SLC1A4作为免疫治疗靶点在制备抗肿瘤药物中的应用

本发明属于生物医药与肿瘤免疫治疗领域，具体涉及slc1a4（又称asct1）作为肿瘤免疫治疗靶点在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

1、氨基酸转运体slc1a4（solute carrier family 1 member 4，又称asct1） 基因属于溶质载体转运蛋白1家族成员， 包含8个外显子，位于染色体2p14.8上。slc1a4是一种钠依赖性中性氨基酸转运体，主要负责转运丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸等小分子中性氨基酸。slc1a4蛋白主要在中枢神经系统表达。slc1a4的生理作用自首次发现以来一直在被研究，但目前对其功能的了解较少。现有技术对slc1a4的关注主要集中在神经系统中的功能，slc1a4最被认可的功能似乎与大脑稳态有关。

2、免疫检查点抑制剂疗法在众多恶性实体瘤中都具有非常显著的疗效， 能有效抑制肿瘤生长，延长患者的生存期。免疫检查点抑制剂的作用机制是主要通过对抗ctla-4，pd-1或pd-l1等免疫抑制性受体，恢复患者t细胞的免疫活性，从而增强抗肿瘤免疫反应。

3、pd-1（程序性死亡受体1），也称为cd279（分化簇279），是一种重要的免疫抑制分子。通过向下调节免疫系统对人体细胞的反应，以及通过抑制t细胞炎症活动来调节免疫系统并促进自身耐受。这可以预防自身免疫性疾病，但它也可以防止免疫系统杀死癌细胞。

4、pd-1抑制剂是阻断pd-1的一类新药，可激活免疫系统以攻击肿瘤，并用于治疗某些类型的癌症。

5、联合免疫治疗可显著提高肿瘤缓解率、降低疾病进展风险，从而延长总生存期，改善患者生活质量。

6、现有技术从未揭示slc1a4在肿瘤免疫逃逸中的任何功能，也未涉及肿瘤细胞通过slc1a4主动掠夺微环境中的丝氨酸来限制免疫细胞的营养可用性，从而抑制抗肿瘤免疫应答的机制。更没有slc1a4抑制剂与pd-1抑制剂联合治疗的相关报道。

技术实现思路

1、为了克服现在技术的缺陷，本发明提供slc1a4作为治疗靶点在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的应用中，揭示了slc1a4特异性阻断肿瘤细胞对微环境丝氨酸的掠夺、从而精准恢复t细胞功能的靶向策略。为肿瘤免疫治疗提供了全新的干预靶点。

2、本发明通过如下技术方案实现：

3、本发明提供slc1a4作为治疗靶点在制备抗肿瘤药物中的应用。

4、进一步地，本发明提供slc1a4作为免疫治疗靶点在制备抗肿瘤药物中的应用。

5、进一步地，本发明提供slc1a4作为免疫治疗靶点在开发、设计、筛选抗肿瘤药物中的应用。

6、进一步地，所述的肿瘤为slc1a4高表达的肿瘤，优选为肝癌、结直肠癌、肺癌、黑色素瘤或乳腺癌。

7、本发明通过tcga数据库及90对肝癌-癌旁组织芯片免疫荧光分析，发现肝癌组织中slc1a4 mrna和蛋白水平均显著高于正常肝组织，且slc1a4高表达患者的总体生存率显著低于低表达患者。在人肝癌细胞系中slc1a4广泛表达。

8、利用crispr/cas9技术在人hepg2和小鼠hepa1-6bl肝癌细胞中敲除slc1a4，cck-8、edu、annexin v、划痕愈合及克隆形成实验一致证明，slc1a4缺失不影响肿瘤细胞本身的活力、增殖、凋亡、迁移和集落形成能力。但敲除肝癌细胞中slc1a4却仍能显著抑制肿瘤生长和转移，并减少肝损伤。

9、实验结果表明：肿瘤细胞通过slc1a4大量摄取微环境中的丝氨酸，导致肿瘤组织间隙液和血清中丝氨酸水平降低，从而“饿死”cd8+t细胞，抑制其增殖和效应功能；而敲除slc1a4则能解除这种营养劫持，恢复t细胞的pi3k/akt/mtorc1、mapk及nf-κb信号通路，重新激活抗肿瘤免疫。因此，slc1a4可以作为肝癌免疫治疗靶点用于开发、设计、筛选抗肝癌的药物，还可以用于制备抗肝癌的药物。

10、所述的药物通过阻断肿瘤细胞对微环境中丝氨酸的摄取，解除对cd8+ t细胞的营养抑制，恢复t细胞的pi3k/akt/mtorc1、mapk及nf-κb信号通路，从而增强抗肿瘤免疫应答。

