一种包被EPO的红细胞囊泡及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医学，具体涉及一种包被epo的红细胞囊泡及其制备方法和应用。

背景技术：

1、慢性肝纤维化是肝脏受到持续损伤后，细胞外基质过度沉积所引发的病理进程，若得不到有效干预，可进一步进展为肝硬化甚至肝癌，严重威胁患者生命健康。目前临床尚缺少能够直接逆转肝纤维化进程的特效药物，现有治疗手段多以祛除致病诱因、抗炎保肝为主，难以从通路层面抑制肝星状细胞过度活化，抗纤维化治疗仍存在较大临床需求缺口。

2、红细胞囊泡（红细胞来源胞外囊泡）是以成熟红细胞为母细胞产生的纳米级膜囊泡结构。成熟红细胞无细胞核，因此红细胞囊泡不携带基因组dna，具有生物相容性好、免疫原性低、体内循环时间长等优势，是一类极具潜力的生物药物递送载体。常规红细胞囊泡制备主要分为两类主流思路，一类是直接收集红细胞自发分泌的天然囊泡；另一类是先将红细胞低渗裂解得到红细胞血影膜，再通过挤压、超声等方式重构形成囊泡产物，之后再对成型囊泡进行后孵育表面修饰，赋予囊泡靶向或者响应功能。

3、现有先裂解制备血影膜再组装囊泡、囊泡成型之后再开展后修饰的制备工艺，存在若干固有缺陷。红细胞经过裂解、反复洗涤、超声、挤压重构之后，细胞膜天然蛋白结构会受到一定程度破坏，后续后孵育修饰模式下，修饰分子仅能够非特异性吸附于囊泡外表面，修饰结合效率偏低；产物体系中容易残留膜碎片杂质，造成囊泡粒径分布宽、多分散系数高，批次之间性质差异大，影响体内实际作用效果。同时，常规红细胞囊泡大多缺少病灶微环境响应释放能力，到达肝脏纤维化病灶后，活性组分释放可控性不足，难以充分发挥对纤维化信号通路的调控作用。

4、另外，单纯未修饰红细胞囊泡载体本身不具备显著的抗纤维化药理活性；游离活性小分子进入体内后易被快速代谢清除，肝脏病灶富集程度低，很难实现稳定有效的干预效果。现有技术缺少可以同时实现高修饰效率、产物纯度高、具备病灶氧化还原响应释放能力的红细胞囊泡制备方案，制约了红细胞囊泡载体在慢性肝纤维化治疗中的实际应用。

5、因此，开发一种制备工艺简便、产物粒径均一、修饰效率高，可实现病灶微环境响应释放，能够有效干预慢性肝纤维化进展的红细胞囊泡制备方法，具有重要的现实意义。

6、检索到的相关专利文献：

7、公开国别中国，公开号cn116270532a，公开日期2023.06.23，该文献公开了一种靶向肝星状细胞的囊泡递药系统、制备方法及其应用，涉及生物医药技术领域。该文献提供了一种靶向肝星状细胞的囊泡递药系统，使用红细胞进行药物的递送，提高了药物的局部作用浓度和靶向性。利用所述囊泡递药系统装载bapn，可以抑制肝星状细胞活化缓解肝纤维化，且修饰前后rbcev的形态和结构基本不受影响。与直接使用bapn相比，crgd-rbcev递送的bapn的血药浓度维持时间更长，肝脏靶向性更强，治疗效果更显著，为治疗纤维化肝病提供了新思路。

8、公开国别中国，公开号cn116059403a，公开日期2023.05.05，该文献公开了一种胆酸修饰的红细胞囊泡及其制备方法和应用，属于生物医学领域。上述制备方法包括以下步骤：(1)收集血液，经处理获取红细胞囊泡；(2)将lima1sirna电转所述红细胞囊泡，得到携带lima1小核酸片段的红细胞囊泡；将携带lima1小核酸片段的红细胞囊泡与胆酸聚合物溶液混合制备成混合悬液，恒温水浴反应，结束后进行清洗，得到胆酸修饰的红细胞囊泡。该文献通过胆酸修饰的红细胞囊泡包裹小核酸，动物试验显示：经口服后，在非酒精性脂肪肝中具有良好的治疗效果，降低肝组织lima1表达的同时，还有效抑制肝细胞脂质沉积，缓解非酒精性脂肪肝进展，且对其他器官无实质性损伤。

