工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗及其制备方法和应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗及其制备方法和应用。

背景技术：

1、结直肠癌是全球发病率和死亡率均居前列的恶性肿瘤之一，近年来呈现发病年龄年轻化的趋势，严重威胁人类健康。化疗具有疗效确切、适用范围广及治疗成本相对较低等优点，仍是目前肿瘤临床治疗的重要手段。然而，化疗药物普遍存在毒副作用大、易产生耐药性及治疗效果有限等问题，严重影响患者预后。近年来研究发现，部分化疗药物如奥沙利铂、紫杉醇、5-氟尿嘧啶和阿霉素等能够诱导肿瘤细胞发生免疫源性细胞死亡（immunogenic cell death，icd）。icd过程中，肿瘤细胞释放atp、核苷酸等“找到我（fineme）”信号，并暴露钙网蛋白（calreticulin，crt）、释放高迁移率族蛋白b1（high mobilitygroup box 1，hmgb1）及膜联蛋白a1（annexin a1，anxa1）等“吃我（eat me）”信号，从而促进抗原呈递细胞（antigen presenting cells，apc）识别、吞噬肿瘤细胞并呈递肿瘤抗原，激活机体抗肿瘤免疫应答。因此，增强icd已成为提高化疗免疫治疗效果的重要研究方向。

2、然而，在实际临床应用中，化疗诱导icd并未充分发挥其免疫治疗潜力。研究表明，siglec家族受体广泛表达于树突状细胞、巨噬细胞等apc细胞表面，能够特异性识别细胞表面的唾液酸残基。多数肿瘤细胞存在异常高水平的唾液酸化修饰，可通过唾液酸-siglec免疫轴介导免疫抑制和免疫逃逸。即使化疗药物诱导肿瘤细胞发生icd，由于肿瘤细胞及其暴露的icd相关“吃我”信号蛋白仍保持较高的唾液酸化水平，可持续向apc传递 “别吃我（don't eat me）”信号，削弱抗原吞噬与呈递效率，从而限制化疗诱导抗肿瘤免疫应答的发挥。

3、唾液酸酶能够特异性水解细胞表面的唾液酸残基，降低肿瘤细胞唾液酸化水平，阻断唾液酸-siglec免疫抑制信号，因此具有增强肿瘤免疫治疗效果的潜力。然而，唾液酸作为蛋白质类生物大分子，存在稳定性较差、体内易失活、递送效率低以及难以实现肿瘤组织特异性富集等问题，其制备及递送仍是限制其临床应用的重要因素。因此，开发一种能够高效递送唾液酸酶并与化疗药物协同发挥抗肿瘤作用的递送体系，成为本领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术中化疗诱导免疫原性细胞死亡难以充分发挥抗肿瘤免疫作用以及生物活性蛋白递送效率低等技术问题，提供一种能够增强化疗诱导抗肿瘤免疫应答、提高肿瘤免疫治疗效果的技术方案。

2、为实现上述目的，本发明第一方面提供一种工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗，所述肿瘤疫苗为表达唾液酸酶的工程化具核梭杆菌（

fusobacterium nucleatum，fn）分泌的膜囊泡，并进一步包封一种或几种化疗药物。

3、在所述工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗中，所述细菌膜囊泡肿瘤疫苗由工程化fn产生的膜囊泡载药后获得，制备过程包括以下步骤：

4、使用标准转染程序将表达唾液酸酶的表达质粒载体转染fn，得到表达唾液酸酶的工程化fn菌株；

5、厌氧发酵培养所述工程化fn菌株，获得发酵液；

6、去除发酵液中的菌体，过滤上清液，经超速离心及洗涤后获得工程化fn膜囊泡；

7、将所述工程化fn膜囊泡与化疗药物溶液混合共振荡，并经透析除去未包封药物，获得载药工程化fn膜囊泡，即工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗。