11、本发明提供一种slc1a4抑制剂，所述的slc1a4抑制剂为能够降低slc1a4表达或阻断其氨基酸转运活性的靶向slc1a4的小分子抑制剂、小干扰rna（sirna）、短发夹rna（shrna）、反义寡核苷酸、单克隆抗体、双特异性抗体、纳米抗体、适配体、crispr/cas9基因编辑试剂中的一种或几种。

12、优选地，所述slc1a4抑制剂为靶向slc1a4的小分子抑制剂、sgrna、sirna、shrna或反义寡核苷酸。

13、所述的sirna包含与slc1a4 mrna互补的序列，并能够特异性沉默slc1a4基因的表达。

14、本发明进一步提供了一种slc1a4抑制剂，所述的slc1a4抑制剂选自正向5’-3’端为seq id no.1-8，对应反向5’-3’端为seq id no.9-16的序列或其修饰形式。

15、进一步地，所述的修饰形式指含有如上slc1a4抑制剂的纳米载药系统，如脂质体、纳米粒、纳米混悬液等。

16、所述的slc1a4抑制剂的序列如表1所示。

17、

18、进一步地，所述的纳米混悬液包含表1中的sgrna或sirna、plga-peg共聚物，sgrna或sirna：plga-peg共聚物的质量比为1：10-50。plga分子量1000-5000，peg分子量约2000-5000，且plga单体比例为乳酸/乙醇酸=50/50。

19、并通过双乳化-溶剂蒸发法制备。所述的制备方法包括如下步骤：

20、（1）slc1a4 sirna用少量depc水稀释至适当浓度作为内水相，slc1a4 sirna在内水相中的浓度为0.5-2mg/ml。

21、（2）将plga-peg共聚物溶解于二氯甲烷中作为油相，plga-peg共聚物的浓度为10-30mg/ml。

22、（3）将内水相逐滴加入油相中，通过40-60w探头超声乳化形成初乳（w/o）。

23、（4）随后将初乳快速注入至含聚乙烯醇（pva）的外水相中（pva的浓度为1%），再次超声乳化形成复乳（w/o/w）。

24、（5）所得乳液利用旋转蒸发仪去除有机溶剂，浓缩纳米颗粒悬液，得到包裹了sirna的纳米粒混悬液。所制备的纳米混悬液粒径约为100-150nm。

25、本发明提供一种增强cd8+t细胞增殖、颗粒酶b表达和肿瘤杀伤能力的方法，所述方法包括敲除肿瘤细胞中slc1a4，并采用条件培养基培养cd8+t细胞，所述的条件培养基为tcm培养基。

26、本发明提供一种肿瘤免疫治疗组合物，所述的组合物包含slc1a4抑制剂和免疫检查点抑制剂。

27、进一步地，所述的免疫检查点抑制剂为pd-1抗体抑制剂、pd-l1抗体抑制剂或ctla-4抑制剂，优选为pd-1抗体抑制剂，所述pd-1抗体抑制剂为抗pd-1单克隆抗体。

28、所述的免疫检查点抑制剂与slc1a4抑制剂的质量比为：1：10-100，优选为1：10-50，更优选为1：30-40。

29、所述的组合物还可以包含药学上可接受的载体或赋形剂。

30、所述肿瘤免疫治疗组合物中，slc1a4抑制剂联合pd-1抗体能够有效克服pd-1抗体耐药，显著增强免疫检查点抑制剂的抗肿瘤疗效。

31、所述的slc1a4抑制剂为靶向slc1a4的小分子抑制剂、小干扰rna（sirna）、短发夹rna（shrna）、反义寡核苷酸、单克隆抗体、双特异性抗体、纳米抗体、适配体、crispr/cas9基因编辑试剂中的一种或几种；优选地，所述的slc1a4抑制剂为靶向slc1a4的slc1a4 sirna。

32、本发明提供所述的肿瘤免疫治疗组合物在制备抗肿瘤药物，尤其是抗肝癌的药物中的应用。

33、本发明提供slc1a4抑制剂在制备肿瘤免疫治疗的增敏剂或增效剂中的应用。

34、进一步地，本发明提供slc1a4抑制剂在制备增强pd-1抑制剂治疗肝癌的增敏剂中的应用。

35、本发明提供slc1a4抑制剂联合pd-1抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。

36、所述slc1a4抑制剂和pd-1抗体的剂量比为1:10-100，优选为1:10-50。

37、进一步地，所述的slc1a4抑制剂为表1所述基因中的任意一种。

38、进一步地，以小鼠计，所述slc1a4抑制剂和pd-1抗体的剂量分别为：250-350μg/小鼠，6-10 μg sirna/小鼠，优选的剂量为300μg/小鼠，8μg sirna/小鼠。

39、所述肿瘤为对单独使用免疫检查点抑制剂治疗无响应或产生耐药或疗效较差的实体瘤。

40、所述的联合，是指在一定时间期限内给予至少一种剂量的slc1a4抑制剂和至少一种剂量的pd-1抗体。所述的时间期限可以是一个给药周期内，优选4周内，3周内，2周内，1周内，或24小时以内。

