一种丝素蛋白搭载健脾补肾解毒方纳米颗粒及其制备方法

本发明属于生物医用材料和中药递送，具体涉及一种利用丝素蛋白自组装结构负载健脾补肾解毒方提取物的纳米颗粒及其制备方法。

背景技术：

1、健脾补肾解毒方由黄芪、炒白术、地黄、补骨脂、山慈菇、野葡萄藤等药味配伍而成，含有多糖、黄酮、皂苷、苯丙素、环烯醚萜苷等多类活性成分。由于中药复方成分复杂，不同活性物质的水溶性、脂溶性、热稳定性和氧化敏感性差异较大，直接制成普通提取物或简单分散体系时，容易出现分散稳定性不足、活性成分流失、初期突释、释放速度难以调控等问题，影响其在药物递送、功能材料、敷料或口服/外用缓释载体中的应用。

2、现有中药复方递送体系可采用脂质体、聚合物胶束、无机纳米材料、凝胶或简单吸附载体等方式，但往往存在材料组成较复杂、制备流程较长、批次稳定性不易控制、部分载体需引入交联剂或有机助剂、放大生产难度较高等不足。对于多组分中药提取物而言，单一成分优化的载体并不一定适合复方体系，容易造成不同组分负载比例波动、释放不同步或储存过程中析出团聚。

3、丝素蛋白来源广泛，具有良好的生物相容性、可降解性、结构可调控性和成膜成球能力。丝素蛋白分子含有羟基、羧基、氨基和酰胺基等基团，能够与中药活性成分通过氢键、疏水相互作用、静电作用和物理缠结形成稳定结合；同时，丝素蛋白在乙醇、丙酮、聚乙二醇等条件诱导下能够发生β-折叠结构重排并自组装形成颗粒。

4、中国专利cn115337358b公开了一种具有多级梯度缓释功能的六味地黄丝素蛋白微球及其制法，其采用“载药纳米颗粒嵌入丝素蛋白微米颗粒”的两级结构，并经聚乙二醇形成微球及蒸汽熏蒸实现梯度缓释。中国专利cn105597104b公开了一种载药丝素蛋白微球及其制备方法，以姜黄素-聚乙二醇-丝素蛋白共混、孵育和离心洗涤制备载药纳微米颗粒。上述技术方案虽然能够实现药物负载和缓释，但存在结构复杂、制备周期长、工艺步骤繁多等问题。对于健脾补肾解毒方多组分提取物而言，提取阶段对亲水性指标成分梓醇与脂溶性指标成分补骨脂素的同步保留、后续成粒前二者相对比例的稳定控制，以及制剂对正常细胞的相容性，是影响复方递送体系适用性的关键因素。

5、因此，开发一种结构相对简单、制备工艺温和可控、能够稳定负载健脾补肾解毒方多组分活性物质并实现缓释递送的丝素蛋白纳米颗粒及其制备方法，具有重要的研究和应用价值。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种结构相对简洁、制备条件明确、工艺步骤简化的丝素蛋白搭载健脾补肾解毒方纳米颗粒及其制备方法。本发明以经特定提取和净化工艺获得的健脾补肾解毒方提取物为原料，采用单级乙醇诱导冻融成粒后直接喷雾干燥工艺，使提取物与丝素蛋白形成纳米颗粒。该方法不构建载药纳米颗粒嵌入丝素蛋白微米颗粒的两级结构，不采用聚乙二醇共混相分离和蒸汽熏蒸处理；其目的在于获得制备条件明确、适于评价复方双指标成分及正常细胞相容性的纳米载体。

2、一个方面，本发明提供一种丝素蛋白搭载健脾补肾解毒方纳米颗粒，所述纳米颗粒以丝素蛋白为载体材料，以健脾补肾解毒方提取物为负载活性组分；所述纳米颗粒为单级纳米颗粒结构，由丝素蛋白分子经乙醇诱导构象转变并自组装形成，所述健脾补肾解毒方提取物在成粒过程中被包埋于丝素蛋白纳米颗粒内部，或分布于颗粒内部及近表层区域。

3、所述丝素蛋白搭载健脾补肾解毒方纳米颗粒不包含由外层丝素蛋白形成的微米颗粒结构，不含聚乙二醇相分离成球的处理产物，不含经蒸汽熏蒸处理的产物。

4、所述健脾补肾解毒方提取物优选由黄芪、炒白术、地黄、补骨脂、山慈菇和野葡萄藤按处方比例混合后制备；优选采用乙醇与水体积比为8:2的乙醇水溶液进行提取，药材与乙醇水溶液的质量体积比为1:15，提取两次；提取液经浓缩、一次活性炭脱色、两次sevage脱蛋白及冷冻干燥后得到提取物冻干粉。

5、所述健脾补肾解毒方提取物中的多糖、黄酮、皂苷、苯丙素、环烯醚萜苷等活性成分可以通过氢键作用、疏水相互作用、静电作用和物理缠结等方式与丝素蛋白分子结合。

6、优选地，所述丝素蛋白搭载健脾补肾解毒方纳米颗粒呈类球形或近球形结构，直径为100-500 nm，优选为300 nm，且颗粒分散均匀，无大面积团聚。

7、优选地，所述丝素蛋白搭载健脾补肾解毒方纳米颗粒中，丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量分数为0.5～10 wt%（对应于5~100 mg/ml），更优选为3～5 wt%（对应于30~50 mg/ml）。