8、优选地，所述转染程序为电转化、化学转化或其他常规质粒转染方法；

9、优选地，所述厌氧发酵培养时间为12-72 h，培养基为硫乙醇酸盐流体培养基，培养温度为37℃；

10、优选地，所述过滤采用孔径为200-500 nm的滤膜；

11、优选地，所述超速离心条件为离心力250,000-500,000 g，离心时间30-180 min，温度4-25℃。

12、优选地，所述化疗药物溶液的溶剂为水、葡萄糖溶液、氯化钠溶液、磷酸盐缓冲液、乙醇、二甲基亚砜中的一种或几种；

13、优选地，所述共振荡频率为0-100 hz。

14、在所述工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗中，所述fn膜囊泡为从fn发酵液提取得到的具有单层或双层磷脂膜结构、含有膜蛋白及部分胞内蛋白、粒径小于500 nm的囊泡结构，或也称为膜囊泡、外膜囊泡、胞外囊泡。

15、在所述工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗中，所述唾液酸酶能够特异性水解肿瘤细胞或肿瘤组织中与唾液酸相连的糖苷键。

16、优选地，所述唾液酸酶为neu1、neu2、neu3或neu4。

17、更优先地，所述唾液酸酶为neu2。

18、在所述工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗中，所述化疗药物为能够诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡的化疗药物。

19、优选地，所述化疗药物为5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、紫杉醇或阿霉素。

20、在所述工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗中，所述表达质粒载体为能够在fn中稳定表达目的基因的小型环状dna质粒。

21、优选地，所述目的基因表达通过免疫印迹分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚合酶链式反应、琼脂糖凝胶电泳或其他常规检测蛋白或基因检测方法进行检测。

22、在所述工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗中，所述肿瘤包括结肠癌、直肠癌、胃癌、胰腺癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤及其他实体肿瘤。

23、本发明的第二发明提供一种工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗的制备方法，包括如下步骤：

24、构建表达唾液酸酶的工程化fn菌株；

25、培养所述工程化fn菌株并分离获得膜囊泡；

26、将所述膜囊泡与化疗药物混合并包封，获得工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗。

27、本发明第三方面提供上述的工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗和上述的制备方法制得的工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗在制备用于抑制肿瘤细胞活性、抑制肿瘤生长或治疗肿瘤的药物中的用途。

28、通过上述技术方案，本发明至少具备以下有益效果：

29、1、本发明提供的工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗能够有效降低肿瘤组织或肿瘤细胞表面的唾液酸化水平，阻断唾液酸-siglec免疫抑制信号，提高肿瘤细胞的免疫识别能力；

30、2、本发明提供的工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗能够增强化疗药物诱导的免疫原性细胞死亡效应，促进肿瘤抗原呈递，提高cd8+ t细胞等免疫效应细胞对肿瘤组织的浸润，增强抗肿瘤免疫应答；

31、3、本发明提供的工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗能够实现唾液酸酶与化疗药物的协同递送，提高化疗药物的抗肿瘤治疗效果，增强肿瘤细胞杀伤能力，抑制肿瘤生长，并有助于延长肿瘤模型动物的生存时间。

1.一种工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗，其特征在于，所述肿瘤疫苗为表达唾液酸酶的工程化具核梭杆菌（fn）分泌的膜囊泡，并进一步包封一种或几种化疗药物。

2.根据权利要求1所述的工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗，其特征在于，所述细菌膜囊泡肿瘤疫苗由工程化fn产生的膜囊泡载药后获得，制备过程包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗，其特征在于，所述fn膜囊泡为从fn发酵液提取得到的具有单层或双层磷脂膜结构、含有膜蛋白及部分胞内蛋白、粒径小于500 nm的囊泡结构，或也称为膜囊泡、外膜囊泡、胞外囊泡。

4.根据权利要求1或2所述的工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗，其特征在于，所述唾液酸酶能够特异性水解肿瘤细胞或肿瘤组织中与唾液酸相连的糖苷键；

5.根据权利要求1或2所述的工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗，其特征在于，所述化疗药物为能够诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡的化疗药物；

6.根据权利要求1或2所述的工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗，其特征在于，所述表达质粒载体为能够在fn中稳定表达目的基因的小型环状dna质粒；

7.一种工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗的制备方法，基于上述权利要求1-6任一项所述的工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗制备方法所制备的工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗，其特征在于，包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗，其特征在于，所述肿瘤包括结肠癌、直肠癌、胃癌、胰腺、黑色素瘤、胶质母细胞瘤及其他实体肿瘤。

9.根据权利要求7所述的工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗和根据权利要求8所述的制备方法制得的工程化细菌膜囊泡肿瘤疫苗在制备用于抑制肿瘤细胞活性、抑制肿瘤生长或治疗肿瘤的药物中的用途。