一种仿生载多粘菌素B纳米粒及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医药，具体为一种仿生载多粘菌素b纳米粒及其制备方法和应用。

背景技术：

1、铜绿假单胞菌肺部感染的治疗核心在于快速降低肺部细菌负荷、减轻炎症损伤并避免感染复发。目前该感染的治疗面临两大主要挑战：其一，铜绿假单胞菌能够形成由胞外多糖、蛋白质和胞外dna组成的生物膜，生物膜可降低抗菌药物在菌群中的有效暴露，并帮助细菌逃避宿主免疫清除；其二，临床用于治疗耐药革兰阴性菌感染的多粘菌素b具有明显的肾毒性和神经毒性，系统给药的安全性受限。单纯提高多粘菌素b的给药剂量虽可增强杀菌作用，但容易进一步增加毒副作用。因此，寻找既能干预生物膜又能在感染环境中释放抗菌药物的递送体系尤为关键。

2、铜绿假单胞菌氨肽酶（paap）是生物膜基质中高丰度的分泌型氨肽酶，与生物膜发育和营养循环有关。序列为erwghdfik的环肽经谷氨酸与赖氨酸侧链异肽键环化后可抑制paap活性，从而干预铜绿假单胞菌生物膜。然而，现有抗菌体系仍难以同时实现paap相关生物膜干预、感染酸性环境响应释药和多粘菌素b毒性降低。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种仿生载多粘菌素b纳米粒，该纳米粒可用于制备治疗铜绿假单胞菌肺部感染的药物，并可降低游离多粘菌素b的细胞毒性，兼顾抗菌效果与用药安全性，更好的满足实际应用需求。

2、本发明一方面提供了一种仿生载多粘菌素b纳米粒，包括聚合物纳米核心和包覆于所述聚合物纳米核心表面的巨噬细胞膜仿生层；所述聚合物纳米核心载有多粘菌素b和柠康酸酐修饰聚赖氨酸；所述巨噬细胞膜仿生层表面负载抗生物膜环肽。

3、本发明通过采用载有多粘菌素b和柠康酸酐修饰聚赖氨酸的聚合物纳米核心，利用柠康酸酐修饰聚赖氨酸在酸性环境下发生电荷反转的特性，促使纳米粒在感染酸性环境中发生颗粒膨胀并促进多粘菌素b释放，有利于提高感染部位的药物暴露和杀菌效果。

4、本发明通过使巨噬细胞膜仿生层包覆聚合物纳米核心，仿生层能够保留cd11b、ccr2等巨噬细胞膜特征蛋白，有利于提高纳米粒的生物相容性，并降低游离多粘菌素b的细胞毒性。

5、本发明通过将抗生物膜环肽负载于巨噬细胞膜仿生层表面，该环肽能够抑制铜绿假单胞菌氨肽酶paap活性，从而干预铜绿假单胞菌生物膜，与多粘菌素b的杀菌作用共同提高对铜绿假单胞菌的抗菌效果。

6、在一种实施方式中，所述抗生物膜环肽的氨基酸序列为erwghdfik。

7、在一种实施方式中，所述抗生物膜环肽中谷氨酸残基的侧链羧基与赖氨酸残基的侧链氨基通过异肽键连接形成环状结构，并保留肽链n端氨基和c端羧基。

8、在一种实施方式中，所述聚合物纳米核心还包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）。

9、在一种实施方式中，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的制备方法，包括以下步骤：

10、将d,l-丙交酯和乙交酯混合，加入辛酸亚锡和月桂醇，在真空条件下反应；反应结束后冷却，以无水二氯甲烷溶解，并加入无水甲醇中沉淀，所得沉淀真空干燥，得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物。

11、在一种实施方式中，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的制备方法，包括以下步骤：

12、将d,l-丙交酯和乙交酯按质量比1-2:1混合，加入占单体总质量（d,l-丙交酯和乙交酯总质量）0.02-0.03%的辛酸亚锡和0.008-0.01%的月桂醇，在真空条件下于170-180 ℃反应1.5-2 h；反应结束后冷却，以无水二氯甲烷溶解，并加入无水甲醇中沉淀，所得沉淀于60-65℃真空干燥40-48 h，得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物。

13、在一种实施方式中，所述仿生载多粘菌素b纳米粒的粒径为100~300nm。

14、在一种实施方式中，所述仿生载多粘菌素b纳米粒在ph7.4条件下的平均粒径为172.1nm，在ph5.5条件下的平均粒径为262.1nm。该粒径范围经过结构表征和稳定性测试，纳米粒在正常生理环境下保持相对稳定，在酸性环境下发生电荷反转和颗粒膨胀，有利于多粘菌素b释放。

