一种负载丹参-黄芪细胞外囊泡的多功能水凝胶敷料及其制备方法和应用

本发明属于生物医学，具体涉及一种负载丹参-黄芪细胞外囊泡的多功能水凝胶敷料及其制备方法和应用。

背景技术：

1、这里的陈述仅提供与本发明相关的背景技术，而不必然地构成现有技术。

2、糖尿病是一种以慢性高血糖为特征的代谢紊乱性疾病，糖尿病伤口是其最常见的并发症之一，具有较高的复发率和截肢率，严重降低患者生存质量。糖尿病伤口的愈合延迟受高血糖、氧化应激、血管神经病变、慢性炎症等多重因素影响，其中慢性炎症被认为是创面愈合延迟的最重要因素，且与免疫细胞的功能紊乱密切相关。

3、与一般伤口相比，糖尿病伤口处于高血糖的持续浸润状态，细菌更容易入侵伤口组织并进行细胞增殖，同时分泌胞外聚合物形成生物膜，进而引起糖尿病伤口的感染。当糖尿病伤口发生持续细菌感染时，炎症反应被进一步放大，伤口炎症期延长、无法正常过渡到增殖期，最终加重伤口愈合延迟。

4、近年来研究发现，中性粒细胞胞外陷阱（nets）在糖尿病细菌感染伤口的病理进程中扮演着关键角色。nets是一种由中性粒细胞产生的、含有解聚的染色质和细胞内颗粒蛋白的网状结构。在正常伤口愈合过程中，中性粒细胞适量分泌nets以清除病原体、抵抗细菌感染；然而在细菌感染的糖尿病伤口微环境中，中性粒细胞的长期过度活化会导致nets过度释放，进而促使巨噬细胞向m1型极化，引起nlrp3炎性小体及il-1β水平升高，放大伤口炎症反应，严重影响伤口愈合。因此，抑制nets的过度生成已成为减轻糖尿病细菌感染伤口炎症反应的有效策略。

5、目前，临床用于糖尿病伤口的敷料主要包括传统纱布敷料、功能性薄膜敷料、水胶体敷料等，但这些敷料普遍存在功能单一、难以有效调控局部免疫微环境、抗菌能力有限等问题。近年来，水凝胶敷料因其良好的生物相容性、三维网络结构、优异的载药能力和透气吸水性而受到广泛关注。然而，现有水凝胶敷料大多仅具备物理屏障或保湿功能，缺乏针对糖尿病伤口复杂病理微环境（如nets过度生成、慢性炎症、细菌感染）的多靶点干预能力。

6、中药在防治复杂疾病方面展现出多靶点、多层次的干预优势。丹参和黄芪是经典的中药药对，具有抗炎、抗菌功能，已被证实能够有效抑制nets的生成。然而，传统丹参-黄芪制剂存在溶解度差、代谢清除快、物质基础不清等问题，限制了其在皮肤创面中的直接应用。

7、植物来源的细胞外囊泡（pdevs）是由植物细胞释放的、含有蛋白质、核酸和脂质等生物活性分子的小囊泡，与传统中药相比具有更好的生物利用度和更清晰的物质基础，正作为中药新型递药系统受到越来越多的关注。专利cn 116726152 a将中草药囊泡样颗粒与肿瘤细胞膜融合，得到中草药囊泡样颗粒嵌合的个性化肿瘤疫苗。

8、现有技术未披露基于细胞外囊泡（evs）结构治疗糖尿病细菌感染伤口愈合的技术方案。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种负载丹参-黄芪细胞外囊泡的多功能水凝胶敷料及其制备方法和应用。

2、为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：

3、第一方面，本发明提供一种负载丹参-黄芪细胞外囊泡的多功能水凝胶敷料，包含多巴胺接枝的氧化海藻酸钠（osa-da）、羧甲基壳聚糖（cmc）和丹参-黄芪细胞外囊泡（dh-evs）；所述dh-evs分散于由osa-da和cmc通过席夫碱交联形成的水凝胶三维网络结构中；以cmc计，所述dh-evs在水凝胶敷料中的质量百分比为2%-10%。

4、本发明中，osa-da中的醛基（来自氧化海藻酸钠）与cmc中的氨基（-nh2）通过席夫碱反应形成亚胺键（-c=n-），构成水凝胶的共价三维网络，这是水凝胶结构的主体骨架。在此三维网络中：

5、osa-da：作为含醛基的多糖链，参与交联；其骨架上共价接枝的多巴胺侧基（儿茶酚基团）悬挂于网络孔隙内，不参与主交联，但为网络提供粘附性和额外的非共价相互作用位点；

6、cmc：作为含氨基的阳离子多糖，既参与交联，又提供质子化氨基（-nh3+），使网络局部带正电。

7、dh-evs（粒径150-250 nm，zeta电位约-47 mv，表面带负电）在osa-da与cmc混合阶段被均匀分散，随后交联反应原位发生，dh-evs被截留并封装于网络孔隙中。cmc的-nh3+与dh-evs表面负电荷通过静电吸引，多巴胺儿茶酚基团与evs膜蛋白/脂质通过氢键连接。这些非共价作用使dh-evs稳定锚定于孔隙中，不易聚集或流失，保证了结构的稳定性。

