聚乙二醇表面改性的明胶/磷酸钙复合微球及其制备方法和应用

本发明涉及生物医用材料，尤其涉及一种聚乙二醇表面改性的明胶/磷酸钙复合微球及其制备方法和应用。

背景技术：

1、微球类生物材料因具有较大的比表面积、可注射性和便于填充不规则缺损等优点，在创伤止血和组织修复领域具有广泛应用前景。明胶来源丰富，生物相容性好，可降解，且含有丰富的氨基、羧基等活性基团，是制备生物医用微球的常用天然高分子材料。然而，单一明胶微球的机械稳定性不足、功能单一，在大量出血或复杂创面环境中止血能力有限。

2、β-磷酸三钙（β-tcp）是一种具有良好生物相容性和成骨活性的无机生物活性材料，将其引入明胶微球有助于增强微球结构稳定性并赋予材料一定的骨修复潜力。

3、现有止血粉末材料多依赖物理吸液浓缩或被动激活凝血级联的机制，缺乏对血液组分的主动化学识别与交联能力，导致在湿润大量出血环境中止血效率不足，且血凝块与创面结合不牢固，易被血流冲散。

4、聚乙二醇多臂活性酯衍生物（如四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯，4arm-peg-nhs）的nhs酯基团能够在生理条件下与含伯氨基（-nh2）的分子发生快速酰胺化共价偶联。若将其引入微球表面，则微球接触血液时可与红细胞、血小板、血浆蛋白等含氨基血液组分原位共价交联，形成三维血凝胶网络，从而将传统认知中对止血材料产生干扰的血液环境，转化为增强材料性能的协同因素。

5、现有技术中，虽已有采用聚乙二醇活性酯类材料用于组织粘合或密封的报道，但其多以水相体系配制、活性酯基易水解失活，且未与兼具止血与骨修复功能的明胶/β-磷酸三钙复合微球基体相结合，难以同时满足湿润出血环境下的快速止血、创面牢固粘附与骨缺损修复的多重需求。

技术实现思路

1、为克服上述技术的不足，本发明的目的在于提供一种聚乙二醇表面改性的明胶/磷酸钙复合微球及其制备方法和应用，解决现有止血材料在湿润出血环境中止血效率不足、与创面结合力弱以及功能单一等问题。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、一种聚乙二醇表面改性的明胶/磷酸钙复合微球，所述复合微球包括微球基体和包覆于所述微球基体表面的表面功能层，所述微球基体由明胶与磷酸钙复合形成，所述表面功能层由多臂聚乙二醇活性酯与所述微球基体表面的氨基共价反应形成，且所述表面功能层上保留未反应的活性酯基。

4、优选地，所述磷酸钙为β-磷酸三钙（tcp），其用量为明胶质量的10~50%。β-磷酸三钙在该比例范围内能同时保证微球成形性与成骨诱导活性，兼顾结构稳定性与生物功能性。

5、优选地，所述多臂聚乙二醇活性酯为四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯（4arm-peg-nhs），分子量为5~30kda，其在所述微球基体表面的包覆质量为所述微球基体质量的10~40%。该范围内的包覆层能在微球表面提供足量活性nhs基团，接触血液后迅速与含氨基血液组分共价交联，形成稳定血凝胶，显著缩短凝血时间并增大血凝块质量。

6、优选地，所述复合微球的平均粒径为200~400μm，溶胀比≥300%，吸液倍率≥200%。该粒径范围使微球具备良好的填充性，溶胀吸液能力保证微球接触血液后快速膨胀、浓缩局部血液组分，配合表面nhs共价交联，实现物理与化学双重促凝。