9、公开国别中国，公开号cn119074770a，公开日期2024.12.06，该文献公开了凋亡囊泡在制备预防或治疗心力衰竭的药物中的应用。该文献首次发现了心脏稳态与细胞凋亡之间的关系，并通过凋亡缺陷小鼠的心肌损伤和心力衰竭表型证明了这一点。该文献发现外源性输注apovs可以显著改善凋亡缺陷小鼠和dox诱导小鼠的心功能，明显减轻dox诱导的心力衰竭小鼠的这种病理表现，这意味着使用apovs治疗心力衰竭是一种很有前景的治疗策略。

10、公开国别中国，公开号cn120114617a，公开日期2025.06.10，该文献公开了细胞外囊泡-青蒿琥酯偶联物、制备方法及在皮肤药物中的应用。该偶联物结构包括：细胞外囊泡、linker片段和青蒿琥酯。该文献充分考虑细胞外囊泡表面活性基团、以及青蒿琥酯独特的化学结构，成功设计优化得到适合的linker片段并选定适合的连接策略和生物位点，利用生物正交反应条件温和、无毒、高效且操作简便等优势，将青蒿琥酯与细胞外囊泡脂膜表面的特定活性官能团通过linker偶联，成功制备出细胞外囊泡-青蒿琥酯偶联物。该生化偶联过程具有装载效率高，不影响细胞外囊泡的形态学、膜结构及脂膜表面蛋白标志物，保持了细胞外囊泡的基本生物学功能等优势。

11、公开国别中国，公开号cn121943851a，公开日期2026.05.01，该文献公开了一种膜融合细胞外囊泡及其制备方法和靶向心肌梗死的应用。该文献提供了一种膜融合细胞外囊泡，包括单核细胞膜和细胞外囊泡；所述细胞外囊泡包括循环血细胞外囊泡。该文献所述单核细胞膜可通过归巢效应靶向损伤心肌细胞与梗死部位，循环性细胞外囊泡易获得、易纯化、利于扩大生产，且能够修复受损心脏，将二者混合挤压、通过滤膜制备得到的膜融合细胞外囊泡具有单核细胞膜和细胞外囊泡的特异性蛋白，能够靶向损伤心脏部位，为新型心脏靶向药物开发提供靶点。

12、检索到的相关非专利文献：

13、期刊名称《original article》，文献名称《erythropoietin-modifiedmesenchymal stem cells enhance anti-fibrosis efficacy in mouse liver fibrosismode》，卷号第17卷，公开日期2020.07.03，该文献公开了基于间充质干细胞（msc）的细胞移植是治疗慢性肝损伤、肝纤维化及终末期肝病的有效手段。但大量研究发现，仅有少量移植细胞能够迁移至损伤或病变部位，修复效果十分有限。方法：利用慢病毒构建过表达促红细胞生成素（epo）基因的骨髓来源间充质干细胞（bm-msc）；采用cck-8试剂盒检测过表达epo后bm-msc的细胞活力；分别采用boyden小室实验与流式细胞术检测细胞迁移与细胞凋亡；最后通过免疫组化分析，在体内评价epo-msc的抗纤维化疗效。结果：epo过表达能够提升bm-msc的细胞活力与迁移能力，且不会诱导细胞凋亡；在四氯化碳（ccl4）诱导的小鼠肝纤维化模型中，epo-msc干预可显著减轻肝纤维化。结论：相较于单纯bm-msc治疗，epo-msc细胞活力更高、迁移能力更强，抗纤维化疗效得到提升。该研究结果为提高间充质干细胞移植效率、用于肝纤维化治疗提供潜在治疗策略。

