一种基于超分子水凝胶递送工程化NK细胞抗肿瘤制剂的制备方法与应用

本申请涉及生物医药领域，更具体地说，它涉及一种基于超分子水凝胶递送工程化nk细胞抗肿瘤制剂的制备方法与应用。

背景技术：

1、基于自然杀伤（nk）细胞的免疫治疗是极具前景的肿瘤治疗手段，其无需预先致敏即可识别并杀伤肿瘤细胞。过继性nk细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中疗效显著，但在实体瘤中效果仍十分有限，其面临的核心问题包括肿瘤浸润能力差、体内滞留时间短、在免疫抑制肿瘤微环境（tme）中快速功能耗竭，这些因素共同导致其无法发挥强效且持久的抗肿瘤作用，极大限制其临床应用。

2、目前已探索多种增强nk细胞抗肿瘤活性的策略，包括基因工程、免疫检查点阻断、细胞因子预处理等。其中，基于细胞因子的调控，尤其是白介素15（il15），展现出巨大潜力。il15是调控nk细胞与cd8+t细胞稳态与活化的核心细胞因子，是增强细胞免疫治疗的理想选择。然而，il15血浆半衰期短，临床转化受限，需高频高剂量给药，易引发毛细血管渗漏综合征、细胞因子释放综合征等严重剂量限制性毒性。在此背景下，可注射水凝胶因其可作为治疗细胞与细胞因子的局部储库，实现缓释，显著提升局部滞留与生物利用度而备受关注。但目前仍存在关键局限：将细胞与细胞因子简单共包埋于水凝胶中，无法保证关键存活信号随细胞主动浸润进入恶劣肿瘤微环境时仍持续偶联，导致细胞浸润后易失活。

3、因此，开发一种能同时实现nk细胞长效滞留，原位持续活化，并能级联激活内源抗肿瘤免疫的新型生物杂化体系，具有重要临床价值与应用前景。

技术实现思路

1、本申请的发明目的在于提供一种能同时实现nk细胞长效滞留，原位持续活化，并能级联激活内源抗肿瘤免疫的新型生物杂化体系。

2、为了实现上述发明目的，本申请首先合成负载il15的微囊，然后将其作为功能性材料修饰于nk92细胞表面，最后将工程化nk92细胞包埋于由疏水改性羟丙基甲基纤维素（hpmc-c12）、聚乙二醇-聚乳酸（peg-pla）纳米粒与α-环糊精（α-cd）形成的可注射水凝胶中。本申请突破了传统细胞递送模式，成功构建了自我维持的局部免疫生态系统，为实体瘤治疗提供稳健且具有临床转化潜力的新策略。

3、具体地，本申请采用以下的技术方案：

4、第一方面，本申请提供一种基于超分子水凝胶递送工程化nk细胞抗肿瘤制剂，包括负载il15的微囊、经所述微囊表面修饰的nk92细胞、以及包埋所述修饰后nk92细胞的可注射超分子水凝胶；

5、所述负载il15的微囊以碳酸钙微球为模板，经pah/pss交替沉积多层膜后，再包覆pah/醛基化透明质酸层，去除碳酸钙内核后获得。

6、第二方面，本申请所述的基于超分子水凝胶递送工程化nk细胞抗肿瘤制剂的制备方法，包括以下步骤：

7、步骤1，制备负载il15的碳酸钙微球，通过层层自组装技术在所述微球表面交替沉积pah/pss，并包覆醛基化透明质酸，去除内核后得到负载il15的微囊；

8、步骤2，将所述负载il15的微囊与nk92细胞共孵育，使所述负载il15的微囊通过化学键结合于细胞表面，获得负载il15的微囊修饰的工程化nk92细胞；

9、步骤3，制备hpmcc12、pegpla纳米粒与α环糊精混合的可注射超分子水凝胶，将所述工程化nk92细胞包埋于水凝胶中，得到基于超分子水凝胶递送工程化nk细胞抗肿瘤制剂。