8、在该结构基础上，dh-evs作为生物活性囊泡，在改变三维网络孔隙形貌的同时，可自身保持结构完整性并持续释放活性成分。

9、本发明的水凝胶敷料以氧化海藻酸钠和羧甲基壳聚糖为骨架，具有良好的生物相容性和生物可降解性。dh-evs的加入不破坏水凝胶的三维多孔网络结构和力学性能，反而使孔隙更加均匀细密，增强了敷料的溶胀性能和降解性能，有利于吸收伤口渗出液并提供湿性愈合环境。

10、优选的，所述丹参-黄芪细胞外囊泡由丹参和黄芪按照质量比1:0.5~1:2经煎煮后通过差速离心法提取获得。

11、优选的，所述丹参-黄芪细胞外囊泡的粒径为150-250 nm，zeta电位为-50 mv至-40 mv。

12、更优选的，所述丹参-黄芪细胞外囊泡在水凝胶敷料中的质量百分比为10%。

13、第二方面，本发明提供第一方面所述的负载丹参-黄芪细胞外囊泡的多功能水凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：

14、s1：将丹参和黄芪去除灰尘后，以煎煮法得到丹参-黄芪煎煮液；

15、s2：将煎煮液过滤后经差速离心去除杂质，收集上清液；

16、s3：将上清液在3~5℃、150000±15000 g下离心80~100 min，收集沉淀，用pbs重悬，得到丹参-黄芪细胞外囊泡（dh-evs）；

17、s4：在海藻酸钠中加入高碘酸钠进行氧化反应，冷冻干燥后得到氧化海藻酸钠（osa）；

18、s5：将氧化海藻酸钠溶解于溶剂中，在氮气保护条件下加入盐酸多巴胺进行接枝反应，经透析、冷冻干燥后得到多巴胺接枝的氧化海藻酸钠（osa-da）；

19、s6：将osa-da、cmc和dh-evs预先均匀混合，通过席夫碱交联反应原位形成水凝胶，使dh-evs在水凝胶三维网络中原位封装。

20、优选的，步骤s1中所述丹参与黄芪的质量比为1:0.5~1:2。

21、优选的，步骤s2中，将煎煮液过滤后在3~5℃下依次以1000±100 g、2000±200 g、3000±300 g、10000±1000 g进行离心去除杂质，收集上清液。

22、优选的，步骤s5中，所述溶剂为2-吗啉乙磺酸（mes）缓冲溶液，浓度为50±5 mmol/l，ph值为6±0.5。

23、优选的，步骤s6中，将osa-da、cmc按照质量比3:4~3:6 w/w混合，混合过程中，将osa-da溶液分多次逐渐加入cmc溶液中，每次加入后涡旋混合，直至形成均质水凝胶。

24、优选的，步骤s6中所述丹参-黄芪细胞外囊泡的加入量以cmc计，质量百分比为2%~10%。

25、更优选的，步骤s6中所述丹参-黄芪细胞外囊泡的加入量使得其在水凝胶敷料中的质量百分比为10%。

26、第三方面，本发明提供第一方面所述的负载丹参-黄芪细胞外囊泡的多功能水凝胶敷料在制备预防和/或治疗糖尿病细菌感染伤口的药物或医疗器械中的应用。

27、优选的，所述敷料具有如下所述的至少一个方面：

28、（1）通过抑制中性粒细胞胞外陷阱（nets）的过度生成来减轻伤口处的炎症反应；

29、（2）降低伤口处中性粒细胞标志物ly6g与nets标志物瓜氨酸化组蛋白h3（cith3）的共定位水平；

30、（3）降低血清中nets标志物mpo-dna复合物的含量；

31、（4）促进巨噬细胞由促炎m1型向抗炎m2型极化；

32、（5）促进伤口处胶原沉积、肉芽组织新生和再上皮化。

33、上述本发明的一种或多种实施例取得的有益效果如下：

34、（1）本发明首次将丹参-黄芪细胞外囊泡（dh-evs）负载于水凝胶敷料中，构建了具有抑制nets过度生成功能的多功能水凝胶敷料体系。该敷料通过dh-evs中的生物活性成分（包括脂质、mirna等）发挥多靶点协同作用，有效抑制糖尿病细菌感染伤口中nets的过度生成。

35、（2）本发明所采用的dh-evs提取方法（差速离心法）操作简便、重复性好，能够获得高纯度、高活性的植物细胞外囊泡。dh-evs保留了丹参和黄芪的活性成分，同时具有纳米级粒径（约199 nm）、良好的稳定性（zeta电位约-47 mv）和完整的双层膜结构，克服了传统丹参-黄芪制剂溶解度差、代谢清除快的问题。

36、（3）体外实验证实，本发明的水凝胶敷料具有良好的细胞相容性和血液相容性，细胞存活率达90%以上，溶血率远低于5%的安全临界值；且能显著抑制pma诱导的中性粒细胞nets生成，抑制作用呈dh-evs浓度依赖性。

37、（4）体内动物实验证实，本发明的水凝胶敷料能显著促进糖尿病细菌感染伤口的愈合。含有10% dh-evs的水凝胶敷料组在第18天伤口愈合率接近100%，愈合效果显著优于模型组和不含dh-evs的水凝胶组。组织学分析显示，该敷料能有效减轻伤口炎症反应、促进胶原沉积和组织新生。

38、（5）机制研究表明，本发明的水凝胶敷料通过抑制伤口处nets的过度生成，进而促进巨噬细胞由促炎m1型向抗炎m2型极化，从而打破糖尿病细菌感染伤口的慢性炎症循环，促进伤口由炎症期向增殖期转化。这一作用机制为糖尿病细菌感染伤口的治疗提供了全新的思路和策略。