14、期刊名称《bioengineering》，文献名称《low-intensity continuous ultrasoundenhances the therapeutic efficacy of curcumin-encapsulated exosomes derivedfrom hypoxic liver cancer cells via homotropic drug delivery systems》，公开日期2024.11.23，该文献公开了外泌体是细胞分泌的细胞外纳米囊泡，可高效递送治疗cargo（载荷）用于癌症治疗。但外泌体产量较低、靶向特异性有限，因此已有研究探索利用胞内、胞外应激刺激提升外泌体的作用效率。受上述研究启发，该研究评估氯化钴诱导缺氧的肝癌细胞所分泌外泌体的摄取效率。蛋白质免疫印迹与逆转录-pcr结果显示：相比于常氧外泌体（n-exos），缺氧外泌体（h-exos）的分泌量增加，且蛋白组成发生改变。该研究进一步在体外（3mhz）和体内（1mhz）采用360mw/cm²强度的低强度连续超声（licus）对h-exos进行持续刺激。超声产生的热效应与机械应激通过网格蛋白介导的内吞通路成功提升细胞对外泌体的摄取；激光共聚焦显微镜观察可见外泌体大量定位于靶细胞核周边。最后，将疏水药物姜黄素装载至经licus处理的h-exos中（h-exo-cur），用于处理亲本hepg2肝癌细胞。紫外-可见分光光度计检测证实，外泌体包载后药物的稳定性、溶解性与有效浓度均得到提升。mtt与流式细胞术结果表明，与对照组相比，licus辅助的h-exo-cur可诱导约40倍的细胞死亡；动物实验显示，其对肿瘤生长的抑制能力约为对照组的10倍。

15、期刊名称《advanced nanobiomed research》，文献名称《surface modificationof erythrocytes with lipid anchors: structure-activity relationship foroptimal membrane incorporation, in vivo retention, and immunocompatibility》，公开日期2022.07，该文献公开了经过peg化脂质改造的红细胞显示巨噬细胞摄取减少。部分衍生物促进抗体在人血浆和小鼠血清中的结合，以及补体沉积和溶血的适度增加，但这些与红细胞体内稳定性无关。超稳定锚点可使红细胞功能化，用于药物递送、成像和感测。对红细胞与脂质的修饰在生物医学应用中非常受关注。检测一个荧光脂质库，以稳定地掺入人类和小鼠的红细胞。然后将修饰过的红细胞注射到小鼠体内，并测试脂质稳定性和循环特性。同时也研究了降低免疫识别的结构需求。

16、前述文献代表的现有技术至少存在以下未解决的技术问题或缺陷：

17、在体内对慢性肝纤维化的干预改善效果有限，相关证据为：公开号cn116270532a（即本发明对比例1）在相同动物模型、给药剂量与给药周期条件下，其对应样品虽具备一定保肝抗炎作用，但其仅可将模型小鼠血清alt、ast分别降至116.3±11.5u/l、204.7±18.2u/l，masson染色肝脏胶原面积占比仍高达9.6±1.3%，纤维化通路tgf-β1基因相对表达量为2.53±0.28，难以充分实现对慢性肝纤维化的高效干预。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供：

2、一种包被epo的红细胞囊泡的其制备方法，及其相关技术，以解决现有红细胞囊泡制备工艺修饰效率低、产物杂质多、缺乏病灶氧化还原响应释药能力、体内抗肝纤维化疗效不足等技术问题或其组合。

3、术语说明：

4、除非另有定义，否则本文所有科技术语具有的涵义与本发明主题所属领域技术人员通常理解的涵义相同。除非另有说明，本文全文引用的所有专利、专利发明、公开材料通过引用方式整体并入本文。如果本文对术语有多个定义，以本章的定义为准。

5、应理解，上述简述和下文的详述为示例性且仅用于解释，而不对本发明的主题作任何限制。在本发明中，除非另有具体说明，否则使用单数时也包括复数。还应注意，除非另有说明，否则所用“或”、“或者”表示“和/或”。此外，所用术语“包括”以及其它形式，例如“包含”、“含”和“含有”并非限制性。

6、可在参考文献《中华医学百科全书 血液学》（中国协和医科大学出版社）、内科学（第10版）》（人民卫生出版社）、《病理学（第9版）》（人民卫生出版社）中找到对标准术语的定义。