10、进一步地，所述步骤1包括：

11、将碳酸钠溶液加入氯化钙溶液中，室温剧烈搅拌反应，依次经离心，洗涤，干燥，得到碳酸钙微球；

12、取碳酸钙微球分散于缓冲液中，加入il15溶液混合，振荡孵育，得到负载il15的碳酸钙微球；

13、将透明质酸钠溶于去离子水，加入高碘酸钠溶液，室温避光搅拌反应，加入pbs缓冲液至完全溶解，获得沉淀，纯化，得到醛基化透明质酸；

14、取负载il15的碳酸钙微球，交替置于pah溶液与pss溶液中孵育，完成多个循环，随后依次置于pah溶液与醛基化透明质酸溶液中孵育，最后将微球与edta搅拌孵育去除碳酸钙核，离心收集负载il15的微囊。

15、进一步地，所述步骤2包括：

16、将nk92细胞重悬于无血清培养基，接种于12孔板，向细胞培养液中加入负载il15的碳酸钙微球（ma与细胞比例3:1），离心使负载il15的碳酸钙微球与细胞接触，共孵育完成后，将细胞悬液置于淋巴细胞分离液上，通过密度梯度离心纯化工程化细胞，洗涤后收集细胞。

17、进一步地，所述负载il15的碳酸钙微球与nk92细胞比例为3:1。

18、进一步地，所述步骤3包括：

19、将hpmc溶于n-甲基吡咯烷酮，加入十二烷基异氰酸酯，再加入n,n-二异丙基乙胺作为催化剂，反应液室温搅拌，所得溶液用丙酮沉淀，过滤收集疏水改性hpmc，室温真空干燥，得到白色无定形粉末hpmc-c12；

20、将peg-b-pla的n,n-二甲基甲酰胺溶液滴加入搅拌状态的超纯水中，得到pegpla纳米粒；

21、将hpmc-c12溶于pbs缓冲液配制成储备液，装入注射器内，向另一注射器中加入pegpla纳米粒储备液、α-cd储备液与工程化nk92细胞悬液；

22、将两所述注射器通过双通接头连接，反复推注混合，得到基于超分子水凝胶递送工程化nk细胞抗肿瘤制剂。

23、第三方面，本申请提供所述的基于超分子水凝胶递送工程化nk细胞抗肿瘤制剂在制备治疗实体瘤药物中的应用。

24、进一步地，所述实体瘤为乳腺癌。

25、第四方面，本申请提供一种药物组合物，包括所述的基于超分子水凝胶递送工程化nk细胞抗肿瘤制剂。

26、第五方面，本申请提供所述的药物组合物在制备治疗实体瘤药物中的应用。

27、综上所述，本申请具有以下有益效果：

28、本申请成功构建将ma搭载nk92细胞与可注射超分子水凝胶协同整合的活体生物杂化平台，为实体瘤局部免疫治疗提供稳健且可转化的新策略。该平台同时解决nk细胞疗法对抗实体瘤的经典难题——确保持久肿瘤驻留与在免疫抑制肿瘤微环境中维持功能持久。超分子水凝胶作为动态保护性微环境，实现nk92细胞长效局部滞留与可控释放。更关键的是，负载il15的ma作为细胞因子储库，为nk92细胞提供持久原位活化信号，实现强效肿瘤杀伤。本申请核心发现是该平台可启动自我传播的免疫级联反应：搭载于浸润nk92细胞的ma将il15递送至肿瘤内部，有效激活休眠的细胞毒性cd8+t细胞，该结果在人乳腺癌离体模型中得到验证。本申请突破传统细胞递送理念，在肿瘤部位构建局部、自我维持的免疫调节生态系统，为对抗实体瘤提供强效新手段。

1.一种基于超分子水凝胶递送工程化nk细胞抗肿瘤制剂，其特征在于，包括负载il15的微囊、经所述微囊表面修饰的nk92细胞、以及包埋所述修饰后nk92细胞的可注射超分子水凝胶；

2.权利要求1所述的基于超分子水凝胶递送工程化nk细胞抗肿瘤制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1包括：

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2包括：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述负载il15的碳酸钙微球与nk92细胞比例为3:1。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3包括：

7.权利要求1所述的基于超分子水凝胶递送工程化nk细胞抗肿瘤制剂在制备治疗实体瘤药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述实体瘤为乳腺癌。

9.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的基于超分子水凝胶递送工程化nk细胞抗肿瘤制剂。

10.权利要求9所述的药物组合物在制备治疗实体瘤药物中的应用。