颗粒、DNA和RNA的制作方法

颗粒、dna和rna
技术领域
1.本发明提供了用于治疗或预防病毒感染的颗粒(如病毒样颗粒(vlp))和非自身复制颗粒，以及使用此类颗粒治疗或预防受试者(如人或动物受试者)的病毒感染(或其症状)或降低其风险的方法。颗粒(例如vlp)在宿主细胞中与病毒竞争，从而减少病毒的复制或增殖。例如，本文的方法是一种减少动物，如家畜或野生动物(例如蝙蝠、骆驼科动物或鳞甲目(例如穿山甲))中病毒的人畜共患病群体或减少所述群体的建立的方法。


背景技术：

2.研究得最好的套式病毒(nidovirus)、冠状病毒(coronaviruses)和动脉炎病毒(arteriviruses)，采用独特的转录机制，其涉及不连续rna转录，该过程类似于相似性辅助的拷贝选择rna重组。在感染期间，多个亚基因组(sg)mrna从sg负链rna模板的镜像组转录。sg mrna都具有短的5
′
共同前导序列(l)，源自基因组rna的5
′
端。非连续“前导”(trs-l)和“主体”(trs-b)序列的连接可能发生在负链合成期间。对于所有套式病毒，基因组的5
′‑
most三分之二被复制酶多聚蛋白基因占据。在下游，有多个较小的基因，其由至多8个sg mrna的嵌套组表达。在动脉和冠状病毒的情况下，这些sg mrna是嵌合的并且与基因组的3
′‑
和5
′‑
共末端：它们都具有5
′
共同前导序列，其源自基因组rna的5
′
末端并融合至转录物的
‘
主体’(即携带编码信息的3
′
末端部分)。冠状病毒前导长度为55至92个核苷酸，而动脉炎病毒前导长度约为200个核苷酸。前导和mrna体序列连接在短的保守序列基序内，即转录调节序列(trs)，其位于每个转录单元之前。snijder及其同事提供了有说服力的证据，在动脉炎病毒中，前导体融合发生在(-)链rna的合成期间，可能是通过类似于类似性辅助的拷贝选择rna重组的过程。模板转换显然是由新生sg(-)链上的抗-trs和5
′‑
most基因组trs之间的碱基配对指导的。
3.严重急性呼吸综合征(sars)冠状病毒，sars-cov，是基因组大小约为29,700个核苷酸(nt)的单链阳性rna病毒，并且具有编码至少14个可读框(orf)的典型冠状病毒基因组组织。sars-cov基因组的前三分之二产生两个大的重叠orf(orf la和orf lb)。其它12个orf由病毒基因组的剩余三分之一生成。在通过膜融合和胞吞作用感染宿主细胞如人肺细胞后，sars-cov将其遗传内容物释放到细胞质中，并立即从orf 1a和orf 1b合成两种大的多聚蛋白pp1a和pp1ab，涉及一种称为程序性-1核糖体移码的过程。后续对多聚蛋白pp1a和pplab进行蛋白水解处理用于生成16种非结构蛋白，包括病毒基因组复制和病毒rna合成所必需的蛋白。位于sars-cov基因组3
′
1/3的5
′
至3
′
方向的orf编码四个主要基因，其编码结构蛋白s(orf 2)、e(orf 4)、m(orf 5)和n(orf 9)。剩余的orf编码其它8种辅助蛋白。两个orf，orf3a和orf3b，位于s和e基因之间，orf 6、7a、7b、8a和8b在m和n基因之间，而n基因也含有内部orf 9b蛋白以在细胞质和细胞核之间穿梭并诱导抗先天免疫反应。
4.在产生病毒复制酶蛋白后，sars-cov通过启动病毒基因组转录和复制进行病毒感染的第二阶段，以通过不连续转录生成阳性基因组大小的rna以及具有55至100个核苷酸的相同5
′
前导序列的嵌套组3
′
共末端亚基因组mrna(sgmrna)。为了合成负链亚基因组rna，复
制-转录复合物(rtc)从其3
′
端沿阳性rna基因组模板加工，并且然后读取每个orf上游的体trs(trs-b)作为衰减信号，并通过识别3
′
前导trs(trs-l)重新定位新生rna以复制基因组前导序列，或连续转录以遇到下一个trs-b。trs含有被可变序列包围的保守的6-7nt核心元件序列(ce)。负链rna的产生用于为mrna的后续合成提供复制模板。在负链合成期间，rdrp(rna依赖性rna聚合酶)在其穿过体内trs(trs-b)时暂停，并将模板转换为前导的trs(trs-l)，这导致前导体融合。从融合的负链中间体转录正链mrna。短sgrna编码保守结构蛋白(刺突蛋白(s)、包膜蛋白(e)、膜蛋白(m)和核衣壳蛋白(n))、63和几种辅助蛋白。
5.与其它冠状病毒(嵌套病毒目、冠状病毒科、冠状病毒亚科)一样，sars-cov-2是具有约30kb的正义单链rna基因组的包膜病毒。sars-cov-2、sars-cov和中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)(分别具有80％和3950％的同源性)属于乙型冠状病毒属。冠状病毒(covs)被认为是主要引起鸟类和哺乳动物的地方性动物感染。但是，sars、mers和后续的covid-19的反复爆发已经清楚地证明了covs跨越物种障碍并在人之间传播的显著能力。sars-cov-2与sars-coy具有许多类似之处，包括依赖于与人细胞上的ace2结合的感染性。这些病毒是冠状病毒，被认为具有类似的不连续转录。除了8个基因组rna之外，sars-cov-2产生亚基因组型rna，一种在所有冠状病毒中常见的类型。根据当前的注释(ncbi 65参考序列：nc_045512.2)，已知sars-cov-2具有六种辅助蛋白(3a、6、7a、7b、8和10)。sars-cov-2(以前称为2019-ncov)基因组以5
′‑
复制酶(orfl/ab)-结构蛋白[刺突(s)-包膜(e)-膜(m)-核衣壳(n)]-3
′
的顺序排列，并且缺乏特征性地在a β-covs谱系中发现的血凝素-酯酶基因。sars-cov-2的刺突糖蛋白包含s1和s2亚基。s1亚基包含信号肽，随后是n-末端结构域(ntd)和受体结合结构域(rbd)，而s2亚基包含保守融合肽(fp)、七肽重复序列(hr)1和2、跨膜结构域(tm)和细胞质结构域(cp)。sars-cov-2的s2亚基是高度保守的并且与两种蝙蝠sars样covs(sl-cov zxc21和zc45)和人sars-cov共享99％的同一性。sars-cov-2的基因组与蝙蝠sars-相关-cov sl-covzxc21(mg772934.1)具有89％的核苷酸同一性，并且与人sars-covbj01 2003(ay278488)和人sars-cov tor2(ay274119)具有82％的核苷酸同一性。


技术实现要素：

[0006]
本发明可用于治疗或预防受试者的病毒感染或降低其风险，其中病毒参与不连续转录作为其生命周期的一部分。本发明还提供了在人或动物受试者中诊断此类病毒感染的方法，检测病毒核酸的方法和产生包含rna的颗粒的方法。
[0007]
在第一配置中，本发明提供了：
[0008]
一种用于施用于人或动物受试者以治疗该受试者的病毒感染或降低其风险的颗粒(例如，病毒样颗粒(vlp))，其中病毒包含rna基因组，其中病毒能够感染该受试者的宿主细胞(例如，人细胞)，该病毒基因组包含rna序列(l)，其中l包含第一转录调控序列核心元件(trs-ce1)，其中病毒的复制包含第一亚基因组rna(sgrna1)的转录，其中sgrna1包含第二转录调控序列核心元件(trs-ce2)，其中trs-ce1能够在宿主细胞中与trs-ce2杂交；
[0009]
其中颗粒包含rna，其中颗粒能够将颗粒rna引入受试者的宿主细胞中用于转录颗粒rna，其中颗粒rna或其转录物包含trs-ce(例如，转录调控序列体核心元件(trs-b ce))；其中当病毒rna与颗粒rna或转录物一起存在于宿主细胞中时，颗粒rna或转录物的trc-ce与病毒rna所包含的trs-ce(例如，转录调控序列前导核心元件(trs-l ce))杂交；
[0010]
其中颗粒rna或转录物trs-ce(例如，trs-b ce)与病毒rna(例如，病毒rna基因组所包含的)所包含的trs-ce(例如，trs-l ce)的杂交减少了病毒复制。
[0011]
例如，病毒rna基因组和颗粒rna都是( )ss rna。
[0012]
第一配置的一个方面提供了：
[0013]
一种用于施用于人或动物受试者以治疗该受试者的病毒感染或降低其风险的病毒样颗粒(vlp)，其中病毒包含rna基因组，其中病毒能够感染该受试者的宿主细胞(例如，人细胞)，该病毒基因组包含rna序列(l)，其中l包含第一转录调控序列核心元件(trs-ce1)，其中病毒的复制包含第一亚基因组rna(sgrna1)的转录，其中sgrna1包含第二转录调控序列核心元件(trs-ce2)，其中trs-ce1能够在宿主细胞中与trs-ce2杂交；
[0014]
其中vlp包含rna，其中vlp能够将vlp rna引入受试者的宿主细胞中用于转录vlp rna，其中vlp rna或其转录物
[0015]
(i)包含(a)trs-ce1或(b)能够在宿主细胞中与trs-ce1杂交的序列；和/或
