一种多材料、多细胞体积生物打印方法

本发明涉及生物打印，具体涉及一种多材料、多细胞体积生物打印方法。

背景技术：

1、生物3d打印是操纵含细胞墨水以增材制造方式构建活性结构的重要技术手段，其中体积生物打印（volumetricbioprinting，vbp）作为近年来兴起的一体式成型技术，能够在数s至数min内完成厘米级三维结构的构建，具有成型速度快、细胞损伤小等显著优势。然而，现有体积生物打印技术在实际应用中仍面临一个核心瓶颈--当前适配于vbp的生物墨水体系主要局限于单一材料体系，难以实现多材料、多细胞的空间分区与同步打印。天然组织普遍呈现出各向异性的异质结构，其构建往往需要多种生物材料和细胞类型的协同整合，而单一体积打印材料体系无法满足这一需求，这极大地限制了体积生物打印技术在复杂组织/器官构建中的应用拓展。

2、在现有体积生物打印技术方案中，中国专利申请cn202410511464.2公开了一种适用于体积生物打印的低浓度丝素蛋白/甲基丙烯酰化明胶生物墨水及制备方法，其技术方案包含甲基丙烯酰化明胶（gelma）、丝素蛋白（sf）、钌吡啶络合物/过硫酸钠引发剂和溶剂，其中丝素蛋白的质量百分比为0.5%-1.25%，gelma的质量百分比为0.6%-20%。该发明的核心目的在于解决低浓度丝素蛋白墨水在体积打印过程中因粘度过低而发生沉降、从而导致打印制品形变及分辨率下降的问题。然而，该技术方案始终围绕单一墨水体系展开，其追求的是墨水的单相均质稳定，并未涉及任何多材料体系的构建，也未提及水相分离现象在多材料打印中的应用可能性。换言之，该技术方案只能在单一材料、单一细胞类型的框架下进行体积打印，无法实现多材料分区、多细胞定向分布等复杂异质结构的构建。

3、中国专利申请cn202610136513.8公开了一种3d打印复合生物墨水及生物支架，其将柞蚕丝素蛋白（tsf）、甲基丙烯酰化明胶（gelma）和纳米羟基磷灰石（nha）三种材料进行复合。然而，该技术方案的应用场景为挤出式3d打印制备骨修复支架，其交联方式为初级光交联、次级乙醇浸泡、三级钙离子处理的分步后处理工艺，完全不涉及体积光固化一体成型，也未采用水相分离机制实现材料自发分区，层间界面稳定性差，且挤出式打印过程中喷嘴的剪切力会显著降低细胞活性。除了上述专利文献外，传统的多材料逐层打印技术（如挤出式、喷墨式生物打印）虽然能够实现多种材料的空间分布，但逐层堆积的方式不可避免地带来界面扰动、交叉污染、打印时间长等固有问题，无法兼具体积生物打印的高效一体化成型优势。因此，如何在体积生物打印中实现多材料、多细胞的高精度三维结构构建，同时保证不同材料界面的稳定性与结构的完整性，仍是当前本领域亟待解决的技术难题。

技术实现思路

1、为了解决上述技术难题，本发明利用不同光交联水凝胶溶液之间的双水相分离特性，使其在液态下自发形成具有清晰相界面的空间分区结构；随后，通过光交联固化这一空间分区结构。具体的，本发明提供了一种多材料、多细胞体积生物打印方法，包括以下步骤：

2、墨水配制与细胞负载：提供至少两种光交联水凝胶溶液，所述至少两种光交联水凝胶溶液具有热力学驱动的双水相分离特性；将不同种类的目标细胞分别悬浮于所述至少两种光交联水凝胶溶液中，对应制备得到至少两种载细胞生物墨水；

3、自发空间分区：将所述至少两种载细胞生物墨水依次注入打印容器中，静置，利用所述双水相分离特性使各载细胞生物墨水自发形成具有清晰相界面的空间分区结构；

4、一体化光固化成型：采用体积生物打印技术，以单次光辐射模式对所述打印容器内的所述空间分区结构进行同步光交联固化；

5、其中，所述一体化光固化成型步骤中，根据不同材料对光源的吸收和散射特性差异，分别设定各材料分区的光衰减补偿系数，使得光路穿透后各材料分区内部实际接收到的光照剂量均达到各自完全交联所需的能量阈值。

