一种抗肿瘤用干细胞结合负氢离子制剂及其制备方法与流程

本发明涉及生物医药，具体涉及一种抗肿瘤用干细胞结合负氢离子制剂及其制备方法。

背景技术：

1、肺癌是世界范围内发病率和致死率最高的癌症之一，每年有超过一百万例新发病例，绝大多数病例与吸烟有关。肺癌分为两大类型，小细胞肺癌（sclc）和非小细胞肺癌（nsclc），后者包括多种亚型。腺癌是nsclc亚型中最常见的，其发病率正在逐年上升，也是女性和从不吸烟者中最常见的肺癌类型。尽管近年来对于肺癌的诊断和治疗方面取得了一定进步，但肺癌患者的整体生存率仍低于15%。

2、干细胞是一类具有分化潜能、免疫调节和归巢特性的细胞，具有作为肿瘤药物递送载体的潜力，但对肿瘤微环境的靶向效率较低；巨噬细胞可以通过吞噬作用或摄取并清除癌细胞，但癌细胞通常高表达cd47分子，抑制了巨噬细胞的吞噬作用，从而逃避免疫清除。

3、因此，亟需一种高靶向性、提升人体自身免疫系统功能的干细胞制剂以解决上述问题。

技术实现思路

1、为此，本发明提供一种抗肿瘤用干细胞结合负氢离子制剂及其制备方法，以解决现有技术由于干细胞对肿瘤微环境的靶向效率较低而导致的药物递送效率较低的问题。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、根据本发明的第一方面，提供了一种抗肿瘤用干细胞结合负氢离子制剂，所述制剂包括工程化干细胞分散液、负氢离子载体及药学上可接受的载体。

4、进一步地，所述工程化干细胞分散液为经诱导抑制巨噬细胞吞噬的基因表达下调、促进巨噬细胞吞噬的基因表达上调并连接par1蛋白的肺间充质干细胞分散液，活细胞数为1×105-1×107个/ml；所述药学上可接受的载体为生理盐水、磷酸盐缓冲液或医用生物相容性基质。

5、进一步地，抑制巨噬细胞吞噬的基因为cd47，所述促进巨噬细胞吞噬的基因为crt；其中，诱导cd47基因表达下调的诱导剂为儿茶素；诱导crt基因表达上调的诱导剂为紫铆因。

6、进一步地，所述负氢离子载体为核-壳结构；其中，壳部分为聚乳酸-羟基乙酸共聚物，核部分包括以下质量份组分：环糊精30-50份、透明质酸15-25份、西洋山梅花提取物20-40份、负氢离子粉体5-15份。

7、进一步地，所述工程化干细胞分散液与药学上可接受的载体的体积比为1:(1-5)，所述工程化干细胞分散液与负氢离子载体的体积质量比为1ml:(0.2-1)mg，所述药学上可接受的载体与负氢离子载体的体积质量比为(1-10)ml:1mg；所述制剂的剂型为注射剂，注射方式为静脉注射。

8、根据本发明的第二方面，提供了一种抗肿瘤用干细胞结合负氢离子制剂的制备方法，用于制备上述制剂，具体包括以下步骤：

9、s1、将培养至第三代的间充质干细胞接种于96孔板中，加入含10%fbs的dmem培养基中37℃、5%co2氛围下培养12h，培养后分别依次在含儿茶素和含紫铆因的dmem培养基中继续培养24-48h，得促巨噬细胞吞噬的干细胞；其中，两次培养后均进行洗脱备用；

10、s2、par1蛋白的连接：

11、将棕榈酸n-羟基琥珀酰亚胺酯溶于二甲基亚砜，加入到含par1蛋白的磷酸盐缓冲液中，室温反应1-4h，以去离子水透析24h后冻干，得pa-par1；

12、将促巨噬细胞吞噬的干细胞以含pa-par1的dmem培养基培养5-15min；培养条件为37℃、5%co2氛围，洗脱后得工程化干细胞；以生理盐水分散后得工程化干细胞分散液；

13、s3、负氢离子载体的制备：

14、将环糊精、负氢离子粉体、透明质酸、西洋山梅花提取物按比例混合后，浸泡于聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液进行包封，去除溶剂并冻干，得负氢离子载体；

15、s4、将工程化干细胞分散液、负氢离子载体和药学上可接受的载体按比例混合分散，50-100rpm下室温搅拌，得抗肿瘤用干细胞结合负氢离子制剂。

16、进一步地，步骤s1所述的含儿茶素和含紫铆因的dmem培养基中儿茶素和紫铆因在dmem培养基中的浓度分别为30-70μm和5-10μm。

17、进一步地，步骤s2所述的棕榈酸n-羟基琥珀酰亚胺酯溶于二甲基亚砜的浓度为3-10mg/ml，par1蛋白的磷酸盐缓冲液中par1蛋白的浓度为0.1mg/ml，含pa-par1的dmem培养基中pa-par1的浓度为1-20μg/ml。