[0016]
(ii)包含(a)trs-ce2或(b)能够在宿主细胞中与trs-ce2杂交的序列；其中病毒rna与vlp rna或转录物一起存在于宿主细胞中，
[0017]
(iii)组分(i)(a)与由病毒rna编码的sgrna1所包含的trs-ce2杂交；
[0018]
(iv)组分(i)(b)与病毒rna所包含的trs-ce1杂交；
[0019]
(v)组分(ii)(a)与病毒rna所包含的trs-ce1杂交；和/或
[0020]
(vi)组分(ii)(b)与由病毒rna编码的sgrna1所包含的trs-ce2杂交；其中(iii)至(vi)中任一项的杂交减少了病毒复制。
[0021]
在第二配置中，本发明提供了：
[0022]
一种包含多个根据本发明的vlp的组合物
[0023]
在第三配置中，本发明提供了：
[0024]
一种治疗人或动物受试者的病毒感染或降低其风险的方法，该方法包含将组合物施用于受试者。
[0025]
在第四配置中，本发明提供了：
[0026]
一种治疗人或动物受试者的病毒感染的症状(例如炎症)或降低其风险的方法，该方法包含将组合物施用于受试者。
[0027]
在第五配置中，本发明提供了：
[0028]
一种抑制病毒在宿主细胞中复制的方法，其中该病毒包含( )ss rna基因组，其中该病毒基因组包含trs-l ce并且编码包含trs-b ce(ce2)的sgrna转录物，该方法包含
[0029]
a)使宿主细胞与本发明的颗粒(或rna或本发明)接触并将颗粒rna(或rna)引入宿主细胞，其中颗粒rna是( )ss rna，其包含是ce2的互补序列(例如，100％或至少80％互补序列)的序列；
[0030]
b)与步骤(a)同时地、在步骤(a)之后或在步骤(a)之前将病毒rna基因组引入宿主细胞；以及
[0031]
进行转录过程，其中颗粒rna在细胞中转录以产生包含ce2或能够与病毒trs-l ce杂交的序列的rna转录物，其中该转录物与病毒的( )ss rna所包含的trs-l ce杂交以形成rna杂交体，并且该杂交体用于产生包含前导序列(l)的mrna，其中所述前导不可操作地连接到编码病毒复制、增殖或感染性所需的蛋白质的氨基酸序列(a)的rna序列。
[0032]
在第六配置中，本发明提供了：
[0033]
一种产生多个颗粒的方法，该方法包含将多个颗粒(例如vlp、脂质体、纳米颗粒、外来体或微泡)与多个rna组合，其中每个rna是本发明的rna，其中将至少一种rna掺入多个颗粒的相应颗粒中和/或上；并且任选地配制颗粒以产生用于施用于人或动物受试者以治疗或预防病毒感染的药物组合物。
[0034]
在第七配置中，本发明提供了：
[0035]
一种检测样品中病毒rna的方法，其中该病毒使用不连续rna转录过程进行复制，不连续rna转录过程包含使第一trs-ce(ce1)与第二trs-ce(ce2)杂交，该方法包含使样品与本发明的rna(第一rna)接触并检测在第一rna和样品所包含的病毒rna之间形成的杂交体。
[0036]
在第八配置中，本发明提供了：
[0037]
本发明的rna用于诊断人或动物受试者中病毒感染的用途，其中该病毒使用不连续rna转录过程进行复制。
[0038]
在第九配置中，本发明提供了：
[0039]
一种治疗或预防人或动物受试者中的病毒感染的方法，该方法包含将本发明的颗粒或rna施用于受试者。
具体实施方式
[0040]
本发明可用于治疗或预防受试者的病毒感染或降低其风险，其中病毒参与不连续转录作为其生命周期的一部分。因此，优选地，病毒是使用不连续rna转录复制的病毒。在本文中，颗粒以vlp为例，但是当vlp被写在本文中时，在上下文允许的情况下，本说明书可在替代方案中加以必要的变更而应用于一般颗粒，例药学上可接受的颗粒，其实例对于本领域技术人员是显而易见的。
[0041]
本发明提供了用于治疗或预防病毒感染的颗粒，如病毒样颗粒，以及使用此类颗粒治疗或预防受试者(如人或动物受试者)的病毒感染(或其症状)或降低其风险的方法。例如，本文的方法是一种减少动物，如家畜或野生动物(例如蝙蝠、骆驼科动物或鳞甲目(例如穿山甲))中病毒的人畜共患病群体或减少所述群体的建立的方法。在宿主细胞中，vlp有用地能够产生包含病毒前导的sgrna。这种sgrna与细胞的翻译机制竞争，从细胞中病毒核酸产生的sgrna中转移。vlp衍生的sgrna可以不包含任何可读框(orf)或可以编码病毒复制、增殖或感染性所不需要的蛋白质，例如，该蛋白质甚至可以是进一步降低受试者中病毒存活力的抗病毒蛋白质。当产生sgrna时，在转录水平上也提供了竞争；在这种情况下，使用颗粒或vlp rna转录sgrna中间体，其中每个中间体在其3
′
端包含具有核心元件(ce2)的trs序列(trs-b)，其中该核心元件可以与病毒基因组的trs序列(trs-l)的核心元件(ce1)杂交。这是有用的，例如，当病毒是( )ssrna病毒时，本发明的颗粒rna是( )ssrna并且中间体是(-)ssrna。以这种方式，这种杂交与病毒trs-b杂交到trs-l的需要竞争，因此减少或消除了后一种情况的发生，并且减少或消除了病毒mrna。因此，例如，这减少了细胞中一种、多种或所有病毒结构蛋白如m、s、e和n的产生，这减少了病毒复制或增殖，从而本发明可用于治疗、预防病毒感染或其症状如炎症或降低其风险。可以存在额外水平的竞争，例如，当颗粒或vlp包含与病毒的细胞受体(例如ace2)同源的配体(例如刺突蛋白)时；以这种方式，vlp与
受试者中的病毒竞争进入宿主细胞，这可进一步有助于减少病毒感染或建立预防机制。例如，病毒是冠状病毒，其通过将其刺突蛋白与细胞表面上的ace2蛋白结合而附着于受试者的宿主细胞，并且本发明的颗粒还包含表面刺突蛋白(例如，其与病毒产生的刺突蛋白相同)，由此该颗粒与病毒颗粒竞争附着于宿主细胞，从而降低受试者中病毒的感染性。
[0042]
当vlp、组合物或方法用于治疗或预防动物中的病毒感染时，这有利于减少可传播给人的动物感染病群，其中病毒能够在人中引起病毒感染或疾病或病症(或死亡)。在这方面，动物可以是家畜，如猪、家禽(例如鸡、鸭或火鸡)、绵羊、牛、山羊、鱼或贝类。在实例中，动物是蝙蝠、貉、穿山甲、狗、猫、狸猫或骆驼科动物(例如骆驼或单峰骆驼)。在实例中，动物是鸟。
[0043]
在实施例中，提供了：
[0044]
一种用于施用于人或动物受试者以治疗该受试者的病毒感染或降低其风险的病毒样颗粒(vlp)，其中病毒包含rna基因组，其中病毒能够感染该受试者的宿主细胞(例如，人细胞)，该病毒基因组包含rna序列(l)，其中l包含第一转录调控序列核心元件(trs-ce1)，其中病毒的复制包含第一亚基因组rna(sgrna1)的转录，其中sgrna 1包含第二转录调控序列核心元件(trs-ce2)，其中trs-ce1能够在宿主细胞中与trs-ce2杂交；
[0045]
其中vlp包含rna，其中vlp能够将vlp rna引入受试者的宿主细胞中用于转录vlp rna，其中vlp rna或其转录物
[0046]
(i)包含(a)trs-ce1或(b)能够在宿主细胞中与trs-ce1杂交的序列；和/或
[0047]
(ii)包含(a)trs-ce2或(b)能够在宿主细胞中与trs-ce2杂交的序列；其中病毒rna与vlp rna或转录物一起存在于宿主细胞中，
[0048]
(iii)组分(i)(a)与由病毒rna编码的sgrna1所包含的trs-ce2杂交；
[0049]
(iv)组分(i)(b)与病毒rna所包含的trs-ce1杂交；
[0050]
(v)组分(ii)(a)与病毒rna所包含的trs-ce1杂交；和/或
[0051]
(vi)组分(ii)(b)与由病毒rna编码的sgrna1所包含的trs-ce2杂交；其中(iii)至(vi)中任一项的杂交减少了病毒复制。
[0052]
如本领域技术人员所知，在作为病毒复制的一部分进行不连续rna转录的病毒中，trs-ce1在产生mrna转录物的过程中与宿主细胞中的trs-ce2杂交。转录物的翻译对于表达病毒复制所需的病毒蛋白是必要的。
[0053]
在一个实施例中，vlp rna包含trs-ce1和trs-ce2或trs-ce2的多个拷贝。例如，vlp rna能够表达多种mrna，例如本文所述的那些，每种mrna包含trs-ce2。
[0054]
任选地，l编码前导肽，例如包含或由2个连续氨基酸组成的肽，例如，包含不超过10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200或250个连续核苷酸。
[0055]
在实例中，sgrna1是(-)ss rna，颗粒rna是( )ssrna并且病毒基因组是( )ss rna。
[0056]
此外，在实施例中，vlp rna
[0057]
(i)包含trs-ce1；和/或
[0058]
(ii)能够在宿主细胞中与trs-ce2杂交的序列；
[0059]
其中当病毒rna与vlp rna一起存在于宿主细胞中时，
[0060]