6、优选地，所述至少两种光交联水凝胶溶液选自以下组中的任意两种或更多种：丝素蛋白溶液（sf）、甲基丙烯酰化明胶溶液（gelma）、甲基丙烯酰化葡聚糖‌溶液（dexma）；上述材料彼此间具有水相分离相容性，能够在水相体系中自发形成稳定界面；其中，甲基丙烯酰化明胶和甲基丙烯酰化葡聚糖‌各自分子链上含有光敏性甲基丙烯酰基团，可在光引发剂存在下通过自由基聚合实现交联固化，丝素蛋白分子链上富含酪氨酸残基，可在钌/过硫酸钠光引发体系催化下通过光氧化交联形成二酪氨酸共价键实现固化。

7、优选地，所述至少两种光交联水凝胶溶液包括3%-4%w/v丝素蛋白溶液、5%-7%w/v甲基丙烯酰化明胶溶液和8%-10%w/v甲基丙烯酰化葡聚糖‌溶液；其中丝素蛋白的重均分子量为50-120kda；甲基丙烯酰化明胶的重均分子量为60-100kda，其甲基丙烯酰化取代度ds为0.4-0.8；甲基丙烯酰化葡聚糖‌的重均分子量为20-70kda，其甲基丙烯酰化取代度ds为0.3-0.6。在上述浓度范围内，三种材料能够在静置条件下形成清晰、稳定的三层空间分区结构，层间界面清晰且不发生相互扩散。

8、更优选地，所述至少两种光交联水凝胶溶液包括4%w/v丝素蛋白溶液、5%w/v甲基丙烯酰化明胶溶液和8%w/v甲基丙烯酰化葡聚糖‌溶液的浓度；其中丝素蛋白的重均分子量为80kda；甲基丙烯酰化明胶的重均分子量为100kda，其甲基丙烯酰化取代度ds为0.6；甲基丙烯酰化葡聚糖‌的重均分子量为50kda，其甲基丙烯酰化取代度ds为0.5。该特定组合为经过浓度梯度筛选实验确定的最优配比，在此条件下三层材料的分层效果最佳，结构强度与界面稳定性达到最优平衡。

9、优选地，所述一体化光固化成型步骤采用绿光体积生物打印，光固化光源波长为492-577nm，优选光源波长525nm；打印时，各层材料的打印光强独立地为60-80mw/cm2，打印时间独立地为50-70s。绿光相较于近紫外光具有更深的组织穿透深度和更低的细胞光毒性，能够在不损伤负载细胞活性的前提下实现毫米级厚度材料的一体化光固化交联；492-577nm的波长范围覆盖了可见光绿光全波段，确保了与钌/过硫酸钠光引发体系吸收光谱的有效匹配。

10、优选地，所述至少两种光交联水凝胶溶液在打印容器中自发形成空间分区结构后，进行体积生物打印之前，还包含分层稳定性评估步骤：在所述至少两种光交联水凝胶溶液中分别添加不同颜色的荧光标记物，静置至少2h后，对固化后的分层结构进行荧光显微观察，以确认各材料层之间的界面清晰度。该步骤作为打印前的质量控制手段，能够直观评估分层界面的稳定性和材料间的相容性，确保每次打印前墨水体系处于最佳分层状态，提高打印成功率。

11、优选地，所述不同种类的目标细胞包括人永生化角质形成细胞、人真皮成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞或脂肪来源干细胞中的至少两种；所述不同种类的目标细胞在所述空间分区结构中按材料层对应分布，实现不同目标细胞的空间定位，各材料层中细胞密度独立地为1×106-5×106个/ml。上述细胞类型涵盖了皮肤组织中表皮层、真皮层和皮下组织的主要细胞组成，能够满足血管化人工皮肤模型构建的细胞需求；1×106-5×106个/ml的密度范围可确保打印后材料内部细胞分布均匀且具有足够的细胞间相互作用（例如信号传导），有利于细胞在材料中存活和功能表达；各材料层负载不同细胞种类的设计可实现组织-细胞空间分布的仿生模拟。

