一种含PLGA-PEG的核酸脂质纳米颗粒及其制备方法和应用

本发明属于但不限于核酸递送与纳米药物制剂，尤其涉及一种含plga-peg的核酸脂质纳米颗粒、其制备方法以及其在降低给药后急性炎症反应和口腔黏膜损伤修复中的应用。

背景技术：

1、核酸药物可通过在靶细胞内表达蛋白或调控基因表达实现治疗作用，但裸核酸在体液中容易降解，且难以直接穿过细胞膜。脂质纳米颗粒能够对核酸进行包载保护，并促进细胞摄取和胞质递送，已成为mrna和sirna的重要非病毒递送体系。

2、经典核酸脂质纳米颗粒通常包括离子化脂质、辅助磷脂、胆固醇和peg脂质四类组分。以sm-102为离子化脂质的常用配方可采用sm-102/dspc/胆固醇/dmg-peg约为50/10/38.5/1.5的摩尔比。peg脂质含量虽低，但会影响颗粒尺寸、胶体稳定性、体内蛋白吸附、组织分布和核酸表达。不同peg锚定链结构或含量可明显改变核酸脂质纳米颗粒的体内性能。

3、对于疫苗，适度先天免疫激活可发挥佐剂作用；但对于蛋白替代、基因编辑和组织修复等非疫苗用途，过强的急性炎症可能增加全身不良反应并限制给药剂量。因此，在保持核酸包封和体内表达的同时降低促炎细胞因子释放，是核酸脂质纳米颗粒优化的重要方向。

4、plga及plga-peg已被用于聚合物纳米颗粒、plga-peg/pei核酸颗粒或聚合物-脂质杂化颗粒。现有方案多以plga形成聚合物核心，或采用额外阳离子聚合物、特殊脂质构建杂化结构，其结构、制备工艺和组分比例与经典四组分mrna脂质纳米颗粒不同。

5、另一方面，vegf编码mrna经脂质纳米颗粒递送已被用于皮肤创面修复，说明局部表达促血管生成因子具有治疗潜力。但口腔黏膜长期受到唾液冲刷、机械摩擦及复杂微环境影响，其局部递送条件与皮肤不同，仍需要能够形成稳定颗粒并实现局部核酸表达的制剂体系。

6、现有核酸脂质纳米颗粒的客观技术路线通常是在酸性水相中使带正电的离子化脂质与核酸接触，并在快速混合过程中与辅助磷脂、胆固醇及peg脂质共同形成纳米尺度的包载结构；随后通过去除有机溶剂和置换缓冲液获得适于给药的分散体系。该路线能够兼顾核酸包载和规模化制备，但其颗粒形成和体内表现受到peg锚定结构、peg含量、脂质组成、蛋白吸附和给药途径共同影响。2025年的相关研究比较了peg脂质含量、脂肪链长度以及peg与脂质之间的连接方式，进一步说明低含量表面组分并非只承担简单的亲水屏蔽作用，而会改变颗粒性质和体内递送表现。

7、已有研究还表明，部分用于临床前疫苗研究的mrna脂质纳米颗粒在小鼠体内可诱发中性粒细胞浸润以及多种炎症细胞因子和趋化因子反应。该类炎症反应在疫苗场景中可能具有佐剂意义，但在需要重复给药、蛋白替代或组织修复的场景中会压缩治疗窗口。因而，如何调整表面稳定组分而不破坏核酸包封和胞内表达，是区别于单纯提高转染信号的另一技术要求。

8、现有文献也通过改变脂质结构、胆固醇或辅助组分来调节核酸脂质纳米颗粒的器官分布和mrna表达，说明四组分体系中任一组分的替换都可能同时影响自组装、粒径、体内分布和表达结果。然而，改变peg脂质的脂肪链或连接键并不能直接证明可降解的plga-peg能够作为经典sm-102脂质纳米颗粒的表面稳定组分。以plga衍生物和脂质形成的杂化纳米颗粒通常具有聚合物参与的核心或复合结构，plga-peg/pei纳米颗粒也具有不同的聚合物/pei组成和制备路径，均不能直接给出本发明的替换关系。以vegf mrna脂质纳米颗粒促进皮肤创面修复的研究能够说明促血管生成mrna的递送价值，但口腔黏膜的冲刷、摩擦和局部组织环境使其不能直接等同于皮肤创面。

