或有风险患有癌症、增殖性疾病、肿瘤性疾病、炎性疾病、免疫性病症、自身免疫性疾病、感染性疾病、病毒性疾病、过敏反应、寄生虫反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病。本文所公开的方法特别适用于治疗癌症。诱导型il-18前药可静脉内施用。