12、优选地，所述光交联水凝胶溶液中还含有光引发剂，所述光引发剂为钌/过硫酸钠体系，包括氯化三（2,2'-联吡啶）钌（ii）和过硫酸钠。该光引发体系在可见光区具有宽带吸收特性，在绿光波段（492-577nm）具有良好的激发响应能力，能够在绿光体积打印的光照条件下有效引发光交联反应；同时该体系还具有良好的生物相容性和水溶性，可在含细胞体系中使用而不产生显著细胞毒性。

13、优选地，所述打印容器的材质为硼硅酸玻璃。硼硅酸玻璃材质具有优异的光学透过性（对绿光透光率≥92%）和化学惰性，能够有效避免打印容器对入射光路的散射和吸收，保证体积打印的光场能量分布均匀性。

14、有益效果在于：

15、1、突破单一材料瓶颈，实现体积生物打印的多材料、多细胞同步构建。

16、现有体积生物打印技术始终局限于单一墨水体系，无法满足天然组织异质结构的构建需求。本技术将水相分离原理与体积生物打印技术进行深度整合，利用多种光交联水凝胶溶液之间的双水相分离特性，使其在打印容器中自发形成具有清晰界面的空间分区结构，并结合体积生物打印一体化成型优势，在同一打印容器的一次成型工序内同步完成多材料空间布局与多细胞定向负载，从根本上突破现有体积生物打印技术只能打印单一材料的技术范式，为天然复杂异质三维组织模型，提供多材料精准仿生构建路径。

17、2、通过水相分离与一体化成型的协同机制，显著提升多材料界面的稳定性。

18、传统逐层打印技术构建多材料结构时，每堆积一层新材料均会对已成型层施加物理挤压或界面扰动，导致层间界面模糊、材料相互扩散甚至结构坍塌。本技术从以下两方面解决上述问题：一方面利用水相分离的热力学自发过程，不同水凝胶溶液之间形成具有明确界面能的稳定分区，从材料化学本质上抑制界面混合与扩散；另一方面采用体积生物打印的一体化成型方式，避免对分层界面的反复物理扰动。二者协同作用使得多材料结构的界面清晰度和结构完整性。

19、3.实现多细胞在三维空间中的仿生定向分布，细胞相容性优异。

20、本发明通过在不同材料层中分别负载不同类型的细胞，借助水相分离的空间分区特性，实现不同类型细胞在三维空间中与天然组织空间排布相一致的精准定向分布。实验数据表明，打印后细胞在培养第7天时各层细胞存活率均保持在86%以上，且在7天培养期内能够持续增殖，证明材料体系具有良好的细胞相容性，能够支持负载细胞的长期存活和功能表达，可为构建具有生理功能的人工组织模型提供关键技术支撑。

21、4.打印效率高、细胞损伤小。

22、相较于逐层打印技术通常需要数十分钟至数小时的打印时长，本技术采用的体积生物打印技术在50-70s内便可完成三维结构的构建，打印效率得到大幅提升。短时打印可大幅降低细胞在体外非生理环境中的暴露时间，减少累积性的光/热/力学损伤。同时，绿光光源相较于传统近紫外光固化方式具有更低的细胞光毒性，进一步保障打印后细胞维持高活性状态。

23、5.材料体系兼容性强，工艺窗口宽，可灵活适配不同组织构建需求。

24、本技术所采用的水相分离策略对材料组合具有广泛的兼容性，sf、gelma、dexma等多种光固化水凝胶材料均可适用。通过调节材料的浓度、分子量等参数，可以灵活调控分层效果和界面特性。较宽的工艺窗口使得本方法可根据不同目标组织的结构特点和力学需求进行个性化调整，满足血管化皮肤、组织修复支架、器官模型等多种应用场景的构建需求。