8、优选地，所述健脾补肾解毒方提取物与丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量比为1:2至1:5。

9、通过调节丝素蛋白的质量分数、提取物用量、成球溶剂类型、溶剂加入比例、孵育温度和孵育时间，可以控制纳米颗粒的形成状态、包封效果和释放行为。

10、优选地，所述健脾补肾解毒方提取物中包含梓醇和补骨脂素。所述梓醇为亲水性指标成分，所述补骨脂素为脂溶性指标成分。

11、优选地，所述丝素蛋白搭载健脾补肾解毒方纳米颗粒的总体载药率为15%以上，总体包封率为75%以上。

12、另一方面，本发明提供一种丝素蛋白搭载健脾补肾解毒方纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

13、（1）制备丝素蛋白溶液：将天然蚕丝经碳酸钠溶液脱胶、去离子水洗涤和干燥后，采用溴化锂溶液溶解，再经透析和过滤除去小分子盐分及不溶性杂质，得到丝素蛋白溶液；

14、（2）制备健脾补肾解毒方提取物：将黄芪、炒白术、地黄、补骨脂、山慈菇和野葡萄藤按处方比例称取并粉碎过筛后，采用提取溶剂进行提取；提取液经浓缩和过滤，进行活性炭脱色处理和脱蛋白处理；经相分离、过滤和冷冻干燥后，得到健脾补肾解毒方提取物冻干粉；

15、（3）将健脾补肾解毒方提取物加入丝素蛋白溶液中，在常温或25°c条件下搅拌，使提取物充分分散于丝素蛋白溶液中，得到混合体系；

16、（4）将无水乙醇滴加至所述混合体系中，使乙醇与混合体系的体积比为1:10；充分混合后于-20°c冷冻孵育72 h，解冻后不经离心分离、洗涤或重复重悬，直接进行喷雾干燥，获得丝素蛋白搭载健脾补肾解毒方纳米颗粒粉末。

17、所述制备方法不包括聚乙二醇共混相分离、不包括在已形成载药纳米颗粒外再构建丝素蛋白微米颗粒，也不包括甲醇、水或乙醇蒸汽熏蒸处理。

18、根据需要，步骤（1）中，可以将得到的丝素蛋白溶液直接调节至所需浓度使用；也可以先进行冷冻干燥制成丝素蛋白冻干粉，使用前以去离子水复溶，配制成不同质量分数的丝素蛋白溶液。

19、优选地，步骤（1）中，所述天然蚕丝经碳酸钠溶液煮沸脱胶后洗涤、干燥，再用溴化锂溶液溶解，经透析除盐后得到丝素蛋白溶液。所述丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量分数为0.5～10 wt%，优选为3～5 wt%。

20、优选地，步骤（2）中，所述提取溶剂为乙醇与水体积比为8:2（v/v）的乙醇水溶液，药材粉末与提取溶剂的质量体积比为1:15（g:ml），提取次数为两次，并且合并两次提取液后进行浓缩和过滤。

21、优选地，步骤（2）中，所述脱色处理为一次活性炭脱色处理；所述脱蛋白处理为将提取液与sevage试剂按5:1的体积比混合，进行两次脱蛋白处理，其中，所述sevage试剂由正丁醇和正己烷按照体积比1:1配制而成。

22、优选地，步骤（3）中，所述搅拌转速为300～800 rpm，搅拌时间为5～60 min。

23、进一步地，步骤（4）中，喷雾干燥条件可以根据进料量和设备型号调整。具体的，喷雾干燥的进口温度可以为140°c，出口温度可以为85°c，流量为0.2 l/min。

24、有益效果

25、（1）本发明采用单级乙醇诱导冻融成粒后直接喷雾干燥工艺，获得丝素蛋白搭载健脾补肾解毒方提取物的单级纳米颗粒，不构建载药纳米颗粒嵌入丝素蛋白微米颗粒的两级结构，也不采用聚乙二醇相分离或蒸汽熏蒸处理，结构明确，制备工艺简化。

26、（2）本发明采用乙醇:水=8:2、提取两次、药材粉末:乙醇水溶液的质量体积比=1:15的提取条件，并经一次活性炭脱色和两次sevage脱蛋白，能够兼顾提取产率以及梓醇和补骨脂素的含量；以梓醇和补骨脂素分别作为亲水性、脂溶性指标成分进行质量评价，有利于实现对复方双指标成分的同步控制。

27、（3）本发明采用乙醇诱导冻融成粒后不经离心分离、洗涤和重复重悬，直接喷雾干燥成粉，减少后处理步骤和颗粒转移次数，缩短制备周期，并减少多次转移带来的潜在损失。

28、（4）实验数据表明，本发明制备的丝素蛋白搭载健脾补肾解毒方纳米颗粒的总体载药率可达18.55±1.33%，总体包封率可达79.25±2.51%，显著优于聚乙二醇路线和丙酮路线制备的对比样品。体外释放实验表明，本发明纳米颗粒在24 h内呈持续释放趋势；细胞活性实验表明，本发明纳米颗粒对hct116细胞具有抑制作用，同时具有良好的正常细胞相容性，可以应用于药物递送、功能敷料和缓释载体等领域。