41、联合的给药方式选自同时给药、独立地配制并共给药或独立地配制并相继给药。

42、优选地，联合给药方式为同时或依次给予pd-1抗体和slc1a4抑制剂。

43、本发明提供slc1a4作为生物标志物在制备肝癌诊断产品中的应用。

44、所述的标志物是血清诊断标志物、血浆诊断标志物或组织细胞诊断标志物。

45、本发明提供检测slc1a4的试剂在制备免疫治疗疗效或筛选适用人群的产品中的应用。

46、所述的产品为试剂盒、芯片或核酸膜条。

47、进一步地，本发明提供slc1a4作为生物标志物在制备预测免疫检查点抑制剂疗效或筛选适用人群的检测试剂盒中的应用。

48、本发明提供一种纳米递送系统，包含靶向slc1a4的sirna和药学上可接受的载体，所述的纳米递送系统可以为脂质纳米粒、聚合物纳米粒或无机纳米粒。所述的纳米递送系统能够将sirna递送至肝肿瘤组织。

49、本发明人首先通过tcga数据库及组织芯片分析发现，slc1a4在肝癌组织中显著高表达，且其高表达与患者总生存期呈负相关。体外实验表明，敲除slc1a4对肝癌细胞的增殖、凋亡、迁移和克隆形成均无直接影响，说明slc1a4并非通过直接促进肿瘤细胞增殖来发挥促癌作用。然而，在多种小鼠肿瘤模型（原位肝癌、皮下肝癌、肺癌、结直肠癌）中，敲除肿瘤细胞slc1a4却能显著抑制肿瘤生长和转移，并减少肝损伤。这一抗肿瘤效果完全依赖于cd8+t细胞的存在。机制研究证实，肿瘤细胞通过slc1a4大量摄取微环境中的丝氨酸，导致肿瘤组织间隙液和血清中丝氨酸水平降低，从而“饿死”cd8+t细胞，抑制其增殖和效应功能；而敲除slc1a4则能解除这种营养劫持，恢复t细胞的pi3k/akt/mtorc1、mapk及nf-κb信号通路，重新激活抗肿瘤免疫。更为重要的是，本发明通过纳米颗粒递送靶向slc1a4的sirna，在肝癌原位模型中实现了显著的抗肿瘤效果。此外，本发明首次证实slc1a4 sirna与pd-1抗体抑制剂联合使用具有协同增效作用，能在pd-1抗体或其抗原结合片段单药无效的模型中进一步增强抗肿瘤疗效。这些结果验证了slc1a4作为药物靶点的可行性和巨大临床转化价值。

50、有益效果

51、与现有技术相比，本发明具有以下有益技术效果：

52、首次发现slc1a4作为免疫治疗的新靶点：本发明揭示了肿瘤细胞通过slc1a4劫持微环境丝氨酸、竞争性抑制t细胞的免疫逃逸新机制，为肿瘤免疫治疗提供了全新的干预靶点。

53、1.精确的作用机制和肿瘤选择性：slc1a4敲除只影响肿瘤微环境中的免疫应答，对肿瘤细胞本身增殖无直接影响，且对小鼠脾脏重量和体重无影响。slc1a4敲除能显著增加肿瘤微环境中cd45.2+免疫细胞、cd4+t细胞、cd8+t细胞和nk细胞的比例及绝对数量。功能上，cd4+t细胞和cd8+t细胞表达ifnγ、颗粒酶b及活化标志物dnam-1的水平大幅上升；nk细胞中ifnγ和颗粒酶b表达亦显著增加。slc1a4敲除后t细胞和nk细胞亚群中活化和细胞毒性通路显著富集，而抑制性通路下调，t细胞活化标志物表达上调，耗竭标志物表达下调。巨噬细胞和树突状细胞中促炎细胞因子产生通路也增强。这表明slc1a4的缺失全面重塑了肿瘤免疫微环境。且其效果完全依赖于cd8+ t细胞，机制清晰，证据确凿。

54、2.靶向递送系统的实现：通过纳米颗粒递送slc1a4 sirna可在肝癌原位模型中使肺转移灶从180个降至30个，最大肿瘤结节缩小一半以上，且无体重减轻等毒副作用，临床转化前景巨大。

55、3.slc1a4与免疫检查点抑制剂联合使用实现协同增效：基于slc1a4敲除可增强cd8+t细胞浸润和功能的机制，slc1a4抑制剂与pd-1抗体联用可协同逆转免疫耐药。

56、4.slc1a4可以作为生物标志物预测免疫治疗疗效：可以制备检测试剂盒用于检测slc1a4的表达水平进而预测肿瘤患者的预后及免疫治疗疗效。