抗噬菌体菌株的制作方法

本发明涉及对噬菌体具有改善抗性（即改善的噬菌体抗性）的乳酸菌菌株，包含这些菌株的组合物如发酵剂，以及包含这些菌株的发酵产品。

背景技术：

1、食品工业在发酵食品的生产中使用许多细菌，特别是乳酸菌（lab）。lab的选择影响发酵食品产品的特性和特征，例如风味、质构和保质期。在乳品工业中，lab被广泛使用，用以产生牛奶的酸化（通过发酵），同时也用以向其中并入乳酸菌的产品提供质构。

2、嗜热链球菌（streptococcus thermophilus）是在全世界范围作为发酵剂用于发酵食品（如奶酪和酸奶）的生产中的最常见细菌之一。这种微生物是一种嗜热的、耐氧的、革兰氏阳性的球菌，并且属于乳酸菌这一异质类群的成员。嗜热链球菌在乳品工厂中通过在大发酵罐中培养的广泛使用，使其更易受噬菌体感染。实际上，噬菌体暴发是发酵缓慢或异常的主要原因，经常导致乳制品品质下降和生产成本不理想。已从工业所使用的许多细菌菌株中鉴定出噬菌体（bacteriophage，英文简称phage），这些菌株为例如乳球菌属（lactococcus sp.）菌种、乳杆菌属（lactobacillus sp.）菌种、明串珠菌属（leuconostocsp.）菌种、片球菌属（pediococcus sp.）菌种或链球菌属（streptococcus sp.）菌种。

3、噬菌体的裂解性生命周期涉及噬菌体吸附至宿主细胞表面、噬菌体dna注入细胞中、噬菌体蛋白质的合成、噬菌体dna的复制、子代噬菌体的装配以及子代噬菌体从宿主释放。细胞介导的对这些事件中任一事件的干扰机制可阻止噬菌体感染。细菌培养物在工业使用期间抵抗噬菌体感染的能力在很大程度上取决于影响上述机制中一个或多个的宿主菌株特征。

4、一种可能导致乳酸菌发酵剂中频繁噬菌体感染的因素是如下事实：食品工业（包括乳品工业）中的发酵条件通常是非无菌的。已采取多种措施以尽量减少乳品环境中的噬菌体感染。主要方法包括用于设备消毒的化学和物理方法，以及培养物替换和菌株轮换方案。后者需要具有相同工艺技术性能但不同噬菌体敏感性的菌株。因此，已广泛进行乳品发酵剂中所用菌株的噬菌体不敏感突变体（bim）的分离和表征。已经提出了几种用于产生嗜热链球菌bim的方法，包括插入诱变、二次培养方法、在高噬菌体滴度存在下的连续传代、化学诱变，以及用产生反义mrna的质粒进行转化。一般而言，所获得的抗性是由于细胞内抗性机制的激活，主要是成簇规律间隔短回文重复（crispr）-cas系统或限制-修饰（r-m）系统。在嗜热链球菌中也检测到了额外的噬菌体抗性系统，如流产感染（abi）和超感染排斥（sie）。然而，这些机制可能分布并不广泛，因此，它们通常不介导乳品菌株bim中的噬菌体抗性。

5、在当前工业条件下，尚不可能消除噬菌体污染。为了满足工业的要求，已经有必要开发嗜热链球菌的新型抗噬菌体菌株。因此，希望开发新型菌株，这些菌株对噬菌体具有抗性且适用于提供具有良好质构的发酵食品产品的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供嗜热链球菌菌株的抗噬菌体突变体，其具有改善的噬菌体不敏感性和稳健性。本发明的诸位发明人已经提供了嗜热链球菌种的乳酸菌，这些乳酸菌比它们所衍生自的（母）菌株更抗噬菌体攻击。当用于乳发酵时，这些菌株还提供相似或改善的特性，如酸化时间缩短，以及以剪切应力和/或凝胶硬度来测定的质构提高，与用其母菌株或现有技术中的发酵剂产生的发酵乳相比。

