包含核酸类免疫刺激分子的脂质纳米颗粒及其制备方法和用途与流程

本发明属于生物医药，涉及疫苗佐剂制备技术，具体涉及包含核酸类免疫刺激分子的脂质纳米颗粒及其制备方法和用途。

背景技术：

1、随着疫苗技术、特别是生物技术的发展，疫苗抗原纯度越来越高，更加安全，但其免疫原性也越来越弱，所以佐剂就更加重要。佐剂可以非特异性增强抗原的免疫应答，改变免疫应答类型。疟疾、艾滋病、肺炎和肿瘤疫苗的开发对佐剂的要求增高，不仅需要佐剂诱导体液免疫应答，而且需要较强的细胞免疫应答，而新的佐剂开发越来越困难。进入2010年后，批准的大规模使用的佐剂只有as01b，但也面临原材料获取难，安全性等诸多问题。因此，本领域对开发新型安全有效的佐剂的需求仍然迫在眉睫。

2、mrna新冠疫苗的成功上市，使得脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles，lnp）已当之无愧地成为安全、有效递送mrna进入靶细胞的首选载体。lnp能够高效包封并保护mrna等核酸分子，避免其被体内核酸酶降解，同时可有效介导核酸分子进入靶细胞，实现目的蛋白质的瞬时、高效表达。lnp成功应用于covid-19 mrna疫苗中，多种mrna-lnp疫苗已在临床试验阶段，充分证明了lnp递送可靠的技术基础。

3、核酸类免疫刺激分子主要包括三种：1、cpg odn（cpg寡脱氧核苷酸），为tlr9激动剂，激活tlr9，诱导th1型免疫应答；2、dsdna（双链dna），病毒、细菌或人工合成的dsdna，激活cgas-sting通路，诱导i型干扰，增强免疫应答；3、dsrna（双链rna），如poly(i:c)（聚肌胞苷酸），为tlr3激动剂，诱导体液和细胞免疫应答。核酸类免疫刺激分子单独使用时免疫效果弱，原因在于体内易降解，难以递送到细胞内等缺点。核酸类免疫刺激分子仅能激活先天免疫，但无法针对特定的蛋白产生抗体，因此本身无法作为治疗剂或预防剂使用，必须与特定的抗原配合使用，以增强抗原的免疫应答。

4、目前，人们已经注意到可以将核酸类免疫刺激分子负载于lnp以制备疫苗佐剂，但仍然存在递送效率不高、同时增强体液免疫应答和细胞免疫应答的效果不佳等问题。因此，仍亟需开发能够高效包封并递送核酸类免疫刺激分子以获得显著增强的体液免疫应答和细胞免疫应答的lnp类疫苗佐剂。

技术实现思路

1、为解决现有技术中所存在的上述问题，发明人深入研究了脂质纳米颗粒各组分与核酸类免疫刺激分子的匹配性，寻求能够最大程度地发挥核酸类免疫刺激分子的免疫增强作用的脂质纳米颗粒递送系统。基于此，本发明通过设计含有特定组分的脂质纳米颗粒，将核酸类免疫刺激分子（例如，cpg odn、poly(i:c)）包裹在该脂质纳米颗粒中，不仅有效避免了核酸类免疫刺激分子被体内的核酸酶降解，促进了核酸类免疫刺激分子进入细胞内，还能够最大程度地增强免疫刺激作用，从而获得优异的体液免疫应答和细胞免疫应答效果。本发明的包含核酸类免疫刺激分子的脂质纳米颗粒对于重组蛋白疫苗具有特别优异的免疫增强作用，适合用作重组蛋白疫苗佐剂。

2、具体而言，本发明提供了：

3、（1） 一种包含核酸类免疫刺激分子的脂质纳米颗粒，其包括以下组分：

4、核酸类免疫刺激分子；

5、可离子化脂质化合物，其结构如下所示：

6、

7、磷脂；

8、结构性脂质；和

9、聚乙二醇化脂质。

10、（2） 根据（1）所述的脂质纳米颗粒，其中所述核酸类免疫刺激分子选自cpg寡脱氧核苷酸和双链rna。

11、（3） 根据（2）所述的脂质纳米颗粒，其中所述cpg寡脱氧核苷酸的序列为5’-tgactgtgaacgttcgagatga-3’。

12、（4） 根据（2）所述的脂质纳米颗粒，其中所述双链rna为聚肌胞苷酸。

13、（5） 根据（1）所述的脂质纳米颗粒，其中所述磷脂选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（dspc）、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-甘油（dspg）、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸（dopa）、1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（smpc）、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（dopc）、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（dope）以及它们的混合物；优选地，所述磷脂为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（dspc）。

14、（6） 根据（1）所述的脂质纳米颗粒，其中所述结构性脂质选自胆固醇、谷固醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇以及它们的混合物；优选地，所述结构性脂质为胆固醇。

15、（7） 根据（1）所述的脂质纳米颗粒，其中所述可离子化脂质化合物与所述磷脂、所述结构性脂质和所述聚乙二醇化脂质的摩尔比为(40-65):(5-17.5):(35-55):(1.0-2.0)，优选为48.5:10:40:1.5。