15、在一种实施方式中，所述巨噬细胞膜仿生层来源于raw264.7巨噬细胞膜，并保留cd11b和ccr2膜蛋白。

16、在一种实施方式中，所述多粘菌素b与柠康酸酐修饰聚赖氨酸的质量比为0.5-2:1。

17、在一种实施方式中，所述多粘菌素b与柠康酸酐修饰聚赖氨酸的质量比为1:1。

18、在一种实施方式中，所述巨噬细胞膜与多粘菌素b的质量比为0.5-2:1。

19、在一种实施方式中，所述巨噬细胞膜与多粘菌素b的质量比为1:1。

20、本发明另一方面提供了一种仿生载多粘菌素b纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

21、提取巨噬细胞膜并进行超声处理，得到巨噬细胞膜纳米粒；

22、将抗生物膜环肽与巨噬细胞膜纳米粒混合，得到环肽修饰巨噬细胞膜纳米粒；

23、将聚赖氨酸与柠康酸酐反应，得到柠康酸酐修饰聚赖氨酸；

24、将多粘菌素b与柠康酸酐修饰聚赖氨酸混合并用聚乳酸-羟基乙酸共聚物包载，得到载多粘菌素b的聚合物纳米核心；

25、将环肽修饰巨噬细胞膜纳米粒与所述聚合物纳米核心混合并进行超声处理，获得所述仿生载多粘菌素b纳米粒。

26、在一种实施方式中，所述巨噬细胞膜由raw264.7巨噬细胞经反复冻融和差速离心获得，所得巨噬细胞膜经超声2-3min得到巨噬细胞膜纳米粒。

27、在一种实施方式中，提取巨噬细胞膜时，raw264.7巨噬细胞的数量为2×107~5×107个，反复冻融次数为3次，差速离心条件依次为4℃、700×g离心10min和4℃、14000×g离心30min。

28、在一种实施方式中，将所述抗生物膜环肽与巨噬细胞膜纳米粒在20-30℃下混合20-40min，然后以20000-30000×g离心15-20min，去除游离的抗生物膜环肽。

29、在一种实施方式中，所述柠康酸酐修饰聚赖氨酸通过以下方法制备：

30、将40-60mg聚赖氨酸溶于2-5mlpbs缓冲液中，加入80-90mg柠康酸酐，用氢氧化钠溶液将ph调至中性，20-30℃下搅拌过夜，经截留分子量为500-600da的透析袋透析72-80h后冻干，得到柠康酸酐修饰聚赖氨酸。

31、在一种实施方式中，所述柠康酸酐修饰聚赖氨酸通过以下方法制备：

32、将50mg聚赖氨酸溶于2mlpbs缓冲液，加入87.4mg柠康酸酐，用5mol/l氢氧化钠溶液将ph调至中性，室温搅拌过夜，经截留分子量为500da的透析袋透析72h后冻干，得到柠康酸酐修饰聚赖氨酸.

33、在一种实施方式中，所述聚合物纳米核心通过以下方法制备：

34、将多粘菌素b与柠康酸酐修饰聚赖氨酸混合并超声30-40s，将所得复合物与聚乳酸-羟基乙酸共聚物在有机相中乳化后加入含透明质酸的体积分数为40-60%的乙醇溶液中，经旋转蒸发和透析纯化，得到所述聚合物纳米核心。

35、在一种实施方式中，所述聚合物纳米核心通过以下方法制备：

36、将多粘菌素b与柠康酸酐修饰聚赖氨酸按照质量比1:1混合并超声30s；取1mg所得复合物溶于100μl超纯水，取5mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于1ml二氯甲烷，混合后超声1min；将所得乳剂加入含5mg透明质酸的25ml体积分数为50%的乙醇溶液中，室温搅拌10min，于30℃旋转蒸发除去有机溶剂，并采用截留分子量为3500da的透析袋透析72h。

37、本发明第三方面提供了上述仿生载多粘菌素b纳米粒在制备治疗铜绿假单胞菌肺部感染药物中的应用。

38、本发明提供的纳米粒能够降低铜绿假单胞菌肺部感染小鼠的肺部细菌载量，改善tnf-α、il-6、il-1β等炎症因子以及白细胞、粒细胞、血小板等血常规指标，并减轻肺组织损伤，表明其可用于制备治疗铜绿假单胞菌肺部感染的药物。

39、有益效果

40、1、本发明提供了一种仿生载多粘菌素b纳米粒，该纳米粒可用于制备治疗铜绿假单胞菌肺部感染的药物，并可降低游离多粘菌素b的细胞毒性，兼顾抗菌效果与用药安全性，更好的满足实际应用需求。

41、2、本发明通过采用载有多粘菌素b和柠康酸酐修饰聚赖氨酸的聚合物纳米核心，利用柠康酸酐修饰聚赖氨酸在酸性环境下发生电荷反转的特性，促使纳米粒在感染酸性环境中发生颗粒膨胀并促进多粘菌素b释放，有利于提高感染部位的药物暴露和杀菌效果。

42、3、本发明通过使巨噬细胞膜仿生层包覆聚合物纳米核心，仿生层能够保留cd11b、ccr2等巨噬细胞膜特征蛋白，有利于提高纳米粒的生物相容性，并降低游离多粘菌素b的细胞毒性。

43、4、本发明通过将抗生物膜环肽负载于巨噬细胞膜仿生层表面，该环肽能够抑制铜绿假单胞菌氨肽酶paap活性，从而干预铜绿假单胞菌生物膜，与多粘菌素b的杀菌作用共同提高对铜绿假单胞菌的抗菌效果。

44、5、本发明提供的纳米粒能够降低铜绿假单胞菌肺部感染小鼠的肺部细菌载量，改善tnf-α、il-6、il-1β等炎症因子以及白细胞、粒细胞、血小板等血常规指标，并减轻肺组织损伤，表明其可用于制备治疗铜绿假单胞菌肺部感染的药物。