(iii)组分(i)与由病毒rna编码的sgrna1所包含的trs-ce2杂交；和/或
[0061]
(iv)组分(ii)的转录物与病毒rna所包含的trs-ce1杂交；
[0062]
其中(iii)和/或(iv)的杂交减少了病毒复制。
[0063]
除了(iii)之外或作为其替代，组分(i)与组分(ii)的转录物所包含的trs-ce2杂交。因此，在宿主细胞中，颗粒rna拷贝中的trs-ce1可与颗粒rna转录物所包含的trs-ce2杂交；并且颗粒rna的不同拷贝中的trs-ce1可以与病毒基因组转录的sgrna1所包含的trs-ce2杂交。以这种方式，第一次杂交可以产生对于病毒复制或感染性所需的病毒蛋白是非生产性的杂交体，因为颗粒rna不能转录成编码这种蛋白的rna序列。此外，第二次杂交可以产生对于病毒复制或感染性所需的病毒蛋白的表达而言非生产性的杂交体，因为颗粒rna包含紧接trs-ce1的3
′
的rna序列，所述rna序列(a)包含终止密码子和/或编码非病毒肽或对于病毒的复制或感染而言无功能的肽，或(b)是抗病毒剂。因此，使用包含trs-ce1的前导不产生蛋白质或产生不可被病毒用于复制或感染性的肽，或蛋白质抑制病毒复制或感染性。
[0064]
优选地，vlp rna的celof包含在trs-l序列中，如与病毒的trs-l序列相同或至少90、95、96、97、98或99％相同的trs-l序列。在实例中，病毒是cov病毒(例如sars-cov-2)并且vlp rna的celof包含在trs-l序列中，如与病毒或不同cov(例如sars-cov)的trs-l序列相同或至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的trs-l序列。例如，病毒是sars-cov，并且不同的病毒选自sars-cov、sars-cov2和mers-coy。例如，病毒是sars-cov-2，并且不同的病毒选自sars-cov、sars-cov2和mers-cov。例如，病毒是mers-cov，并且不同的病毒选自sars-cov、sars-cov2和mers-coy。
[0065]
优选地，ce2包含在trs-b序列中，如与病毒的trs-b序列相同或至少90、95、96、97、98或99％相同的trs-b序列。在实例中，病毒是cov病毒(例如sars-cov-2)并且vlp rna的celof包含在trs-l序列中，如与病毒或不同cov(例如sars-cov)的trs-l序列相同或至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的trs-l序列。例如，病毒是sars-cov，并且不同的病毒选自sars-cov、sars-cov2和mers-coy。例如，病毒是sars-cov-2，并且不同的病毒选自sars-cov、sars-cov2和mers-coy。例如，病毒是mers-cov，并且不同的病毒选自sars-cov、sars-cov2和mers-cov。
[0066]
任选地，本发明的ce1和ce2分别与病毒的ce1和ce2相同。任选地，本发明的trs-l和/或trs-b分别与病毒的ce1和/或ce2相同。
[0067]
杂交的效果最少是vlprna(或其转录物)与病毒sgrna竞争病毒前导trs-ce1和/或与病毒前导trs-ce1竞争病毒sgrnatrs-ce2序列。因此，至少在转录水平上存在竞争。此外，由于包含由vlp rna编码或所包含的rna序列的mrna杂交体的翻译将与全病毒mrna竞争以使用转录和翻译机制，因此可能存在对细胞翻译机制的竞争。这将减少病毒的复制。
[0068]
例如，vlp rna包含trs-ce1作为trs-l序列的一部分，该序列可操作地连接vlp rna的调控区的3
′
，其中所述区域对于启动转录和/或翻译是有缺陷的，或者没有转录或翻译启动调控区可操作地连接trs-l的5
′
，或者trs-l包含在作为前导序列的有缺陷的序列中。(在实例中，在这种情况下vlp rna是正链ssrna。)以这种方式，即使vlprna的trs-ce1与病毒sgrna的trs-ce2杂交并产生杂交mrna(例如当vlp rna是正链rna时是正链杂交mrna)，也不会有杂交mrna的转录和/或翻译，并且因此不会产生病毒基因产物，例如不会产生病毒结构蛋白。替代地，vlp rna编码包含trs-ce1的有缺陷的序列，其中有缺陷的序列不能作为前导序列。例如，有缺陷的序列是病毒rna基因组前导序列的突变形式。以这种方式，即使产
生杂交mrna并将其翻译成蛋白质，该蛋白质也不能被细胞正确处理。因此，这减少了可用于生产性病毒复制的可用蛋白质的量。任选地，vlp rna包含如本段落所述的多个前导序列或有缺陷的序列。任选地，vlp rna包含如本段落所述的多个前导序列或有缺陷的序列，其转录和/或翻译由可操作地连接vlp rna中所述序列的5
′‑
most的5
′
的共同调控区驱动。因此，然后vlp可在与由病毒编码的sgrna所包含的trs-b的ce2结合方面胜过病毒rna基因组的单个trs-ce1。在实例中，本发明的每个所述前导序列或有缺陷的序列可使用其自身的启动子(例如组成型启动子或强启动子)转录，但其mrna不具有启动翻译的功能，从而使得本发明的缺陷序列的产生比病毒基因组产生的多得多。在实例中，该或每个启动子是u6启动子。
[0069]
除上一段的实例之外或作为替代，vlp rna(例如正链ssrna)可包含包含trs-b的互补序列，该trs-b包含trs-ce2，其互补序列编码能够与病毒rna基因组的trs-l的ce1杂交的rna转录物。以这种方式，转录物与病毒基因组编码的sgrna竞争结合病毒基因组编码的trs-l的ce1，从而在转录和翻译水平上竞争。优选地，vlp rna的trs-b或trs-b互补序列不可操作地连接到编码病毒蛋白(如病毒的蛋白、如病毒的结构蛋白)的序列。例如，trs-b或trs-b互补序列不可操作地连接到orf或不可操作地连接到编码病毒或所述病毒的n、s、e或m蛋白的orf。例如，trs-b或trs-b互补序列不可操作地连接到编码所述病毒(或任何病毒)的n、s、7a、3a、8、m、e、6或7b蛋白的序列。任选地，这里的病毒是冠状病毒，例如sars冠状病毒。以这种方式，即使转录物所包含的ce2(即，由vlp rna编码并使用vl prna作为模板表达的转录物)与病毒rna基因组的trs-l的ce1杂交，并且存在rna链延伸以产生mrna，该mrna将不会产生翻译成此类的蛋白质，并且因此将不会产生可用于病毒复制的蛋白质，从而有助于减少病毒感染、传播或感染性。在实例中，trs-b或trs-b互补序列可操作地连接到用于在细胞中表达抗病毒蛋白(例如干扰素，如i型干扰素或干扰素-β)的orf。任选地，vlprna包含多个如本段落描述的所述trs-b或trs-b互补序列。因此，然后源自vlp的trs-b可在与ce1结合方面胜过病毒rna基因组的trs-b。在实例中，本发明的每个所述trs-b序列或互补序列可使用其自身的启动子(例如组成型启动子或强启动子)转录，从而使得本发明的有缺陷的序列的产生比病毒基因组产生的多得多。在实例中，该或每个启动子是u6启动子。
[0070]
sar-cov基因组包含以下基因配置：
[0071]5′‑
复制酶(orfl/ab)-[结构蛋白：刺突(s)-包膜(e)-膜(m)-核衣壳(n)]-3
′
[0072]
在实施例中，vlp rna包含按以下顺序编码病毒的sgrna trs-b的序列：
[0073]5′‑
[编码刺突(s)trs-b的序列]-[编码包膜(e)trs-b的序列]*[编码膜(m)trs-b的序列]-[编码核衣壳(n)trs-b的序列]-3
′
[0074]
在实施例中，vlp rna包含病毒的rna[编码刺突(s)trs-b的序列]。在实施例中，vlp rna包含病毒的rna[编码包膜(e)trs-b的序列]。在实施例中，vlp rna包含病毒的rna[编码膜(m)trs-b的序列]。在实施例中，vlp rna包含病毒的rna[编码核衣壳(n)trs-b的序列]。
[0075]
任选地，[编码刺突(s)trs-b的序列]是紧接在编码截短的(例如，c-末端截短的)或突变的病毒s的rna序列的5
′
。例如，与病毒rna基因组的完整s orf相比，rna序列被截短，并且包含病毒rna基因组中编码s的序列的前5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、80、100或150个连续核苷酸。这可用于保存天然病毒trs-b/s-编码序列连接，用于在宿主细胞中正确转录和/或翻译这部分vlp rna。截短或突变的序列可翻译成对病毒复制、增殖或感染性无