7、本发明还提供上述聚乙二醇表面改性的明胶/磷酸钙复合微球的制备方法，包括以下步骤：

8、1）将明胶溶于水中，加入磷酸钙，搅拌混合，获得悬液；

9、2）将所述悬液加入含乳化剂的油相体系中进行乳化，并低温固化，得到微球；

10、3）收集微球，洗涤，冻干，热交联，得到作为微球基体的明胶/磷酸钙微球；

11、4）将多臂聚乙二醇活性酯与所述明胶/磷酸钙微球混合，加入增塑剂，于无水条件下加热使多臂聚乙二醇活性酯与微球基体表面氨基发生共价偶联，且保留部分未反应的活性酯基，得到所述复合微球。

12、优选地，步骤1）中，所述明胶溶于水后的浓度为0.2~0.3g/ml，磷酸钙的加入量为明胶质量的10~50%，明胶溶解温度为55~65℃。该温度范围保证明胶完全溶解，避免过高温度引起明胶降解。

13、优选地，步骤2）中，所述乳化剂为span-80；所述油相体系包括质量比为30~50：1的液体石蜡与乳化剂；所述悬液与所述油相体系的体积比为1~5：1；所述乳化过程中，搅拌速度为250~350r/min，乳化时间为10~20min，低温固化温度为0~10℃。乳化搅拌速度决定微球粒径，在该范围内可调控粒径至200~400μm，低温固化使微球在不添加化学交联剂的条件下快速成形，保持明胶活性基团完整。

14、优选地，步骤3）中，微球收集过程包括采用醇类絮凝剂絮凝后抽滤；所述热交联在真空干燥箱中进行，热交联温度为140~180℃，热交联时间为6~12h。热交联在去除溶剂的同时使明胶分子间氨基与羰基形成共价键，显著提升微球力学强度和耐水稳定性。醇类絮凝剂可选为异丙醇。

15、优选地，步骤4）中，所述增塑剂为1,2-丙二醇，其加入量为偶联体系总质量的5~15%；所述多臂聚乙二醇活性酯的加入量为所述明胶/磷酸钙微球的20~60%；加热温度为60~70℃，加热时间为3~8min。1,2-丙二醇作为无水增塑剂，避免水相环境中nhs酯水解失活，同时降低熔融涂层体系黏度，保证peg活性酯在微球表面均匀铺展，提高包覆均一性和反应效率。

16、本发明还提供上述复合微球在制备止血或骨修复产品中的应用。

17、相比于现有技术，本发明的有益效果为：

18、本发明的一种聚乙二醇表面改性的明胶/磷酸钙复合微球及其制备方法和应用，通过将明胶/磷酸钙复合微球表面采用聚乙二醇改性，既保留了明胶良好的生物相容性和可加工性，又引入了磷酸钙的无机增强和生物活性，提高了材料的结构稳定性和组织修复潜力，还在微球表面形成稳定的聚乙二醇功能层，改善材料表面特性和使用稳定性，使得微球兼具物理吸液浓缩与表面nhs基团共价交联血液含氨基组分的双重促凝机制，体外凝血快、血凝块与创面结合牢固，具有止血效率高、工艺简单、操作方便、制备条件温和的优点，适于规模化制备。

19、本发明具有双重促凝机制，微球基体吸液膨胀与表面nhs共价交联协同作用，接触血液后15s内即可形成稳定血凝胶，凝血效率指数（cei）为市售阳性对照止血粉（记为ym）的20倍。

20、本发明中表面功能层可与血液中含氨基成分发生交联，形成血凝胶，从而缩短凝血时间、增大血凝块质量并提高止血效率。

21、本发明具有优异组织粘附性，其中nhs酯基团与创面含氨基组织成分共价结合后的剪切强度达25.35kpa，爆破压力约145mmhg，高于人体正常动脉收缩压（约120mmhg），有效防止血凝块被血流冲散。

22、本发明兼顾骨修复功能，其中β-磷酸三钙赋予材料成骨诱导活性，大鼠颅骨缺损模型术后8周新生骨体积分数（bv/tv）达48.79%，显著高于空白对照组的2.42%。

23、本发明采用干粉熔融包覆工艺，共价偶联过程采用无水干粉熔融体系，规避水相中nhs酯水解失活问题，包裹率可达55~71%，工艺简单，适于规模化生产。