一种牛疱疹病毒1型mRNA疫苗的制备方法及其应用与流程

本发明属于疫苗，具体涉及一种牛疱疹病毒1型（bovine herpesvirustype 1, bohv-1）mrna疫苗的制备方法及其应用。

背景技术：

1、mrna疫苗是一类新型核酸疫苗技术，其通过递送编码目标抗原的mrna，使宿主细胞在体内表达抗原蛋白，从而诱导特异性免疫应答。与传统疫苗相比，mrna疫苗具有设计周期短、生产工艺相对标准化、无需培养活病毒、可模块化替换抗原序列以及易于联合编码免疫调节分子等优势。mrna疫苗的成功研发与应用，也充分展现了mrna疫苗平台在快速开发和高效免疫应答方面的优势。

2、脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles，lnp）是目前mrna递送中较为成熟的载体系统，通常由可电离阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂组成，能够有效包封mrna、保护其免受核酸酶降解，并促进其进入细胞后释放和翻译表达。因此，基于lnp的mrna疫苗为bohv-1等动物病毒疫苗的开发提供了新的技术路径。

3、然而，单独递送抗原mrna有时仍难以获得理想的免疫增强效果，尤其是在需要同时诱导高水平中和抗体、th1型细胞免疫、ctl反应以及生发中心b细胞和滤泡辅助t细胞反应时，仍需进一步优化疫苗组成和递送策略。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种牛疱疹病毒1型mrna疫苗的制备方法及其应用，构建一种全新的mrna疫苗，为新型疫苗的研发提供全新的平台。

2、本申请为实现技术目的采用如下技术方案：

3、本发明提供一种牛疱疹病毒1型mrna疫苗的制备方法，包括：将编码牛疱疹病毒1型（bohv-1）gd抗原的gd mrna溶于水中，作为水相；将包含可电离阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂的脂质混合物溶于95%乙醇中，作为醇相；将所述水相与所述醇相通过微流控混合制得脂质纳米颗粒，再经超滤纯化和tris-hcl缓冲液置换外相，即得mrna疫苗。

4、优选地，所述可电离阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂的摩尔比为50：10：38.5：1.5。

5、更优选地，所述聚乙二醇化脂为dmg-peg2000。

6、优选地，所述超滤纯化和tris-hcl缓冲液置换外相具体包括：使用30 kda滤膜，在10°c、4500转/分的条件下进行超滤纯化，浓缩至原体积的十分之一后加入tris-hcl缓冲液至原体积，重复操作3次。

7、优选地，还包括将gd mrna与gd抗原多肽共同溶于水中，作为水相。

8、更优选地，所述gd mrna与多肽的重量比为5:1，所述gd抗原多肽的氨基酸序列如seq id no.8~13所示。

9、本发明另提供了一种牛疱疹病毒1型mrna疫苗，通过上述制备方法获得。

10、本发明另提供了一种疫苗佐剂，通过将上述制备方法中的gd mrna替换为il-12mrna获得。

11、本发明另提供了另一种疫苗组合物，包括上述mrna疫苗和上述疫苗佐剂。

12、优选地，所述mrna疫苗和所述疫苗佐剂的重量比为5:1。

13、本发明的有益效果为：

14、1. 本发明构建了一种基于脂质纳米颗粒递送系统的bohv-1-gd mrna疫苗lnpgd。该疫苗能够利用lnp递送平台有效包封并递送gd mrna，使其在体外细胞中高效表达gd抗原，并在小鼠体内诱导显著的适应性免疫应答。

15、2. 本发明制备的lnpgd疫苗具有良好的理化性质和结构。这说明本发明所述制备方法稳定可靠，所得lnpgd疫苗适合用于后续体内免疫研究和疫苗开发。

16、3. 本发明通过引入il-12 mrna佐剂lnpil-12进一步增强了lnpgd疫苗的免疫效果。il-12作为免疫调节因子，与lnpgd联合使用后，可显著提高疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫水平，为疫苗佐剂的开发提供了新方向。

17、4. 本发明进一步将gd来源免疫优势表位多肽与gd mrna共同递送，构建了lnpgd&pep疫苗。该策略能够在全长抗原mrna表达的基础上，进一步补充和强化特定mhc i/mhc ii类限制性表位的免疫刺激作用。

18、5. 本发明所述疫苗系统具有较好的生物安全性，具备良好的应用前景。

19、6. 本发明提供了一种可模块化拓展的mrna疫苗设计策略，实现了抗原表达、免疫佐剂调节和表位精准增强的协同设计。为病毒性疾病mrna疫苗、表位增强型疫苗及联合递送疫苗平台提供技术参考。

1.一种牛疱疹病毒1型mrna疫苗的制备方法，包括：将编码牛疱疹病毒1型 gd抗原的gdmrna溶于水中，作为水相；将包含可电离阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂的脂质混合物溶于95%乙醇中，作为醇相；将所述水相与所述醇相通过微流控混合制得脂质纳米颗粒，再经超滤纯化和tris-hcl缓冲液置换外相，即得mrna疫苗。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述可电离阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂的摩尔比为50：10：38.5：1.5。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇化脂为dmg-peg2000。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述超滤纯化和tris-hcl缓冲液置换外相具体包括：使用30 kda滤膜，在10°c、4500转/分的条件下进行超滤纯化，浓缩至原体积的十分之一后加入tris-hcl缓冲液至原体积，重复操作3次。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括将gd mrna与gd抗原多肽共同溶于水中，作为水相。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述gd mrna与gd抗原多肽的重量比为5:1，所述gd抗原多肽的氨基酸序列如seq id no.8~13所示。

7.一种牛疱疹病毒1型mrna疫苗，通过权利要求1~6任意一项所述的制备方法获得。

8.一种疫苗佐剂，通过将权利要求1所述的制备方法中的gd mrna替换为il-12 mrna获得。

9.一种疫苗组合物，包括权利要求7所述的mrna疫苗和权利要求8所述的疫苗佐剂。

10.根据权利要求9所述的疫苗组合物，其特征在于，所述mrna疫苗和所述疫苗佐剂的重量比为5:1。