功能的s蛋白的对应突变或截短形式。因此，这种有缺陷的蛋白可以掺入到细胞产生的任何病毒颗粒中，从而当从细胞中释放时阻碍它们的感染性。这也提供了减少受试者中病毒感染的方法。此外，vlp和病毒rna可以重组，从而将有缺陷的序列插入到病毒基因组中并使其不能产生蛋白质。这也可有助于减少病毒感染。此外，如果任何病毒颗粒被包装在宿主细胞中，一些病毒颗粒可能会包装有缺陷的序列，并且这些有缺陷的颗粒可以与野生型病毒颗粒竞争地在受试者内循环，从而提供了减少感染的进一步方式。实际上，病毒颗粒可以包装vlp rna的拷贝并在受试者中增殖这些颗粒，从而使这些颗粒可能与野生型病毒颗粒竞争。当vlp颗粒将它们的rna导入宿主细胞时，然后这些细胞被“免疫”并能够表达和参与本文所述的本发明的竞争机制。因此，这也可以起到减少受试者中病毒感染的作用。
[0076]
在紧接前一段落中的概念加以必要的变更而应用于[编码包膜(e)trs-b的序列]的使用。在紧接前一段落中的实施例加以必要的变更而应用于[编码膜(m)trs-b的序列]的使用。在紧接前一段落中的实施例加以必要的变更而应用于[编码核衣壳(n)trs-b的序列]的使用。在实施例中，概念用于病毒基因组中发现的s、e、m和n中的每一个并且任选的一个或多个其它orf的vlp rna。
[0077]
任选地，[编码刺突(s)trs-b的序列]是紧接病毒rna基因组中s-trs-b的5
′
的序列大小的50至150％或80至120％(优选100％)的紧接rna序列的5
′
。任选地，[编码包膜(e)trs-b的序列]是紧接病毒rna基因组中s-trs-b的5
′
的序列大小的50至150％或80至120％(优选100％)的紧接rna序列的5
′
。任选地，[编码膜(m)trs-b的序列]是紧接病毒rna基因组中s trs-b的5
′
的序列大小的50至150％或80至120％(优选100％)的紧接rna序列的5
′
。任选地，[编码核衣壳(n)trs-b的序列]是紧接病毒rna基因组中s trs-b的5
′
的序列大小的50至150％或80至120％(优选100％)的紧接rna序列的5
′
。
[0078]
任选地，vlp rna中从[编码刺突(s)trs-b的序列]的5
′‑
most-核苷酸到vlp rna中编码核衣壳(n)trs-b的序列的3
′‑
most-核苷酸的大小为病毒rna基因组中从[编码刺突(s)trs-b的序列]的5
′‑
most-核苷酸到病毒rna基因组中编码核衣壳(n)trs-b的序列的3
′‑
most-核苷酸的大小的80至120％(任选地100％)。
[0079]
任选地，vlp rna中从编码trs-b的第一序列的5
′‑
most-核苷酸到编码trs-b的最后序列的3
′‑
most-核苷酸的大小为病毒rna基因组中从[编码刺突(s)trs-b的序列]的5
′‑
most-核苷酸到病毒rna基因组中编码核衣壳(n)trs-b的序列的3
′‑
most-核苷酸的大小的80至120％(任选地100％)。
[0080]
在实施例中，病毒的复制包含病毒基因组rna的转录以产生第一和第二sgrna转录物，其中sgrna共享相同的5
′
序列并且第一sgrna包含为所述5
′
序列的3
′
的第一trs-b ce，并且第二sgrna包含为所述5
′
序列的3
′
的第二trs-b ce，其中第二sgrna比所述第一sgrna长；并且其中病毒基因组rna包含trs-l，其中trs-l能够分别与trs-b ce中的每一个杂交。在该实施例的实例中，本发明的rna可在宿主细胞中转录(或被转录)以产生第一和第二rna转录物，其中该第一和第二rna共享相同的5
′
序列并且第一rna包含为所述5
′
序列的3
′
的第一trs-b ce，并且第二rna包含为所述5
′
序列的3
′
的第二trs-b ce，其中第二rna比第一rna长；并且其中rna的每个trs-b ce能够分别与病毒基因组rna的trs-l杂交。在实例中，本发明的病毒基因组rna和rna中的每一个是( )ssrna，并且本发明的病毒和rna的每个所述转录物是(-)ss rna。在另一替代的实例中，本发明的病毒基因组rna和rna中的每一个都是
(-)ssrna，并且本发明的病毒和rna中的每一个所述转录物是( )ss rna。任选地，病毒基因组rna包含分别编码sgrna的第一和第二trs-b ce的第一和第二序列，其中该第一和第二序列被x个连续核苷酸的序列分开；其中本发明的rna包含分别编码第一和第二rna转录物的trs-b ce的第三和第四序列，其中该第三和第四序列被y个连续核苷酸的序列分开，其中y是x的50至150％或80至120％(例如90至110或100％)。例如，x是100nt序列并且y是80至120nt(例如，100nt)序列。因此，这对于保持通过使用本发明的rna产生的转录物中trs-b ce之间的间隔以模拟病毒复制过程中trs-b ce之间的间隔可能是重要的，这对于有效产生本发明的rna转录物和/或它们的用途(如与病毒的trs-l杂交)可能是有利的。任选地，转录物的每个trs-b ce包含在trs-b序列中，如表1或2中所示的trs的互补序列。
[0081]
在实例中，本发明的rna可在宿主细胞中转录(或被转录)以产生多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)不同的rna转录物，每个转录物包含(例如在其3
′
端)能够在宿主细胞中与病毒rna的trs-l杂交的trs-b ce。每个trs-b ce可以是如本文所公开的ce序列，或包含在如本文所公开的trs序列(或此类trs-b的互补序列)中。任选地，rna转录物由本发明的rna所包含的共同启动子转录；或者替代地，每种rna从本发明rna所包含的相应启动子(例如u6启动子)转录。以这种方式，本发明的rna产生多种rna转录物，其与病毒复制中产生的sgrna竞争，从而减少病毒复制，如用于减少或治疗或预防受试者中的病毒感染。任选地，转录物的每个trs-b ce包含在trs-b序列中，如表1或2中所示的trs的互补序列。
[0082]
在另一实例中，病毒的复制包括产生包含trs-b ce的第三sgrna，其中该第三sgrna比第一和第二sgrna长并且包含所述5
′
序列；并且其中病毒基因组rnatrs-l能够与第三sgrna中的每一个trs-b ce杂交。在该实例中，本发明的rna可以在宿主细胞中转录(或被转录)以产生第三rna转录物，其中第一、第二和第三rna共享相同的5
′
序列并且第三rna包含为所述5
′
序列的3
′
的第三trs-b ce，其中第三rna比第一和第二rna长；并且其中该第一、第二和第三rna的每个trs-b ce分别能够与病毒基因组rna的trs-l杂交。任选地，病毒基因组rna包含编码第三sgrnatrs-b ce，的第三序列，其中该病毒基因组rna的第二和第三trs-b ce编码序列被z个连续核苷酸的序列分开；其中本发明的rna包含编码第三rna转录物的trs-b ce的第五序列，其中第四和第五序列被w个连续核苷酸的序列分开，其中w是z的50至150％或80至120％(例如90至110或100％)。例如，z是100nt序列并且w是80至120nt(例如，100nt)序列。因此，这对于保持通过使用本发明的rna产生的转录物中trs-b ce之间的间隔以模拟病毒复制过程中trs-b ce之间的间隔可能是重要的，这对于有效产生本发明的rna转录物和/或它们的用途(如与病毒的trs-l杂交)可能是有利的。任选地，转录物的每个trs-b ce包含在trs-b序列中，如表1或2中所示的trs的互补序列。
[0083]
任选地，vlp rna能够在宿主细胞(其已经被病毒感染)中产生mrna，其中该mrna包含紧接rna序列的5
′
的前导序列，其中rna序列(i)长度为至少5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000个连续核苷酸；(ii)与病毒的orf长度相同或长度不超过5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000个连续核苷酸；或(iii)在其5
′
端包含aug或由aug组成。在替代方案中，mrna中不存在rna序列，其中mrna仅由前导序列和多聚a尾组成。在本文中，vlp rna可能能够在宿主细胞(已被病毒感染)中产生一种或多种包含多聚a尾的mrna，其中没有一种mrna编码病毒复制所需的蛋白质。在本文中，vlp rna可能能够在宿主细胞
(已被病毒感染)中产生一种或多种包含多聚a尾的mrna，其中没有一种mrna编码病毒感染性所需的蛋白质。在本文中，vlp rna可能能够在宿主细胞(已被病毒感染)中产生一种或多种包含多聚a尾的mrna，其中没有一种mrna编码病毒的功能性s、m、n或e蛋白。在本文中，vlp rna可能能够在宿主细胞(已被病毒感染)中产生一种或多种包含多聚a尾的mrna，其中没有一种mrna编码病毒的功能性结构蛋白。在本文中，vlp rna可能能够在宿主细胞(已被病毒感染)中产生一种或多种包含多聚a尾的mrna，其中没有一种mrna编码rdrp。在这些实施例中，vlp rna产生病毒复制和/或感染性有缺陷的mrna，因此这些mrna与病毒基因组编码的mrna竞争。竞争可以是对细胞中转录和/或翻译机制的竞争。
