一种乳铁蛋白纳米颗粒及其制备方法与应用

本发明属于生物药物，具体涉及一种乳铁蛋白纳米颗粒及其制备方法与应用。

背景技术：

1、急性心肌梗死的特点是心脏供血突然减少，尽管诊断和治疗已取得实质性进展，但其仍然是全球死亡的主要原因。持续缺血将引起心肌结构与功能发生不可逆的进行性改变，其核心损害形式为心肌细胞死亡。及时恢复冠状动脉血流是减轻缺血损伤和限制梗死范围的最有效策略，然而再灌注过程本身亦可引起心肌严重功能障碍与结构破坏，该现象被称为心肌缺血再灌注损伤（miri）。由于成年哺乳动物心肌细胞再生能力极为有限，在急性心肌细胞死亡事件（如miri）中常观察到显著的心室纤维化重构。此类进行性纤维化改变可破坏心肌的正常组织结构，进而损害心脏的机械收缩、舒张功能及电传导系统，最终导致致命性心力衰竭和恶性心律失常。目前用于干预miri的药物，如抗氧化剂（例如维生素c和n-乙酰半胱氨酸）和抗纤维化疗法（例如tgf-β抑制剂和β受体阻滞剂）整体疗效有限，难以阻止病情持续发展，且长期治疗会增加肝毒性风险。因此，迫切需要开发同时抑制心肌细胞死亡和调节异常纤维化修复的新策略，以有效治疗miri。

2、越来越多的证据表明，铁依赖性脂质过氧化(lpo)介导的细胞死亡（称为铁死亡）是miri的主要原因。心脏作为高代谢器官，富含大量线粒体以满足其能量需求。线粒体在铁代谢中发挥着核心作用，并且是活性氧（ros）产生的主要场所。这两个关键过程在miri病理学中驱动铁死亡。缺血-缺氧应激破坏心肌细胞铁稳态，线粒体处理与储存铁的能力下降，导致游离fe2+异常积累。这些过量的fe2+通过芬顿反应催化脂质过氧化，产生大量的脂质ros和羟基自由基(•oh)，直接损伤细胞并诱导氧化应激，最终引发心肌细胞铁死亡。这种氧化损伤同时抑制gsh/gpx4抗氧化轴，促进脂质过氧化物积累。再灌注期间突然的氧气供应诱发线粒体反向电子传递导致大量线粒体活性氧（mtros）产生，加剧了这种损伤，形成铁失调、氧化应激和抗氧化衰竭的恶性循环。因此，针对铁死亡和氧化应激为改善miri提供了重要的心脏保护策略。

3、针对这些机制，目前研究人员设计了小分子铁螯合剂来结合细胞内的游离铁并阻止芬顿反应驱动的ros产生。右雷佐生(dxz)和铁他汀-1(fer-1)等化合物在预处理后可以通过减轻心肌铁超载核氧化应激改善心脏功能。尽管前景广阔，但这些传统螯合剂面临相当大的局限性：半衰期短、组织渗透不足、金属离子稳态破坏和系统性毒性风险等。这些缺点凸显了对具有优化递送和安全性的新型药物的需求。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术存在的至少一种问题，本发明的目的之一在于提供一种乳铁蛋白纳米颗粒。本发明的目的之二在于提供上述乳铁蛋白纳米颗粒的制备方法。本发明的目的之三在于提供一种药物组合物。本发明的目的之四在于提供上述乳铁蛋白纳米颗粒或药物组合物的应用。本发明的目的之五在于提供上述乳铁蛋白纳米颗粒或药物组合物的应用。

2、乳铁蛋白(lactoferrin,ltf)是一种铁结合糖蛋白，具有比常规铁螯合剂更高的铁亲和力、更高的特异性和更少的副作用。有证据证实，ltf下调会促进铁死亡，而外源补充则会抑制这一过程。尽管具有这些特性，但ltf的治疗潜力受到半衰期短、组织渗透不足、生物利用度低和要求较高的储存/运输条件的限制。纳米技术促进了多种基于纳米颗粒的蛋白质递送系统，包括脂质基纳米系统、聚合物基纳米系统以及纳米酶等。然而，心脏药物输送的功效受到剪切应力的阻碍，导致生物利用度差、治疗效果有限和潜在的全身毒性。因此，增强纳米药物在高流量心脏环境中的保留和富集至关重要。虽然心肌内注射等侵入性方法可以实现精确输送，但它们存在组织损伤和感染的风险。值得注意的是，单宁酸(ta)对心脏细胞外基质成分（例如弹性蛋白、胶原蛋白）表现出高亲和力。ta修饰显著增强了心脏病变处的蛋白质积累。其丰富的酚羟基使蛋白质能够结合并赋予强大的抗氧化活性，保护蛋白质免受氧化损伤。此外，ta修饰的蛋白可以通过与线粒体外膜蛋白结合选择性地清除mtros，恢复线粒体的完整性和功能。利用这一点，本发明通过一锅法合成构建了单宁化乳铁蛋白纳米颗粒(ptl)。ptl在缺血心肌中有效积累，被心肌细胞内化，并通过质子海绵效应逃逸内体。至关重要的是，ptl可以螯合细胞内铁，抑制脂质过氧化，特异性清除mtros，并恢复线粒体功能，从而通过打破铁超载-氧化应激的恶性循环抑制线粒体驱动的铁死亡。