7、除非另有说明，否则采用本领域技术范围内的常规方法，如透射电子显微镜(tem)、zeta电位检测、免疫荧光染色等方法。

8、除非提出具体定义，本文中使用的各类市售产品的使用，均采用标准技术。例如，可利用厂商对试剂盒的使用说明，或者按照本领域公知的方式或本发明的说明来进行实施。通常可根据本说明书中引用和讨论的多个概要性和较具体的文献中的描述，按照本领域熟知的常规方法实施上述技术和方法。

9、本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60-120和80-110的范围，理解为60-110和80-120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1-2、1-4、1-5、2-3、2-4和2-5。

10、本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。

11、本文所用的术语“红细胞囊泡”，指：红细胞凋亡过程因磷脂酰丝氨酸外翻，导致红细胞原位出芽脱落产生的200纳米左右囊泡。

12、本文所用的术语“肝纤维化”，指：由病毒、酒精、毒物等多种慢性损伤因素持续刺激肝脏，造成肝星状细胞活化，细胞外基质（胶原、纤连蛋白等）过度异常沉积的病理过程，是慢性肝病向肝硬化进展的中间病理阶段。

13、本文所用的术语“修饰”，指：通过基因工程、化学偶联、疏水插入等手段，对囊泡（细胞、细胞膜）的膜蛋白、膜脂质组分进行人为改造，向囊泡引入特定功能基团、多肽或功能蛋白，以此改变囊泡生物学性能，实现靶向、刺激响应、提升稳定性等目的。

14、本文所用的术语“锚定”，指：利用疏水结构（如胆固醇）、跨膜片段、膜亲和基团等，使功能分子稳定结合并固定在囊泡/细胞膜的脂双层上，使功能分子留存于囊泡膜表面，不轻易解离脱落的结合方式。

15、本文所用的术语“响应”，指：纳米囊泡递送系统可感知病灶微环境变化（ph、氧化还原、酶、超声等外界/内源信号），发生分子结构改变，进而触发药物释放、构象改变等预期生物学行为。

16、本文所用的术语“红细胞压积”，指：又称红细胞比容，是指一定量的抗凝全血经过离心沉淀后，下沉红细胞占全血体积的比例。

17、本文所用的术语“包被”，指：功能蛋白、多肽等生物分子通过锚定分子共价结合或者强特异性非共价结合方式，定位在红细胞囊泡的脂双层外表面，生物分子暴露于囊泡外部水相环境；区别于将分子包裹封闭在囊泡内部水相内腔的内腔包载方式。

18、本文所用的术语“epo”，指：即促红细胞生成素（erythropoietin），优选为重组人促红细胞生成素（rh-epo），是一种糖蛋白类细胞因子；本发明中经胆固醇-peg类锚定分子修饰后，以包被形式结合于红细胞囊泡膜外表面，保留其生物学活性。

19、本文所用的术语“nta检测”，指：纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle-trackinganalysis），是用于表征纳米颗粒/囊泡的粒径分布、颗粒浓度的检测方法，通过追踪激光照射下颗粒的布朗运动，计算得到样品的粒径与颗粒数浓度，为本领域胞外囊泡常规理化表征手段。

20、本文所用的术语“sybrgreen法”，指：一种sybr-green荧光染料嵌入双链dna的实时荧光定量pcr检测方法，染料结合扩增产物后产生荧光信号，依据荧光信号变化对样本中靶标基因mrna的相对表达水平进行定量分析。

21、本文所用的术语“col-i、α-sma、tgf-β1”，指：col-i为ⅰ型胶原蛋白，是细胞外基质主要组分，反映组织胶原沉积水平；α-sma为α-平滑肌肌动蛋白，是肝星状细胞活化的标志性蛋白；tgf-β1为转化生长因子-β1，是驱动肝纤维化发生发展的核心信号分子；三者为评价肝纤维化程度的经典检测靶标。

22、本文所用的术语“bca法”，指：bca蛋白定量检测法，基于双缩脲反应原理，通过比色法测定样本总蛋白浓度，属于生物样品中蛋白含量测定的常规检测手段。

23、第一方面，本发明提供了：一种红细胞囊泡的制备方法，包括步骤：

24、s1：分离纯化完整红细胞，得到纯化后的红细胞；

25、s2：将纯化后的红细胞重悬于等渗缓冲体系，得到红细胞悬液；

26、s3：向红细胞悬液中同时加入胆固醇-苯硼酸-二硫键（chol-ss-pba）功能分子以及chol-peg2000-epo偶联物，进行共孵育，使chol-ss-pba与chol-peg2000-epo二者的胆固醇疏水端插入红细胞细胞膜脂双层，完成完整红细胞原位共预修饰，在红细胞细胞膜外表面同时锚定双响应基团以及epo，实现红细胞膜表面epo包被；