[0084]
在实例中，vlp rna的长度不大于病毒rna基因组长度的100、110或120％(优选rna的长度相同或基本相同)。在实例中，vlp rna的长度不大于病毒衣壳的包装能力的100、110或120％。在病毒颗粒在宿主细胞中制备的情况下，这些实施例是有用的，其中vlprna有机会被包装(其将满足病毒衣壳的包装大小限制)，从而提供可以从宿主细胞释放并用vlp rna免疫受试者中的其它宿主细胞的另外的颗粒。在这个意义上，本发明因此提供了受试者的预防性疫苗接种(除了治疗携带病毒rna的宿主细胞中的感染之外)，因为所述携带vlp rna的另外的颗粒可以通过刺突(或用于宿主细胞识别的其它病毒蛋白)识别新的宿主细胞，由此vlp rna被引入并且可以在尚未被感染的宿主细胞中扩增，在后续被病毒颗粒感染的情况下备用。
[0085]
当vlp带有刺突(或病毒通常采用的用于宿主细胞识别的其它配体)和/或病毒衣壳蛋白时，这可通过将抗原表位呈递至受试者的免疫系统以产生针对病毒的保护性抗体而为受试者提供额外的保护层。类似地，当vlp rna被感染细胞包装以产生如上所述的其它颗粒时，当颗粒从受试者的宿主细胞中释放时，这些颗粒也可包含并呈递此类抗原性表位。
[0086]
在实例中，vlp rna包含用于将rna包装到病毒衣壳中的包装信号。在实施例中，包装信号是病毒基因组所包含的包装信号。在实施例中，vlp rna所包含的包装信号优先于病毒基因组的包装用于细胞中。有利地，为了包装vlp rna，vlp rna和病毒rna可以具有相同的极性，例如每个是正链rna；并且任选地，vlp rna大小为病毒rna基因组大小的80至120％(例如100％)。合适的包装信号可以是在masters，paul.2019年“冠状病毒基因组rna包装(coronavirus genomic rnapackaging)”，《病毒学(virology)》537.10.1016/《病毒学杂志(j.virol.)》2019年08月31日中公开的冠状病毒的包装信号，其公开内容(以及明确地可能用于本发明的包装信号序列)并入本文。在实施例中，vlp rna所包含的包装信号是这些包装信号之一或其直向同源物或同源物。
[0087]
同源物：通过源自共同祖先dna或蛋白质序列而与第二基因、核苷酸或蛋白质序列相关的基因、核苷酸或蛋白质序列。术语同源物可应用于由基因复制事件分开的基因之间的关系或由基因复制事件分开的基因之间的关系。
[0088]
直系同源物：直向同源物是通过物种形成从共同的祖先基因、核苷酸或蛋白质序列进化的不同物种或菌株中的基因、核苷酸或蛋白质序列。通常，直系同源物在进化过程中保持相同的功能。
[0089]
在实例中，vlp包含单个所述rna分子或多个所述rna分子。
[0090]
在替代方案中，vlp包含多种不同的rna，而不是包含单一rna类型的vlp，其中每种rna包含至少一种包含ce2或其互补序列的所述trs-b和/或其中每种rna包含至少一种包含
ce1或其互补序列的所述trs-l。通过将rna信息分成几个rna，可以提供未被病毒衣壳包装的rna(如果需要避免vlp rna在受试者中扩散)。
[0091]
在实施例中，rna或不同rna中没有一个包含用于包装到所述病毒衣壳中的包装信号。
[0092]
在实例中，vlp rna包含多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)包含ce1的所述trs-l和任选地包含ce2的trs-b的至少一个互补序列。在实例中，vlp rna包含多种(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)包含ce2的trs-b的互补序列和任选地至少一种包含cel的所述trs-l。在实例中，vlp rna包含至少一种包含ce1的所述trs-l和至少一种包含ce2的trs-b的互补序列。
[0093]
任选地，vlprna包含病毒基因组的多个trs-b序列(例如冠状病毒正链rna的一个或多个trs-b序列)或此类trs-b的多个互补序列。在实例中，vlprna不含病毒基因组的所有外显子序列，但vlp rna包含病毒基因组的一个或多个trs-b序列(例如冠状病毒正链rna的一个或多个trs-b序列)或此类trs-b的多个互补序列。不含此类序列使vlp rna与病毒rna重组的机会最小化，其中vlp rna获得一个或多个编码病毒蛋白的序列。
[0094]
vlp可以是合成颗粒(例如脂质体或纳米颗粒)或减毒病毒(例如感染受试者的病毒的减毒拷贝，例如减毒冠状病毒、sars-cov或sars-cov-2病毒)。这里减毒是指vlp不能在受试者中引起病原性病毒感染，例如vlp不能自我复制。例如，颗粒不含病毒的任何orf rna。病毒的减毒形式可用于此目的，例如减毒cov，如sars-cov、sars-cov-2或mers-coy。
[0095]
在一个实施例中，当提及“vlp”时，颗粒是“非自身复制颗粒”，例如包含病毒刺突蛋白的颗粒。任选地，vlp在所述受试者的细胞中(例如在人细胞中)是非自身复制性的。“非自身复制”是指vlp不编码在宿主细胞中复制自身以产生子代vlp必要的所有蛋白质。
[0096]
在实施例中，vlp能够与宿主细胞膜融合用于将vlp rna导入宿主细胞，如通过胞吞作用。
[0097]
已知核酸可以被包封到某些vlp中(参见，例如，takamura，s.、niikura，m.、li、t.等人，“来源于口腔传播病毒的dna疫苗包裹的病毒样颗粒通过口服刺激粘膜和全身免疫反应(dna vaccine-encapsulated virus-like particles derived from an orally transmissible virus stimulate mucosal and systemic immune responses by oral administration )”《基因治疗(gene ther)》，11，628-635(2004)https：//doi.org/10.1038/sj.gt.3302193和lee，e.b.、kim，j.、hur，w.等人，“使用戊型肝炎病毒的工程病毒样颗粒的肝脏特异性基因递送(liver-specific gene delivery using engineered virus-like particles of hepatitis e virus)”，《科学报告(scirep)》9，1616(2019)https：//doi.org/10.1038/s41598-019-38533-7其公开内容通过引用并入本文)。因此，在实施例中，本发明的rna被包封在vlp内。
[0098]
在另一实施例中，rna附着于颗粒(例如纳米颗粒)的外表面。
[0099]
如本领域技术人员所知，vlp可以模拟病毒的版本减去其遗传信息(在本案中，vlp包含本发明的vlprna)。当代vlp生产可利用几种系统，包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。生产平台的选择取决于几个因素，包括成本和对翻译后修饰(ptm)的需要，这在生成最佳免疫反应中是必需的。一些旨在预防多种感染病的基于vlp的疫苗已经获得批准并投放市场，还有许多其它疫苗处于临床试验或研究阶段。众所周知，杆状病毒表达系统用于生产
疫苗用vlp，如flashback
tm
杆状病毒表达系统。这里，vlp是一种病毒结构蛋白的组装体，它模仿了真正的野生型病毒的配置，只是它不包含这种病毒的完整遗传物质。常规地，对于疫苗，如果人接种了vlp，则生成免疫反应，就好像免疫系统已经呈现了真正的野生型病毒一样。然而，由于vlp不含有完整的遗传物质，它们不能复制产生野生型病毒，因此在接种疫苗的人中不产生野生型病毒感染的效果。为了产生有效模拟真实病毒的功能性vlp，使用了大量的多种病毒结构蛋白。然后将这些正确地组装成颗粒，该颗粒再现感染性野生型病毒的外壳(衣壳)的确认。有利地，用于生产颗粒的表达系统既安全又能够以小规模(用于测试)和大规模(用于疫苗生产)生产多种蛋白质。使用杆状病毒表达系统生产vlp疫苗引起了相当大的兴趣。由于fda已经批准杆状病毒制造的疫苗用于人(葛兰素史克公司(glaxosmithkline)的)以预防hpv，这使得杆状病毒系统有可能更广泛地用于vlp生产。使用杆状病毒系统生产可用于免疫抗流感病毒的vlp也引起了极大的兴趣。
[0100]
在实例中，vlp包含病毒衣壳蛋白和/或刺突蛋白(例如病毒的s、e、m和n蛋白)，其中该蛋白通过在选自细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞的细胞中表达而获得或可获得。在实施例中，通过在人肺(例如肺上皮细胞)、肾或心脏细胞系中表达来获得或可获得蛋白质。在实施例中，通过在a549细胞系(其为人肺细胞系)中表达来获得或可获得蛋白质。在实施例中，通过在hek(例如，hek293)细胞系(其为人肾细胞系)中表达来获得或可获得蛋白质。在实施例中，通过在vero(例如vero e6)细胞系中表达而获得或可获得蛋白质。在实施例中，通过在vero c1008(crl-1586