3、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

4、本发明第一方面提供了一种乳铁蛋白纳米颗粒，包括如下制备原料：单宁酸(ta)、聚乙二醇(peg)和乳铁蛋白(ltf)。

5、优选地，所述单宁酸与聚乙二醇的质量比为1：(0.5-2)。

6、更优选地，所述单宁酸与聚乙二醇的质量比为1：0.5、1：0.6、1：0.7、1：0.8、1：0.9、1：1.0、1：1.1、1：1.2、1：1.3、1：1.4、1：1.5、1：1.6、1：1.7、1：1.8、1：1.9、1：2.0中的任一值或任意两值形成的范围。

7、优选地，所述单宁酸与乳铁蛋白的质量比为1：(0.5-2)。

8、更优选地，所述单宁酸与乳铁蛋白的质量比为1：0.5、1：0.6、1：0.7、1：0.8、1：0.9、1：1.0、1：1.1、1：1.2、1：1.3、1：1.4、1：1.5、1：1.6、1：1.7、1：1.8、1：1.9、1：2.0中的任一值或任意两值形成的范围。

9、优选地，所述乳铁蛋白纳米颗粒的形态为球形、立方体、圆锥形、圆柱形、棱柱形、棱锥形、或其它规则或不规则的形状。

10、更优选地，所述乳铁蛋白纳米颗粒的形态为球形，所述乳铁蛋白纳米颗粒的粒径为10-500 nm。

11、进一步优选地，所述乳铁蛋白纳米颗粒的粒径为50、100、150、200、250、300、350、400、450、500nm中的任一值或任意两值形成的范围。

12、本发明第二方面提供了第一方面所述的乳铁蛋白纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

13、将单宁酸、聚乙二醇和乳铁蛋白在水中进行混合，进行自组装，制得所述乳铁蛋白纳米颗粒。

14、优选地，具体包括如下步骤：依次将聚乙二醇水溶液、乳铁蛋白水溶液和单宁酸水溶液进行混合，进行自组装，制得所述乳铁蛋白纳米颗粒。

15、更优选地，所述聚乙二醇水溶液中的聚乙二醇的浓度为1-100 mg/ml。

16、进一步优选地，所述聚乙二醇水溶液中的聚乙二醇的浓度为1-20 mg/ml。

17、更优选地，所述乳铁蛋白水溶液中的乳铁蛋白的浓度为1-100 mg/ml。

18、进一步优选地，所述乳铁蛋白水溶液中的乳铁蛋白的浓度为1-20 mg/ml。

19、更优选地，所述单宁酸水溶液中的单宁酸的浓度为1-100 mg/ml。

20、进一步优选地，所述单宁酸水溶液中的单宁酸的浓度为1-20 mg/ml。

21、更选地，所述聚乙二醇水溶液与乳铁蛋白水溶液的体积比为1：(0.5-2)。

22、进一步优选地，所述聚乙二醇水溶液与乳铁蛋白水溶液的体积比为1：0.5、1：0.6、1：0.7、1：0.8、1：0.9、1：1.0、1：1.1、1：1.2、1：1.3、1：1.4、1：1.5、1：1.6、1：1.7、1：1.8、1：1.9、1：2.0中的任一值或任意两值形成的范围。

23、更优选地，所述聚乙二醇水溶液与单宁酸水溶液的体积比为1：(0.5-2)。

24、进一步优选地，所述聚乙二醇水溶液与单宁酸水溶液的体积比为1：0.5、1：0.6、1：0.7、1：0.8、1：0.9、1：1.0、1：1.1、1：1.2、1：1.3、1：1.4、1：1.5、1：1.6、1：1.7、1：1.8、1：1.9、1：2.0中的任一值或任意两值形成的范围。

25、更优选地，还包括如下步骤：混合后再加水定量，定量后的混合溶液中聚乙二醇、乳铁蛋白、单宁酸的浓度分别独立地为0.1-1 mg/ml。

26、优选地，所述自组装在搅拌条件下进行。

27、优选地，所述自组装在15-40℃下进行。

28、更优选地，在23-26℃下进行。

29、本发明第三方面提供了一种药物组合物，包括第一方面所述的乳铁蛋白纳米颗粒。

30、优选地，还包括一种或多种药学上可接受的辅料。

31、更优选地，所述药学上可接受的辅料是指药学领域常规的药物载体，包括填充剂、粘合剂、崩解剂、增溶剂、助悬剂、润湿剂、色素、香精、溶剂、表面活性剂或矫味剂中的至少一种。