27、s4：对预修饰完成的红细胞悬液进行孵育处理，诱导红细胞原位出芽脱落，释放同时经chol-ss-pba修饰且表面包被epo的红细胞囊泡；

28、s5：梯度差速离心，去除完整母红细胞以及膜碎片，收集含有粗制修饰红细胞囊泡的上清液；

29、s6：对粗制囊泡进行纯化洗脱，去除未插入膜的游离chol-ss-pba分子、游离chol-peg2000-epo、游离杂质，获得纯化的同时具有chol-ss-pba修饰且表面包被epo的红细胞囊泡。

30、其中，s1所述分离纯化完整红细胞的步骤为：取新鲜抗凝全血，离心去除血浆、白膜层；采用等渗洗涤缓冲液洗涤红细胞，得到纯化完整红细胞；

31、优选地，s1所述等渗洗涤缓冲液选自hepes缓冲hanks平衡盐溶液（hepes-hbss洗涤缓冲液）、hepes-pbs缓冲液、碳酸氢盐缓冲的hanks平衡盐溶液（普通hbss）中的至少一种；

32、进一步优选地，s1所述等渗洗涤缓冲液为hepes-hbss洗涤缓冲液。

33、优选地，s1所述洗涤红细胞的次数为1-5次，例如1次、2次、3次、4次、5次，或其任意衍生的范围；

34、进一步优选地，s1所述洗涤红细胞的次数为3次。

35、优选地，s1所述离心的温度为2-8℃，例如2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃，或其任意衍生的范围；

36、进一步优选地，s1所述离心的温度为4℃。

37、优选地，s1所述离心力为400-600g，例如400g、430g、460g、480g、500g、520g、550g、580g、600g，或其任意衍生的范围；

38、进一步优选地，s1所述离心力为420g。

39、优选地，s1所述离心的单次离心时间为6-12min，例如6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min，或其任意衍生的范围；

40、进一步优选地，s1所述离心的单次离心时间为8min。

41、其中，s2所述的等渗缓冲体系选自hepes-hbss缓冲液、pbs缓冲液中的一种；

42、优选地，s2所述的等渗缓冲体系为hepes-hbss缓冲液；

43、在一些具体的实施方式中，s2所述的等渗缓冲体系中还可以加入蛋白酶抑制剂；

44、具体地，所述蛋白酶抑制剂可选自苯甲基磺酰氟（pmsf）、水溶性丝氨酸蛋白酶抑制剂（aebsf）、亮抑酶肽（leupeptin）、抑肽酶（aprotinin）、胃蛋白酶抑制剂a（pepstatina）中的至少一种；

45、进一步具体地，所述蛋白酶抑制剂可以是pmsf；

46、进一步优选地，s2所述的等渗缓冲体系为含有0-0.1mm pmsf的hepes-hbss缓冲液；

47、上述的0-0.1mm，例如0mm、0.02mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.08mm、0.1mm，或其任意衍生的范围；

48、最优选地，s2所述的等渗缓冲体系为含有0.05mmpmsf的hepes-hbss缓冲液。

49、其中，s2所述的等渗缓冲体系的渗透压范围为280-300mosm/kg，例如280mosm/kg、283mosm/kg、286mosm/kg、288mosm/kg、290mosm/kg、293mosm/kg、296mosm/kg、300mosm/kg，或其任意衍生的范围；

50、优选地，s2所述的等渗缓冲体系的渗透压范围为292mosm/kg。

51、其中，s2所述的等渗缓冲体系的ph为7.20-7.50，例如7.20、7.25、7.30、7.35、7.40、7.45、7.50，或其任意衍生的范围；

52、优选地，s2所述的等渗缓冲体系的ph为7.38。

53、在一些具体的实施方式中，s2所述的红细胞悬液的红细胞压积为2.0%-8.0%（v/v），例如2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%，或其任意衍生的范围；