tm
)系中表达而获得或可获得蛋白质。
[0101]
在另一替代的配置中，不使用vlp，而是通过dna疫苗接种将本发明的rna导入受试者(其中dna在宿主细胞内编码本发明的rna)。替代地，可将rna导入受试者，例如，其中使用用于保护mrna治疗剂的常规技术来保护rna(参见，例如，莫德纳公司(moderna，inc)的技术，其将是本领域技术人员熟悉的)。
[0102]
宿主细胞可以是受试者的肺细胞、受试者的肾细胞、受试者的gi道细胞或受试者的心脏细胞。
[0103]
优选地，vlprna包含组分(i)(a)和(ii)(b)，例如，其中组分(i)(a)是vlp rna中组分(ii)(b)的5
′
。
[0104]
病毒可以是冠状病毒，例如α、β或γ冠状病毒。例如，病毒是感染性胃肠病病毒(tgev)、小鼠肝炎病毒(mhv)或感染性支气管炎病毒(ibv)。
[0105]
cov基因组包括5
′
端cap和3
′
端多聚(a)，其也可以促进由病毒和细胞蛋白质介导的5
′
至3
′
相互作用。这些相互作用可能涉及控制cov复制和转录的及时转换。这些活性包括与双层膜(dmv)相关的负链rna的合成。在实例中，vlp rna包含所述病毒的5
′
端cap和3
′
端多聚(a)例如5
′
端cap和3
′
端多聚(a)。
[0106]
表1：示出了sars-cov-2和ce序列的trs
[0107][0108]
括号中的a数字表示推定的起始密码子的核苷酸数。起始密码子用下划线标出。保守的trs核心序列。acgaac或cuaaac以粗体突出显示。
[0109]
任选地，(例如，其中病毒是冠状病毒，如sars-cov-2或sars-coy)ce1或本文的任何ce是acgaac或cuaaac或cuaaacgaac(以5
′
至3
′
方向书写)。此外或替代地，(例如，其中病毒是冠状病毒，如sars-cov-2或sars-cov)ce2是acgaac或cuaaac或cuaaacgaac(以5
′
至3
′
方向书写)；或是其互补序列。例如，颗粒rna包含这样的序列或rna可在宿主细胞中转录以产生包含这样的序列的rna。
[0110]
在实例中，ce2或本文中的任何ce是病毒rna的s、3ab、e、m、n或7-编码序列的trs的ce；或是其互补序列。在实例中，ce2或本文中的任何ce包含在vlp rna转录物中，并且ce2是病毒rna的s、3ab、e、m、n或7-编码序列的trs的ce，并且其中ce2不可操作地连接至编码病毒的s、3ab、e、m、n或7的rna序列。例如，vlp rna是正链rna，转录物是负链rna，任选地转录物中的ce2是紧接不编码病毒蛋白，不编码病毒结构蛋白、或不编码病毒s、3ab、e、m、n或7蛋白、或不编码病毒s、3ab、e、m、n或7蛋白的rna序列的3
′
。
[0111]
在实例中，ce2的互补序列包含在vlp rna中，ce2互补序列包含在病毒rna的s、3ab、e、m、n或7编码序列中，其中vlprna所包含的互补序列不可操作地连接到编码病毒的s、3ab、e、m、n或7的rna序列上。例如，vlp rna是正链rna，并且任选地，vlp rna中的所述互补序列紧接不编码病毒蛋白、不编码病毒结构蛋白、或不编码病毒s、3ab、e、m、n或7蛋白、或不编码病毒s、3ab、e、m、n或7蛋白的rna序列的5
′
。
[0112]
任选地，l包含转录调控序列，其包含病毒的trs-ce1。
[0113]
任选地，vlp rna包含包含trs-ce1的trs-l。在实例中，vlp rna的转录物包含包含trs-ce2的trs-b。例如，trs-ce1包含在正链单链rna中，并且trs-ce2包含在负链单链rna中。因此，trs-ce1和trs-ce2可以彼此100％互补。
[0114]
在实例中，与在与本发明的受试者相同物种和性别和年龄的对照受试者中的病毒复制相比，病毒复制的减少是至少20、30、40、50、60、70、80或90％，其中对照受试者已被病毒感染(例如，以相同量或类似量)与本发明的受试者相同或类似的时间，但其中本发明的
受试者被施用所述vlp，而对照受试者未被施用任何此类vlp。
[0115]
任选地，vlp rna包含可操作用于蛋白质翻译的调控元件，其中该调控元件可操作地连接到组分(i)(a)或(ii)(b)的5
′
(或组分(i)或(ii)的5
′
)。例如，该组分包含在编码前导序列的rna序列中，任选地该前导序列包含病毒的前导序列。
[0116]
任选地，vlp rna(例如，( )ss rna)包含组分(i)或(ii)(例如，组分(i)(a)或(ii)(b))，并且vlprna不含组分3
′
端的rna序列，并且该rna序列可表达以产生病毒复制、增殖或感染性所需的蛋白质的氨基酸序列(a)。
[0117]
在实例中，本文的vlp rna或任何ce的ce1包含在选自(以5
′
至3
′
方向书写)cuaaacgaac、uaaacgaac、ucuaaacgaac、acgaac、uaaacgaacuu和acgaacuu序列(下划线表示核心元件(ce))中。替代地，vlprna可在宿主细胞中转录(或被转录)以产生包含此类序列的rna，或包含此类序列的vlp rna的互补序列(例如，100％互补序列)。任选地，这里的病毒是cov，例如sars-cov或sars-cov2病毒。
[0118]
任选地，ce1在5
′
至3
′
方向上是acgaac和/或ce2在5
′
至3
′
方向是guucgu。
[0119]
任选地，vlprna包含多个拷贝的trs-ce互补序列，每个trs-ce互补序列能够与宿主细胞中trs-ce1杂交，其中所述拷贝中没有一个与vlp rna的rna序列可操作地连接，其编码病毒复制或增殖(例如从宿主细胞释放或宿主细胞感染)所必需的蛋白质。
[0120]
任选地，vlp rna能够使用宿主或病毒复制酶在宿主细胞中复制。
[0121]
任选地，vlp rna包含由病毒基因组编码的rna依赖性rna聚合酶(rdrp)识别和结合所需的调控元件；任选地，其中调控元件与病毒基因组所包含的调控元件相同。
[0122]
任选地，vlp rna包含能够被病毒包装机器识别的包装信号，以将vlp rna包装到能够感染宿主细胞的病毒衣壳中。任选地，包装信号是病毒的包装信号.任选地，包装信号包含或编码环基序5
′‑
uuucgu
′3′
。在实例中，包装信号是《病毒学》，2019年11月；537：198-207.doi：10.1016/《病毒学杂志》2019年08月31日，电子出版，2019年8月30日，“冠状病毒基因组rna包装”中公开的任何包装信号，masters ps(例如，如图2中公开的)，或其任何同源物。参考文献中的所有序列通过引用并入本文以用于本发明。在实例中，本发明的病毒是该参考文献中公开的病毒，并且包装信号是该病毒的包装信号。
[0123]
任选地，vlp rna包含一种或多种(例如一种或两种)可在宿主细胞中操作的核定位信号。例如，nls是编码vlp rna的前导或ce1的序列的5
′
，和/或nls是与ce2互补的vlp rna的序列的3
′
。
[0124]
任选地，由(iii)至(vi)中任一项产生的rna杂交体的vlp rna能够是由宿主细胞延伸的3
′
以产生rna产物，其中所述rna产物在细胞中对于所述病毒复制、增殖或感染性所需蛋白质的表达是非生产性的。
[0125]
任选地，vlp包含宿主细胞的受体或配体，该受体或配体与病毒用于结合宿主细胞的受体或配体相同；任选地，其中配体是病毒刺突糖蛋白和/或配体能够结合宿主细胞的表面上的ace2蛋白(例如，其中病毒是sars-cov或sars-cov-2病毒)或宿主细胞的表面上的dpp4蛋白(例如，其中病毒是mers-cov病毒)。在实例中，配体是vlp的衣壳或vlp的脂质包膜(如果vlp包含脂质包膜)所包含的vlp表面暴露配体。
[0126]
任选地，病毒的复制包含第一和第二亚基因组rna(sgrna)的转录，其中每个sgrna包含第二转录调控序列核心元件(trs-ce)，其中sgrna的每个trs-ce能够在宿主细胞中与
vlp rna trs-ce1的序列杂交。
[0127]
任选地，病毒的rna基因组是正链rna基因组，并且vlprna是正链rna。例如，病毒的rna基因组是单链的正义rna。在替代方案中，rna基因组是正义rna基因组。任选地，病毒的rna和vlp都是正链单链rna。
[0128]
例如，vlp rna可在宿主细胞中复制以产生其负链互补rna。例如，vlprna是正链单链rna，而vlp rna可在宿主细胞中复制以产生负链单链rna。
[0129]