16、（8） 根据（1）所述的脂质纳米颗粒，其中所述可离子化脂质化合物与核酸类免疫刺激分子的氮/磷为2:1至12:1，优选为5:1。

17、（9） 根据（1）所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒的粒径为70 nm至100nm，并且所述脂质纳米颗粒的多分散系数为0.15以下。

18、（10） 一种制备根据（1）-（9）中任一项所述的包含核酸类免疫刺激分子的脂质纳米颗粒的方法，包括以下步骤：

19、（a）配制含有核酸类免疫刺激分子的水相溶液：

20、（b）配制含有可离子化脂质化合物、磷脂、结构性脂质和聚乙二醇化脂质的有机相溶液；以及

21、（c）使用微流控装置将所述水相溶液和所述有机相溶液混合，从而获得包含核酸类免疫刺激分子的脂质纳米颗粒的溶液。

22、（11） 根据（10）所述的方法，其中在步骤（c）中，将所述微流控装置设置为使所述有机相溶液与所述水相溶液的流速比例为1:3至1:5，以进行所述混合。

23、（12） 根据（10）所述的方法，还包括在步骤（c）之后，对所述包含核酸类免疫刺激分子的脂质纳米颗粒的溶液进行超滤的步骤。

24、（13） 根据（10）所述的方法，其中所述核酸类免疫刺激分子的包封率为95%以上。

25、（14） 根据（1）-（9）中任一项所述的包含核酸类免疫刺激分子的脂质纳米颗粒在制备疫苗佐剂中的用途。

26、（15） 根据（14）所述的用途，其中所述疫苗佐剂增强重组蛋白疫苗抗原的体液免疫应答和细胞免疫应答。

27、（16） 根据（15）所述的用途，其中所述重组蛋白疫苗抗原选自重组带状疱疹病毒蛋白和乙型肝炎表面抗原。

28、（17） 一种疫苗组合物，其包含：

29、根据（1）-（9）中任一项所述的包含核酸类免疫刺激分子的脂质纳米颗粒；以及

30、重组蛋白疫苗抗原。

31、（18） 根据（17）所述的疫苗组合物，其中所述重组蛋白疫苗抗原选自重组带状疱疹病毒蛋白和乙型肝炎表面抗原。

32、本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

33、通过对脂质纳米颗粒类疫苗佐剂的深入研究，发明人发现了一种具有特定组成的包含核酸类免疫刺激分子的脂质纳米颗粒，当将其用作重组蛋白疫苗佐剂时，能够显著提高重组蛋白疫苗抗原的体液免疫应答和细胞免疫应答；这种包含核酸类免疫刺激分子的脂质纳米颗粒包含具有特定结构的可离子化脂质化合物bm028，并且包含磷脂（例如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱）、结构性脂质（例如胆固醇）和聚乙二醇化脂质，其中bm028与磷脂、结构性脂质和聚乙二醇化脂质的摩尔比为(40-65):(5-17.5):(35-55):(1.0-2.0)。

34、更具体地，本发明的包含核酸类免疫刺激分子的脂质纳米颗粒具有以下优点：

35、1. 可离子化脂质化合物bm028在酸性条件下带正电，可有效地静电结合带负电的核酸类免疫刺激分子，并在特定的磷脂、结构性脂质、聚乙二醇化脂质的共同作用下形成稳定且尺寸均一的包含核酸类免疫刺激分子的脂质纳米颗粒，粒径为70 nm至100 nm，多分散系数为0.15以下，从而将核酸类免疫刺激分子包裹在脂质纳米颗粒内，避免核酸类免疫刺激分子过早降解而难以递送到细胞内，并可显著减少核酸类免疫刺激分子的用量。

36、2. 特别是作为重组蛋白疫苗佐剂使用时，出乎意料地发现本发明的具有上述特定组成的包含核酸类免疫刺激分子的脂质纳米颗粒能够显著提升核酸类免疫刺激分子的免疫增强效果，诱导均衡的体液和细胞免疫应答，特别适合用作重组蛋白疫苗抗原（例如，重组带状疱疹病毒、乙型肝炎表面抗原）的佐剂，与对照佐剂铝佐剂相比，使用本发明的疫苗佐剂在增强重组蛋白疫苗的体液、细胞免疫应答均有明显的提升，当与重组带状疱疹病毒蛋白ge联合使用时，本发明的疫苗佐剂的抗体滴度可高达使用铝佐剂时的11.31倍，并且ge特异性cd4+ t细胞占比为使用铝佐剂时的4.47倍；当与乙型肝炎表面抗原（hbsag）联合使用时，本发明的疫苗佐剂的抗体滴度可高达使用铝佐剂时的97.71倍，并且hbsag特异性cd4+ t细胞占比为使用铝佐剂时的3.15倍，hbsag特异性cd8+ t细胞占比为使用铝佐剂时的5.79倍。

37、3. 本发明的包含核酸类免疫刺激分子的脂质纳米颗粒制备简便，易于操作，适合在疫苗生产中实现规模化应用。