18、进一步地，步骤s3具体包括以下步骤：

19、将环糊精、负氢离子粉体、西洋山梅花提取物和透明质酸按比例混合后，浸泡于终浓度1-5mg/ml聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙酸乙酯溶液，室温下混合均匀后，将混合液在30-40℃下水浴真空旋转蒸发，使共聚物固化并均匀地包裹在预包覆体表面，冻干得负氢离子载体；

20、其中，西洋山梅花提取物的制备包括以下步骤：

21、将新鲜的西洋山梅花破碎成1-2cm的小块，经清水清洗后，与去离子水以质量体积比1g:（5-10）ml混合，调ph4.0-6.0，加入混合液质量1-2%的复合水解酶，于40-50℃下酶解4-8h，酶解结束后升温至90-95℃灭酶，得酶解液；其中，所述复合水解酶为纤维素酶和木质素酶以质量比4:1混合得到；

22、对酶解液以孔径0.1-0.2μm的滤膜进行微滤以去除大分子纤维，收集透过液；

23、将透过液浓缩后喷雾干燥，得到西洋山梅花提取物。

24、根据本发明的第三方面，提供了一种抗肿瘤用干细胞结合负氢离子制剂在制备治疗肺癌药物中的应用。

25、本发明具有如下优点：

26、1、本发明通过对间充质干细胞分别进行儿茶素和紫铆因诱导处理，下调cd47表达并上调crt表达，使干细胞能被巨噬细胞高效识别并吞噬，工程化干细胞本身靶向肿瘤并存活，在肿瘤微环境中，由于高表达的crt和低表达的cd47，被肿瘤相关巨噬细胞（tams）识别并吞噬，从而在肿瘤原位释放负氢离子载体，实现精准递送。此外，本发明在干细胞表面连接par1蛋白，响应肺癌微环境中高表达的mmp1蛋白，结合肺首过效应和巨噬细胞的吞噬作用，协同提升了制剂的靶向递送效率。

27、2、本发明将负氢离子粉体包封于核-壳结构的载体中，避免了负氢离子在体内循环的过程中的活性衰减，延长了其在肿瘤部位的持续作用时间；且该载体连同干细胞被巨噬细胞吞噬后，利用负氢离子的强还原性，可以将促癌的m2型细胞极化为抑癌的m1型细胞，从而促进肺癌治疗。

1.一种抗肿瘤用干细胞结合负氢离子制剂，其特征在于，所述制剂包括工程化干细胞分散液、负氢离子载体及药学上可接受的载体。

2.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述工程化干细胞分散液为经诱导抑制巨噬细胞吞噬的基因表达下调、促进巨噬细胞吞噬的基因表达上调并连接par1蛋白的肺间充质干细胞分散液，活细胞数为1×105-1×107个/ml；所述药学上可接受的载体为生理盐水、磷酸盐缓冲液或医用生物相容性基质。

3.如权利要求2所述的制剂，其特征在于，抑制巨噬细胞吞噬的基因为cd47，所述促进巨噬细胞吞噬的基因为crt；其中，诱导cd47基因表达下调的诱导剂为儿茶素；诱导crt基因表达上调的诱导剂为紫铆因。

4.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述负氢离子载体为核-壳结构；其中，壳部分为聚乳酸-羟基乙酸共聚物，核部分包括以下质量份组分：环糊精30-50份、透明质酸15-25份、西洋山梅花提取物20-40份、负氢离子粉体5-15份。

5.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述工程化干细胞分散液与药学上可接受的载体的体积比为1:(1-5)，所述工程化干细胞分散液与负氢离子载体的体积质量比为1ml:(0.2-1)mg，所述药学上可接受的载体与负氢离子载体的体积质量比为(1-10)ml:1mg；所述制剂的剂型为注射剂，注射方式为静脉注射。

6.一种抗肿瘤用干细胞结合负氢离子制剂的制备方法，用于制备权利要求1-5任一项所述的制剂，其特征在于，具体包括以下步骤：

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤s1所述的含儿茶素和含紫铆因的dmem培养基中儿茶素和紫铆因在dmem培养基中的浓度分别为30-70μm和5-10μm。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤s2所述的棕榈酸n-羟基琥珀酰亚胺酯溶于二甲基亚砜的浓度为3-10mg/ml，par1蛋白的磷酸盐缓冲液中par1蛋白的浓度为0.1mg/ml，含pa-par1的dmem培养基中pa-par1的浓度为1-20μg/ml。

9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤s3具体包括以下步骤：

10.一种抗肿瘤用干细胞结合负氢离子制剂在制备治疗肺癌药物中的应用。