任选地，trs-ce1是6至12个连续核苷酸和/或trs-ce2是6至12个连续核苷酸。优选地，trs-ce1是6个连续核苷酸和/或trs-ce2是6个连续核苷酸。优选地，trs-ce1是6、7、8、9、10、11或12个连续核苷酸。优选地，trs-ce2是6、7、8、9、10、11或12个连续核苷酸。
[0130]
任选地，vlp rna包含与ce2 100％互补的rna序列，并且其中所述rna序列与病毒的ce1相同。
[0131]
任选地，ce2的序列与ce1 100％互补；或ce2在除了1、2或3个核苷酸之外的ce2的所有核苷酸上与ce1互补。
[0132]
任选地，trs-ce1包含在8至30(例如8至25)个连续核苷酸的病毒转录调控序列(trs1)中和/或trs-ce2包含在8至30个连续核苷酸的病毒trs(trs2)中。例如，trs1包含或由13、15、18或26个连续核苷酸组成。例如，trs1包含或由8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个连续核苷酸组成。
[0133]
任选地，本文中的trs1或任何其它trs包含在5
′
至3
′
方向上的序列nnn-ce1(即，ce1的最后nt是trs1的最后nt)或nnn-ce1-nnn，其中每个n是选自a、u、c和g的任何核苷酸；任选地其中ce1在5
′
至3
′
方向上是acgaac。
[0134]
任选地，本文中的trs1或任何其它trs在5
′
至3
′
方向上包含uaa-ce1、ucucuaa-ce1、agu-ce1或ugagu-ce1。
[0135]
任选地，本文中的trs1或任何其它trs在5
′
至3
′
方向上包含ce1-uu、ce1-uuu、ce1-uaa、ce1-uaacu、ce1-uaaau或ce1-uu(即，最后u是trs1的最后nt)。
[0136]
任选地，本文中的trs1或任何其它trs在5
′
至3
′
方向上包含uaa-ce1-uu、uaa-ce1-uuu、ucucuaa-ce1-uuu、ggucuaa-ce1-uaacu、ggucuaa-ce1-uaaau、agu-ce1-uu或ugagu-ce1-uu。
[0137]
任选地，本文中的trs2或任何其它trs包含在5
′
至3
′
方向上的序列nnn-ce2(即，ce2的最后nt是trs2的最后nt)或nnn-ce2-nnn，其中每个n是选自a、u、c和g的任何核苷酸；任选地其中ce2在5
′
至3
′
方向上是acgaac。
[0138]
任选地，本文中的trs2或任何其它trs在5
′
至3
′
方向上包含uaa-ce2、ucucuaa-ce2、agu-ce2或ugagu-ce2。
[0139]
任选地，本文中的trs2或任何其它trs在5
′
至3
′
方向上包含ce2-uu、ce2-uuu、ce2-uaa、ce2-uaacu、ce2-uaaau或ce2-uu(即，最后u是trs2的最后nt)。
[0140]
任选地，本文中的trs2或任何其它trs在5
′
至3
′
方向上包含uaa-ce2-uu、uaa-ce2-uuu、ucucuaa-ce2-uuu、ggucuaa-ce2-uaacu、ggucuaa-ce2-uaaau、agu-ce2-uu或ugagu-ce2-uu。
[0141]
任选地，病毒使用不连续rna转录过程进行复制。因此，本发明中的病毒可以使用不连续rna转录过程进行复制，该不连续rna转录过程包含将第一病毒rna与第二病毒rna杂
交，其中第一rna包含包含第一核心元件(ce1)的trs-l，第二rna包含包含第二核心元件(ce2)的trs-b，并且所述杂交包含ce1与ce2的杂交。任选地，第一rna是( )ssrna并且第二rna是(-)ssrna，并且该过程中的rna的( )rna链杂交体沿5
′
至3
′
方向延伸以产生编码病毒复制和感染性所需的病毒蛋白的mrna。
[0142]
任选地，病毒是套式病毒；冠状病毒科病毒；冠状病毒亚科、动脉炎病毒、头甲病毒或环曲病毒亚科病毒，优选冠状病毒亚科；sars或mers病毒；或sars-cov、sars-cov-2或mers-cov病毒。
[0143]
任选地，病毒是eav，马动脉炎病毒(equine arteritis virus)；ibv，感染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus)；mers-cov，中东呼吸综合征冠状病毒(middle east respiratory syndrome coronavirus)；mhv，小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus)；prrsv，猪增殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus)；sars-cov，严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus)；或tgev，感染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus)。
[0144]
任选地，病毒是冠状病毒，例如sars-cov、sars-cov-2、sars相关冠状病毒(sarsr-cov)、hcov-oc43、hcov-hku1、hcov-nl63、hcov-229e。在实例中，病毒是sars-cov zxc21、zc45、ratg13、cuhk-w1、urbani、gz02、a031、a022、wiv16、wiv1、rp3、rs672或hku4。在实例中，病毒选自sars-cov-2(yp_009724390.1)、sarsr-covratg13(qhr63300.2)、sars-covurbani(aap13441.1)、sars-covcuhk-w1(aap13567.1)、sars-cov gz02(aas00003.1)、sars-cova031(aav97988.1)、sars-cova022(aav91631.1)、wiv-16(alk02457.1)、wiv-1(agz48828.1)、sarsr-covzxc21(avp78042.1)、sarsr-covzc45(avp78031.1)、sarsr-covrp3(q3i5j5.1)、sarsr-cov rs672(acu31032.1)。登录号在括号中示出；其序列通过引用明确并入本文以用于本发明。
[0145]
任选地，病毒是(-)ssrna病毒，例如负核糖病毒门(negarnaviricota)或三角病毒(deltavirus)病毒，例如丁型肝炎病毒；在实施例中，本发明的颗粒rna是(-)ssrna。在实例中，病毒是沙粒病毒科(arenaviridae)、正粘病毒科(orthomyxoviridae)、副粘病毒科(paramyxoviridae)、肺泡病毒科(pneumoviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、弹状病毒科(rhabdoviridae)或纤细病毒属(tenuivirus)病毒。任选地，病毒是马尔堡病毒(marburgvirus)、埃博拉病毒(ebolavirus)、麻疹病毒(measlesvirus)、腮腺炎病毒(mumps virus)、狂犬病病毒(rabies virus)或流感病毒(influenza virus)，如当受试者是人时。
[0146]
替代地，受试者可以是脊椎动物、节肢动物或植物。
[0147]
还提供了：
[0148]
一种包含多个颗粒或vlp的组合物。
[0149]
任选地，组合物用于施用于人或动物受试者以治疗受试者的病毒感染或降低其风险，或治疗受试者的病毒感染的症状或降低其风险。例如，症状是受试者对病毒的炎症反应。例如，症状是受试者的炎症。任选地，组合物包含类固醇和/或另外的抗病毒剂，其具有减少所述病毒的复制、增殖或感染的功能。
[0150]
任选地，组合物包含在吸入器或喷雾器中。
[0151]
还提供了：
[0152]
一种治疗人或动物受试者的病毒感染或降低其风险的方法，该方法包含将组合物施用于受试者。
[0153]
还提供了：
[0154]
一种治疗人或动物受试者的病毒感染的症状(例如炎症)或降低其风险的方法，该方法包含将组合物施用于受试者。
[0155]
还提供了：
[0156]
一种抑制病毒在宿主细胞中复制的方法(例如，在受试者体外或体内)，其中该病毒包含rna基因组，该方法包含：
[0157]
a)使宿主细胞与如本文所述的vlp接触并将vlp rna引入宿主细胞；
[0158]
b)与步骤(a)同时地、在步骤(a)之后或在步骤(a)之前将病毒rna基因组引入宿主细胞；以及
[0159]