32、可作为药学上可接受辅料的物质包括，但并不限于，离子交换剂；铝；硬脂酸铝；卵磷脂；血清蛋白，如人血清蛋白；缓冲物质如磷酸盐；甘氨酸；山梨酸；山梨酸钾；饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物；水；盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐；胶体硅；三硅酸镁；聚乙烯吡咯烷酮；聚丙烯酸脂；蜡；聚乙烯-聚氧丙烯-阻断聚合体；羊毛脂；糖，如乳糖，葡萄糖和蔗糖；淀粉如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素和它的衍生物如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和乙酸纤维素；树胶粉；麦芽；明胶；滑石粉；辅料如可可豆脂和栓剂蜡状物；油如花生油，棉子油，红花油，麻油，橄榄油，玉米油和豆油；二醇类化合物，如丙二醇和聚乙二醇；酯类如乙基油酸酯和乙基月桂酸酯；琼脂；缓冲剂如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等渗盐；林格(氏)溶液；乙醇；磷酸缓冲溶液；和其他无毒的合适的润滑剂如月桂硫酸钠和硬脂酸镁；着色剂；释放剂；防腐剂和抗氧化剂。

33、优选地，所述组合物的剂型包括口服制剂、注射给药剂、呼吸道给药剂、皮肤给药剂中的任意一种。

34、更优选地，口服制剂的剂型包括颗粒剂、片剂、粉剂、胶囊剂、口服溶液剂、口服混悬剂、干混悬剂、口服乳剂、胶浆剂、口服液、乳液、 乳剂、胶体溶液、合剂、酊剂、滴剂、混悬滴剂、糖浆剂、缓释片、缓释包衣片、控释片、缓释胶囊、控释胶囊。

35、更优选地，所述注射制剂的剂型包括注射剂、注射液、注射用溶液剂、静脉滴注用注射液、注射用混悬液、注射用无菌粉末、静脉注射针剂、注射用乳剂、乳状注射液、粉针剂、针剂、无菌粉针、冻干粉针、注射用浓溶液。

36、本发明第四方面提供了第一方面所述的乳铁蛋白纳米颗粒或第三方面所述的药物组合物在制备治疗心肌受损疾病的药物中的应用。

37、优选地，所述药物用于治疗心肌缺血再灌注损伤。

38、本发明第五方面提供了第一方面所述的乳铁蛋白纳米颗粒或第三方面所述的药物组合物在制备抑制细胞铁死亡的靶向药物中的应用。

39、优选地，所述乳铁蛋白纳米颗粒或药物组合物在制备心肌细胞铁死亡相关疾病治疗药物中的应用。

40、更优选地，所述心肌细胞铁死亡相关疾病包括心肌缺血再灌注损伤、药物性心力衰竭、败血症性心肌病。

41、本发明的有益效果是：

42、本发明提供了一种乳铁蛋白纳米颗粒，采用单宁酸、聚乙二醇和乳铁蛋白自组装形成单宁化乳铁蛋白纳米颗粒；其中多酚ta与乳铁蛋白之间形成的多重非共价交联网络，极大地增强了纳米颗粒的结构完整性，使其能够有效抵御血液稀释和蛋白吸附，延长体内循环时间；利用ta与乳铁蛋白的π-π堆叠作用，以及自组装过程对蛋白质药物的高效捕获，可实现高效载药；并且，ta组分本身具有强大的抗氧化活性，与装载的乳铁蛋白药物可产生显著的协同增效作用，共同实现高效的治疗效果。

43、进一步说明，在这一纳米颗粒体系中，聚乙二醇（peg）并非惰性载体，而是通过与蛋白及单宁酸的协同作用，成为维持纳米颗粒稳定性与功能性的关键枢纽。首先，peg分子链中的醚键氧原子可作为强氢键受体，与ta的酚羟基形成比蛋白质-ta复合物更稳定的氢键网络。这种竞争性结合不仅能够精细调控ta与乳铁蛋白之间的交联密度，防止过度聚集导致颗粒失稳，还能在生理环境下形成动态的“保护性外壳”，有效屏蔽蛋白表面的非特异性吸附位点，从而显著抵抗血液稀释和蛋白冠形成，延长体内循环时间。此外，在该自组装过程中，peg还发挥着关键的“分子拥挤”调控作用。其长链结构产生的排阻体积效应，可有效提高局部体系中乳铁蛋白与单宁酸的有效碰撞频率，并弱化二者表面的水化层，降低自组装成核的能垒；同时，peg通过空间位阻有效抑制新生颗粒间的无序聚集，引导更多前体物质向目标纳米结构转化。这种动力学与热力学的双重协同，使得纳米颗粒的合成产率得到显著提升，为后续工业化生产提供了有力保障。

44、本发明的乳铁蛋白纳米颗粒可用于治疗心肌受损疾病，通过与线粒体外膜蛋白亲和的方式实验线粒体靶向，不依赖线粒体膜电位，还可进一步清除线粒体活性氧(mtros)，减轻氧化应激和铁累积，阻断线粒体损伤-铁死亡的恶性循环，最终减少心肌细胞死亡，并恢复线粒体功能，促进心肌修复。