54、优选地，s2所述的红细胞悬液的红细胞压积为3.5%（v/v）。

55、其中，s3所述红细胞悬液中chol-ss-pba的浓度为3.0-12.0μm，例如3.0μm、4.5μm、6.0μm、7.5μm、9.0μm、10.5μm、12.0μm，或其任意衍生的范围；

56、优选地，s3所述红细胞悬液中chol-ss-pba的浓度为7.5μm。

57、其中，s3所述红细胞悬液中chol-peg2000-epo偶联物终浓度为2-7μm；

58、优选地，s3所述红细胞悬液中chol-peg2000-epo偶联物终浓度为4.5μm。

59、其中，s3所述共孵育的温度为25-34℃，例如25℃、27℃、29℃、30℃、31℃、32℃、34℃，或其任意衍生的范围；

60、优选地，s3所述共孵育的温度为28℃。

61、其中，s3所述共孵育的时长为15-40min，例如15min、20min、25min、30min、35min、40min，或其任意衍生的范围；

62、优选地，s3所述共孵育的30min。

63、其中，s3所述共孵育的方式为振荡孵育；

64、优选地，s3所述共孵育的振荡频率为30-60rpm，例如30rpm、35rpm、40rpm、45rpm、50rpm、55rpm、60rpm，或其任意衍生的范围；

65、进一步优选地，s3所述共孵育的振荡频率为45rpm。

66、在一些具体的实施方式中，s3所述chol-ss-pba在加入红细胞悬液前还可以加入助溶剂预混合；

67、优选地，所述助溶剂的类型选自无水乙醇、二甲基亚砜（dmso）中的一种；

68、进一步优选地，所述助溶剂为dmso；

69、更进一步优选地，红细胞悬液中dmso的体积分数≤1%；

70、最优选地，红细胞悬液中dmso的体积分数为0.4%。

71、其中，s4所述孵育的温度为32-37℃，例如32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃，或其任意衍生的范围；

72、优选地，所述孵育的温度为34-36℃；

73、进一步优选地，所述恒温孵育的温度为35℃。

74、其中，s4所述孵育的孵育时间为20-60min，例如20min、25min、30min、40min、50min、60min，或其任意衍生的范围；

75、优选地，所述孵育的孵育时间为30-50min；

76、进一步优选地，所述孵育的孵育时间为40min。

77、其中，s4所述孵育过程采用低速水平振荡；

78、优选地，所述振荡的速率为25-55rpm，全程保持体系等渗，不施加超声、高压挤压、电场穿孔；

79、进一步优选，所述振荡速率为35-45rpm；更进一步优选为40rpm。

80、其中，s5所述差速离心的温度为2-8℃，例如2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃，或其任意衍生的范围；

81、优选地，s5所述差速离心的温度为4℃。

82、其中，s5所述差速离心包括一次离心和二次离心；

83、优选地，所述一次离心的离心力为300-380g，例如300g、320g、340g、360g、380g，或其任意衍生的范围；

84、进一步优选地，所述一次离心的离心力为320g。

85、优选地，所述一次离心的时长为8-15min，例如8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min，或其任意衍生的范围；

86、进一步优选地，所述一次离心的时长为12min。

87、优选地，所述二次离心的离心力为1600-2200g，例如1600g、1700g、1800g、1900g、2000g、2100g、2200g，或其任意衍生的范围；

88、进一步优选地，所述二次离心的离心力为1800g。

89、优选地，所述二次离心的时长为30-60min，例如30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min，或其任意衍生的范围；