9、经典sm-102脂质纳米颗粒（以下简称dmg-lnp）制备成熟，具有较好的核酸包封和肝脏表达效率，但不能直接预期将dmg-peg更换为plga-peg后仍可形成性能良好的脂质纳米颗粒。现有peg脂质替换或含量优化方案主要改变peg脂质的脂肪链长度、连接键或peg含量，未直接证明以plga-peg作为经典四组分sm-102脂质纳米颗粒的表面稳定组分可降低急性tnf-α和il-6。现有plga或plga-peg核酸纳米载体多为聚合物核心、pei复合物或脂质-聚合物杂化颗粒，其核心结构和配制方法与用少量plga-peg替换dmg-peg的方案不同。已有vegf mrna创面修复方案主要针对皮肤或糖尿病创面，也未解决口腔黏膜局部递送问题。

10、因此，现有技术需要解决的核心技术问题是：在不改变sm-102、辅助磷脂和胆固醇形成核酸脂质纳米颗粒的基本自组装和核酸包载逻辑的情况下，以可降解的plga-peg部分或全部替代dmg-peg，使所得颗粒仍保持高核酸包封和较高体内表达，同时降低静脉给药后的tnf-α和/或il-6释放，并进一步满足vegf mrna在口腔黏膜损伤区域的局部递送和修复需求。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明提供一种以plga-peg作为表面稳定组分的核酸脂质纳米颗粒（以下简称plga-lnp），通过在sm-102、辅助磷脂和胆固醇构成的脂质体系中部分或全部替代dmg-peg，使核酸被包载在可形成的纳米颗粒中；本发明还提供与该颗粒相适配的有机相/酸性核酸水相快速混合和缓冲液置换制备方法，以及该颗粒在降低给药后急性炎症反应和口腔黏膜损伤修复中的应用。

2、本发明提供一种核酸脂质纳米颗粒，包括sm-102、辅助磷脂、胆固醇、plga-peg以及被包载的核酸。所述辅助磷脂优选为dspc。plga-peg作为所述核酸脂质纳米颗粒的表面稳定组分，能够部分或全部替代传统dmg-peg；在全部替代时，颗粒的脂质组分仍由sm-102、dspc、胆固醇和plga-peg构成，核酸被包载于由上述组分形成的颗粒结构中。

3、按sm-102、辅助磷脂、胆固醇和plga-peg的总摩尔量计，sm-102为35～65mol%，dspc为5～20mol%，胆固醇为25～50mol%，plga-peg为0.1～5mol%。在一优选实施方式中，sm-102为45～55mol%，dspc为8～12mol%，胆固醇为35～42mol%，plga-peg为0.5～3mol%。在一更优选实施方式中，sm-102、dspc、胆固醇和plga-peg的摩尔比为50:10:38.5:1.5，且plga-peg全部替代dmg-peg。

4、所述plga-peg为plga链段和peg链段构成的嵌段共聚物。plga链段用于提供疏水锚定和可降解特性，peg链段用于提供亲水表面。在一直接验证的实施方式中，plga链段的分子量约为2kda，peg链段的分子量约为2kda；plga链段中乳酸与羟基乙酸的比例、末端基团和精确分子量可根据颗粒形成及体内用途在有依据的范围内选择。

5、所述核酸包括mrna、circrna、sirna、mirna、反义寡核苷酸、dna或其组合。所述mrna可编码荧光素酶、vegf、egf、fgf、pdgf、抗体、细胞因子、酶或其他治疗性蛋白。核酸可含有帽结构、5′utr、编码区、3′utr和poly(a)尾，并可含有n1-甲基假尿苷等修饰核苷。当前实施方式中，核酸包括荧光素酶mrna和vegf mrna。

6、在采用plga-peg为1.5mol%且全部替代dmg-peg的实施方式中，所得plga-lnp的平均粒径为约108nm，pdi为0.18，zeta电位约为28mv，核酸包封率为99.5%，所述包封率数据为3次独立制备和检测结果。相应dmg-lnp对照的平均粒径为68nm，pdi为0.21，zeta电位为29mv，核酸包封率为98.2%。所述数据表明，plga-peg替换后仍能形成类球形纳米颗粒并保持较高核酸包封能力；上述实测数值用于说明直接验证的实施方式，不构成对所有实施方式的额外必要限定。

