一种VCAM-1靶向的CRBNmRNA细胞外囊泡及其制备方法和应用

本发明属于生物医药、神经损伤治疗及核酸靶向递送，具体涉及一种vcam-1靶向的crbn mrna细胞外囊泡及其制备方法和应用。

背景技术：

1、创伤性脑损伤（traumatic brain injury，tbi）是导致死亡和长期神经功能障碍的重要原因之一。原发性机械损伤发生后，继发性脑损伤持续进展，其中血脑屏障功能异常和失控性神经炎症是影响预后的关键环节。

2、脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells，bmecs）是血脑屏障的重要结构和免疫调控单元。tbi后，bmecs可由静息状态转变为促炎状态，细胞黏附分子和趋化因子表达升高，促进外周白细胞黏附并跨内皮迁移进入脑实质。

3、中性粒细胞是tbi后较早进入损伤脑组织的外周免疫细胞之一。其进入脑实质后可形成中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，nets），对神经元造成直接毒性，并可促进小胶质细胞炎症反应，从而放大继发性脑损伤。

4、现有研究提示，与直接针对已进入脑组织的炎症细胞相比，从脑微血管内皮激活这一上游环节进行干预，可能更有效地限制中性粒细胞募集和后续神经炎症。然而，tbi后内皮细胞内源性抗炎调控因子及其可转化的靶向治疗方式仍不充分。

5、crbn（cereblon）是crl4 e3泛素连接酶复合物的底物识别受体。现有文献中crbn主要作为血液系统肿瘤免疫调节药物相关靶点被研究，其在创伤性脑损伤后脑微血管内皮炎症、代谢重编程及脑水肿中的作用尚缺乏明确认识，更缺少针对病理性脑微血管内皮的crbn核酸靶向递送方案。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种vcam-1靶向的crbn mrna细胞外囊泡及其制备方法和应用，通过恢复脑微血管内皮细胞crbn水平，抑制内皮炎症、中性粒细胞跨内皮迁移及nets形成，从而减轻脑水肿、神经元损伤及神经功能障碍，用于改善创伤性脑损伤后继发性脑损伤。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种vcam-1靶向的crbn mrna细胞外囊泡，所述vcam-1靶向的crbn mrna细胞外囊泡包括crbn mrna富集ev和vcam-1靶向脂质偶联物；所述crbn的编码区核苷酸序列如seq id no:1所示；所述vcam-1靶向脂质偶联物包括vcam-1结合肽，所述vcam-1结合肽的氨基酸序列如seq id no:2所示。

3、本发明制备上述vcam-1靶向的crbn mrna细胞外囊泡的方法为：

4、s1、将过表达crbn基因的hek293t细胞在温度为37℃、5% co2条件下培养至细胞融合度为70%～80%后，收集培养上清液，将培养上清液先在转速为2000×g条件下离心10min，再在转速为10000×g条件下离心30min后，得到上清液；

5、s2、将s1中得到的上清液在温度为4℃、转速为100000×g条件下超速离心70min，收集沉淀物质，用pbs洗涤所述沉淀物质后，再在温度为4℃、转速为100000×g条件下超速离心70min，最后用无菌pbs重悬后，得到crbn mrna富集ev；

6、s3、vcam-1结合肽经tcep还原后，与马来酰亚胺-peg-胆固醇在温度为4℃条件下孵育12h～16h后，得到vcam-1靶向脂质偶联物；

7、s4、将s3中得到的vcam-1靶向脂质偶联物与s2中得到的crbn mrna富集ev在温度为25℃、转速为200rpm条件下振荡孵育3h，然后在温度为4℃条件下孵育12h～16h，经超滤后，得到的vcam-1靶向的crbn mrna细胞外囊泡，记作vt-crbn-evs。

8、优选地，s4中所述超滤的分子截留量为100kda。

9、本发明还提供了上述vcam-1靶向的crbn mrna细胞外囊泡的应用，所述vcam-1靶向的crbn mrna细胞外囊泡用于制备改善创伤性脑损伤后继发性脑损伤的药物。

10、优选地，所述药物用于改善脑微血管内皮炎症、抑制中性粒细胞跨内皮迁移、改善神经元损伤和神经功能障碍。

11、本发明与现有技术相比具有以下优点：

12、本发明的vcam-1靶向制剂可提高炎症激活脑微血管内皮细胞的摄取及损伤脑组织内皮靶向递送效率；通过恢复crbn水平抑制pdk1-乳酸-h4k12la轴，降低内皮黏附分子表达、中性粒细胞浸润和nets沉积，并进一步减轻神经元凋亡和脑组织损伤，改善神经功能。

13、下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

1.一种vcam-1靶向的crbn mrna细胞外囊泡，其特征在于，所述vcam-1靶向的crbnmrna细胞外囊泡包括crbn mrna富集ev和vcam-1靶向脂质偶联物；所述crbn的编码区核苷酸序列如seq id no:1所示；所述vcam-1靶向脂质偶联物包括vcam-1结合肽，所述vcam-1结合肽的氨基酸序列如seq id no:2所示。

2.一种制备如权利要求1所述的vcam-1靶向的crbn mrna细胞外囊泡的方法，其特征在于，该方法为：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，s4中所述超滤的分子截留量为100kda。

4.一种如权利要求1所述的vcam-1靶向的crbn mrna细胞外囊泡的应用，其特征在于，所述vcam-1靶向的crbn mrna细胞外囊泡用于制备改善创伤性脑损伤后继发性脑损伤的药物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物用于改善脑微血管内皮炎症、抑制中性粒细胞跨内皮迁移、改善神经元损伤和神经功能障碍。