2、在第一方面，本披露提供了由嗜热链球菌种的母菌株衍生的抗噬菌体乳酸菌菌株，其中该菌株 (a) 对一种或多种选自dsm 35003 chpc869、dsm 35011 chpc1230和dsm35012 chpc1636的噬菌体具有抗性，该母菌株对该一种或多种噬菌体敏感，并且 (b) 与母菌株相比，在所述一种或多种噬菌体存在下，使乳基的酸化更快。

3、在第二方面，本披露提供了包含该菌株的组合物。

4、在第三方面，本披露提供了用于生产发酵产品的方法，其包括以下步骤：

5、(a)将该菌株或该组合物添加至乳基中；以及

6、(b)在约22°c与约45°c之间的温度下发酵该乳基，直至ph达到4.6或低于4.6。

7、在第四方面，本披露提供了发酵产品，其包含该菌株、该组合物，或通过该方法获得。

8、在第五方面，本披露提供了食品或饲料产品，其包含该菌株、该组合物，或通过该方法获得。

1.一种由嗜热链球菌种的母菌株衍生的抗噬菌体乳酸菌菌株，其中所述菌株 (a) 对一种或多种选自dsm 35003 chpc869、dsm 35011 chpc1230和dsm 35012 chpc1636的噬菌体具有抗性，所述母菌株对所述一种或多种噬菌体敏感，并且 (b) 与所述母菌株相比，在所述一种或多种噬菌体存在下，使乳基的酸化更快。

2.根据权利要求1所述的菌株，其中在酸化开始后10小时和/或20小时测量时，所述菌株能够将包含所述一种或多种噬菌体的乳基酸化至ph低于5。

3.根据权利要求1-2所述的菌株，其中所述乳基是由干物质为9.5%的复原脱脂乳制成的b乳，所述复原脱脂乳已在99°c下煮沸30分钟。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的菌株，其中所述菌株在用所述菌株制造的发酵产品中提供提高的质构。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的菌株，其中所述母菌株是dsm 34993或dsm 34991。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的菌株，其中所述菌株是dsm 34995、dsm 34996或其突变体或变体。

7.一种组合物，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的菌株。

8.根据权利要求7所述的组合物，其作为混合物或作为成套组分，包含 i) 根据权利要求1-6中任一项所述的菌株；和 ii) 一种或多种属于与链球菌属不同属的另外的乳酸菌。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述一种或多种另外的乳酸菌所属的属为乳杆菌属、黏液乳杆菌属、乳酪乳杆菌属、联合乳杆菌属、乳植杆菌属、慢生乳杆菌属、广布乳杆菌属、伴生乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、片球菌属和/或双歧杆菌属。

10.根据权利要求8-9所述的组合物，其中所述一种或多种另外的乳酸菌是德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、干酪乳酪杆菌、副干酪乳酪杆菌和/或动物双歧杆菌。

11.根据权利要求7-10中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含冷冻保护剂、冻干保护剂、抗氧化剂和/或营养物。

12.根据权利要求7-11中任一项所述的组合物，其中所述组合物呈冷冻、喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥、风干、盘式干燥或液体形式。

13.一种用于生产发酵产品的方法，所述方法包括以下步骤：

14.根据权利要求13所述的方法，其中与用于生产用所述母菌株制成的发酵产品的酸化时间相比，用于生产所述发酵产品的酸化时间缩短。

15.根据权利要求13-14中任一项所述的方法，其中与用所述母菌株制成的发酵食品产品相比，所述发酵产品具有提高的质构。

16.一种发酵产品，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的菌株、根据权利要求7-12中任一项所述的组合物，或通过根据权利要求13-15中任一项所述的方法获得。

17.根据权利要求16所述的发酵产品，其中根据权利要求1-6中任一项所述的菌株以至少107 cfu/g的浓度存在。

18.根据权利要求16-17中任一项所述的发酵产品，其中所述产品是乳制品。

19.根据权利要求18中任一项所述的发酵产品，其中所述乳制品是酸奶、酪乳、开菲尔或奶酪如新鲜奶酪或帕斯塔菲拉塔奶酪。

20.一种食品或饲料产品，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的菌株、根据权利要求7-12中任一项所述的组合物，或通过根据权利要求13-15中任一项所述的方法获得。