7、本发明还提供一种核酸脂质纳米颗粒的制备方法，包括：将sm-102、dspc、胆固醇和plga-peg溶于乙醇形成有机相；将待包载核酸溶于酸性缓冲液形成水相；使所述有机相和水相快速混合，使sm-102在酸性环境中与核酸结合并发生纳米颗粒自组装；以及在混合后去除乙醇并将体系置换至生理相容缓冲液。快速混合可采用微流控混合、t形混合、撞击射流或其他能够形成可重复快速混合的方式。

8、在一实施方式中，水相的ph为3.0～5.0，优选约为4.0；有机相与水相的体积比为1:2～1:5；总脂质浓度为5～30mm；n/p摩尔比为3:1～10:1；混合温度为15～30℃。实际工艺参数可根据核酸种类、脂质浓度、混合方式和目标颗粒性质在上述范围内确定，未对具体设备流速、流速比或最终浓度作无依据限定。

9、所述去除乙醇和缓冲液置换可通过透析、超滤、切向流过滤或尺寸排阻实现。根据制剂要求，缓冲液置换后还可进行浓缩、无菌过滤，加入蔗糖或海藻糖等保护剂，并在低温条件下保存。

10、本发明还提供plga-lnp在制备用于降低核酸脂质纳米颗粒给药后急性炎症反应的制剂中的应用。所述应用包括：以plga-peg部分或全部替代dmg-peg形成含核酸的sm-102脂质纳米颗粒；将所述颗粒以预定核酸剂量给予动物或受试者；以及在保持核酸表达的同时，与采用dmg-peg的相同核酸剂量对照相比，降低血清tnf-α和/或il-6水平。给药途径可包括静脉、肌肉、皮下、皮内、鼻腔、口腔黏膜或创面局部给药，当前直接数据主要支持首次静脉给药后的初步炎症降低。

11、本发明还提供负载vegf mrna的含plga-peg核酸脂质纳米颗粒在制备用于口腔黏膜损伤修复的制剂中的应用。所述制剂局部施用于口腔溃疡、黏膜创面或其他口腔软组织损伤区域，使局部细胞摄取所述颗粒并表达vegf，从而促进血管生成、上皮修复和创面闭合。

12、结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的积极效果、显著进步及预料不到技术效果为：

13、本发明通过仅改变经典sm-102脂质纳米颗粒的表面稳定组分，将plga-peg引入并部分或全部替代dmg-peg，在不改变sm-102、dspc和胆固醇的核心组合关系的情况下形成核酸脂质纳米颗粒，降低了对全新聚合物核心或peg复合结构的依赖。

14、本发明的plga-peg核酸脂质纳米颗粒能够在直接验证的配方中保持类球形颗粒形貌、约100nm量级粒径和较窄粒径分布，并获得99.5%的核酸包封率，说明plga-peg替换没有破坏酸性条件下的核酸结合和颗粒自组装结果。

15、本发明的plga-lnp核酸脂质纳米颗粒在1μg mluc体内成像条件下仍产生明显荧光素酶表达信号，plga-lnp的roi信号为1.761×10^7、约为dmg-lnp的77.7%，在直接验证范围内保留了较高水平的体内核酸递送与表达能力。

16、本发明的plga-lnp在10μg核酸lnp静脉给药后4h的混合血清描述性检测中，tnf-α和il-6相对于dmg-lnp分别降低约68.9%和57.7%，从而在保留核酸表达的同时为降低急性促炎细胞因子释放提供了直接支持；所述结果不作显著性检验或最终安全性结论。

17、本发明将负载vegf mrna的plga-lnp用于口腔黏膜局部给药，能够在口腔溃疡模型中观察到创面随时间缩小和黏膜恢复趋势，为核酸脂质纳米颗粒在口腔软组织损伤中的局部递送提供了应用路径。

18、（1）本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：在现有sm-102四组分脂质纳米颗粒制备路线中以plga-peg替换dmg-peg，保留既有快速混合、包载和缓冲液置换的工艺主线，并同时面向低急性炎症递送和口腔黏膜修复场景，具有沿用既有制备路线进行配方开发的技术基础。

19、（2）本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：

20、（3）lnp的体内炎症剧烈是限制其应用的一大问题，特别是在类似体内car-t等免疫治疗方面，lnp本身的炎症反应会导致细胞因子风暴，我们通过替换表面peg脂质可有效降低相应的炎症水平，提高安全性；