90、进一步优选地，所述二次离心的时长为45min。

91、其中，s6所述纯化选自尺寸排阻色谱法、超滤浓缩-透析法中的至少一种；

92、优选地，s6所述纯化为采用qev系列尺寸排阻色谱柱进行纯化。

93、其中，s6所述洗脱所用的洗脱缓冲液选用等渗pbs缓冲液或hepes-hbss缓冲液；

94、优选地，s6所述洗脱所用的洗脱缓冲液hepes-hbss缓冲液。

95、第二方面，本发明提供了：一种基于上述制备方法所获得的红细胞囊泡。

96、第三方面，本发明提供了：所述制备方法或所述的红细胞囊泡在制备治疗肝纤维化药物及纳米药物递送方面的应用。

97、在一些具体的实施方式中，所述应用优选为制备治疗肝纤维化药物方面的应用。

98、本发明中，所述制备方法中所用的chol-ss-pba分子依靠胆固醇疏水尾部插入完整红细胞细胞膜脂双层外小叶，该分子并非仅仅作为膜上的功能标记基团，其插入行为能够改变红细胞膜局部的物理化学特性，进而主动调控红细胞膜的出芽行为。

99、红细胞膜内天然存在胆固醇富集的脂筏微区，脂筏微区为有序液相结构，与周围无序液相膜区域存在相分离；脂筏区域与膜骨架（血影蛋白-锚蛋白复合物）之间存在较强的相互作用，限制膜发生弯曲出芽。chol-ss-pba分子的胆固醇骨架能够嵌入脂筏微区，同时分子上苯硼酸-二硫键的极性基团暴露于膜外侧水相，会扰动脂筏微区的分子堆积排布，改变脂筏区域的膜厚度、膜弯曲模量以及膜-细胞骨架的结合作用力。

100、在本发明恒温孵育条件下，插入膜内的chol-ss-pba分子协同温度效应，促进脂筏微区发生横向相分离；局部区域膜与膜骨架的结合力减弱，膜产生向内/向外的弯曲应力，驱动细胞膜局部向外凸起、出芽，最终脱落形成修饰红细胞囊泡。

101、上述过程区别于红细胞在37℃条件下单纯被动自发释放囊泡：当体系不加入chol-ss-pba，仅采用相同恒温孵育条件处理完整红细胞，仅能得到极低产量的天然自发囊泡；在引入chol-ss-pba预修饰后，囊泡生成产量显著提升。由此证明，本发明的恒温出芽不是被动等待红细胞自然释放囊泡，而是chol-ss-pba分子改造膜理化性质，协同温度条件主动诱导膜出芽脱落。

102、本发明的有益效果为：

103、本发明至少具有如下有益效果：

104、1、本发明采用完整红细胞原位预修饰、原位出芽成型工艺，区别于传统裂解血影膜后修饰方式，大幅提升囊泡表面修饰效率，解决了现有技术修饰结合效率低、功能负载不足的缺陷。

105、2、本发明采用梯度差速离心纯化体系，有效去除膜碎片与残留杂质，所得囊泡粒径均一、分散性好、理化性质稳定，显著提升产物纯度与制剂均一性。

106、3、本发明引入chol-ss-pba二硫键氧化还原响应结构，使囊泡具备病灶微环境可控释药特性，可在肝纤维化部位响应释放功能分子，靶向治疗能力更强。

107、4、本发明通过红细胞囊泡载体与epo功能分子、响应型修饰基团的协同作用，有效改善游离药物代谢快、富集弱、单纯载体无药效的问题，可显著抑制肝脏炎症、减少胶原沉积、阻断tgf-β/smad纤维化通路，高效逆转慢性肝纤维化损伤，治疗效果显著优于现有技术。

108、此外，基于本发明的情况：

109、1.基于实施例1和对比例1-3的对比，本发明采用完整红细胞原位预修饰、温控原位出芽、梯度差速离心纯化、胆固醇-苯硼酸-二硫键-epo复合物修饰等的组合，取得了修饰效率高、具备病灶氧化还原响应释药能力、体内高效干预慢性肝纤维化的新的技术效果。组合后的技术效果比每个技术手段效果的总和更优越。

110、2、基于实施例1和对比例1-3的对比，本发明从现有技术公开的红细胞囊泡宽泛制备思路中，有目的地选出现有技术中未提到的完整活红细胞先预修饰再温控原位出芽成型的窄范围工艺路径，取得了预料不到的技术效果：兼顾高表面修饰效率与囊泡膜结构完整性，实现肝纤维化病灶氧化还原可控释药，在相同给药条件下，实现更强的抑制肝损伤、减少胶原沉积、下调纤维化通路分子表达的体内抗肝纤维化效果。