进行转录过程，其中vlp rna被转录以产生包含trs-ce2的转录物，并且vlp rna(或其拷贝)包含与trs-ce2杂交的trs-ce1，其中该过程产生包含序列(l)(任选地编码前导肽)的mrna，其中l包含trs-ce1，其中前导不可操作地连接到编码氨基酸序列(a)的rna序列，其中a是所述病毒复制、增殖或感染性所需的蛋白质的氨基酸。
[0160]
任选地，转录物中的trs-ce2紧接编码所述病毒的复制、增殖或感染性所不需要的蛋白质的rna序列的3
′
；或者转录物紧接不编码可读框(orf)的rna序列的3
′
。
[0161]
任选地，转录物是负链单链rna并且病毒rna是正链单链rna。
[0162]
sars-cov病毒的基因组前导编码序列可从以下列出的基因库登录号获得：gz02，ay390556；hzs2-bb，ay395004；zs-c，ay395003；cuhk-lc5，ay395002；cuhk-lc4，ay395001；cuhk-lc3，ay395000；cuhk-lc2，ay394999；zs-a，ay394997；zs-b，ay394996；hsz-cc，ay394995；hsz-bc，ay394994；hgz8l2，ay394993；hzs2-c，ay394992；hzs2-fc，ay394991；hzs2-e，ay394990；hzs2-d，ay394989；jmday394988；hzs2-fb，ay394987；hsz-cb，ay394986；tw3，ay502926；bj04，ay279354；hgz8l1-a，ay394981；hgz8l1-b，ay394982；zs-c，ay395003；hsz2-a，ay394983；gz-c，ay394979；tor2，nc_004718；bj01，ay539954；whu，ay394850；ns-1，ay508724；tw10，ay502923；tw2，ay502925；上海qxcl，ay463059；zj01，ay286320；shanghaiqxc2，ay463060；gd69，ay313906；fra，ay310120；sod，ay461660；西诺(sinol)1-11，ay485277；cuhk-ag03，ay345988；cuhk-ag02，ay345987；cuhk-ag01，ay345986；cuhk-sul0，ay282752；pumc03，ay357076；pumc02，ay357075；pumc01，ay350750；gz50，ay304495；sz16，ay304488；sz3，ay304486；as，ay427439；hsr 1，ay323977；sin2774，ay283798；hku-39849，ay278491；gd01，ay278489；twc2，ay362698；sin2748，ay283797；sin2679，ay283796；urbani，ay278741；zmy 1，ay351680；tw y，ap006561；tws，ap006560；cuhk-w1，ay278554；tc3，ay348314；tc2，ay338175；tc1，ay338174；twc，ay321118；frankfurt 1，ay291315；sino3-11：ay485278；bj03，ay278490；bj02，ay278487；zj01，ay297028；tw1，ay291451，其序列及其前导序列、trs和trs-ce序列通过引用明确并入本文，用于本发明。
[0163]
可产生仅包封一种rna设计(例如，来自实例1的设计1)或2种、3种或更多种设计(例如，其中每种vlp包含一种类型的rna设计)的vlp。在这种情况下，产生了不同vlp的混合物，这可用于逃避受试者或一般人或动物群体中病毒对rna产生的任何抗性。
[0164]
在实施例中，可生产仅包封一种rna设计(例如，设计1)的第一vlp，并且可生产仅
包封一种rna设计(例如，设计2)的第二vlp，其不同于用于第一vlp的设计。可以将第一种vlp和第二种vlp同时或依次施用于患有cov或有cov风险的受试者，例如sars-cov2或sars-cov感染。施用可以是向肺施用。
[0165]
在实例中，本发明的每个ce包含在如下表3所示的trs序列中。在实例中，vlp rna包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个编码相应mrna的序列，其中每个序列包含如本文所公开的trs，例如表3中所示的trs序列。例如，颗粒rna包含此类序列，或颗粒rna的互补序列(例如100％互补序列)包含此类序列，或颗粒rna可在宿主细胞中转录(或被转录)以产生包含此类序列的转录物。
[0166]
任选地，每个序列可操作地连接到相应的启动子以在宿主细胞中表达该序列。任选地，一个或多个或所有启动子是u6启动子。
[0167]
在实施例中，该方法的颗粒或组合物能够减少不同病毒的复制。例如，病毒是包含相同ce(例如trs-l ce和/或trs-b ce)的病毒。例如，病毒是cov病毒，例如，第一种病毒是sars-cov，并且另一种病毒是sars-cov-2。为此目的，有利地，颗粒rna可包含实例1的表2中所示的trs序列(或2、3、4或更多个此类序列)。替代地，有利地为此目的，颗粒rna可在宿主细胞中转录(或被转录)以产生包含表2中所示序列(或2、3、4或更多个此类序列)的rna。如实例1中所示，在除此的所有情况下，trs序列的比较显着地显示了与每个orf相关的sars-coy和sars-cov-2 trs之间的同一性，并且在例外的情况下，除了在一个位置存在同一性。因此，本发明人己经认识到在本发明的rna中利用这些序列来产生可减少这些病毒的复制的颗粒或组合物或方法。因此，在另一实例中，有利地为此目的，颗粒rna可包含或可在宿主细胞中转录(或被转录)以产生包含选自5
′‑
acgaac-3
′
和5
′‑
guucgu-3
′
的序列(或2、3、4或更多个此类序列)的rna。例如，颗粒rna是包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个序列的( )ss rna，其中每个序列包含5
′‑
acgaac-3
′
；并且任选地，病毒是( )ss rna，如cov，其rna基因组包含一个或多个5
′‑
acgaac-3
′
序列。例如，颗粒rna可在宿主细胞中转录(或被转录)以产生包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个序列的( )ss rna，其中每个序列包含5
′‑
acgaac-3
′
；并且任选地，病毒是( )ss rna，如cov，其rna基因组包含一个或多个5
′‑
acgaac-3
′
序列。例如，颗粒rna可在宿主细胞中转录(或被转录)以产生包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个序列的(-)ss rna，其中每个序列包含5
′‑
guucgu-3
′
；并且任选地，病毒是( )ss rna，如cov，其rna基因组包含一个或多个5
′‑
acgaac-3
′
序列。例如，颗粒rna是包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个序列的(-)ss rna，其中每个序列包含5
′‑
guucgu-3
′
；并且任选地，病毒是( )ss rna，如cov，其rna基因组包含一个或多个5
′‑
acgaac-3
′
序列。5
′‑
acgaac-3
′
可以包含表1或2中公开的trs序列。5
′‑
guucgu-3
′
可以包含表1或2中公开的trs序列的100％互补序列。如下所述，本发明还提供了rna本身，无论是否包含颗粒。此类rna可以是根据本段中公开的任何rna或与本文中的vlp rna相关的任何rna。
[0168]
在实例中，vlp rna是病毒rna基因组大小的50至150或80至120％(优选90至110％)或100％，并且vlp rna是通过用rna序列替换病毒rna的每个orf的一些或全部序列而获得或可获得的，该rna序列是其替换的orf序列大小的50至150或80至120％(优选90至110％)或100％，其中使病毒的每个orf无功能，但病毒rna的trs序列保留在vlp rna中。在替代方案中，仅s、m、e和n基因的orf被rna序列替换。用于替换orf的rna序列可以是非病毒序列或可以编码用于抑制病毒复制、增殖或感染的蛋白质(如抗病毒剂，例如干扰素)。
[0169]
rna、dna和组合物
[0170]
在配置中，提供了本发明的rna或其互补序列或转录物的rna(其可以包含或不包含vlp或其它颗粒)。例如，它可以是本发明颗粒所包含的rna的rna转录物。例如，病毒基因组rna是ssrna，本发明的rna是与病毒基因组ssrna有相同意义(阳性或阴性)的ssrna。
[0171]
在实例中，提供了包含本发明rna的100％互补序列的rna(即，互补序列在沿其长度的每个位置与其它rna互补)。在实例中，提供了包含与本发明的rna长度上不少于其位置的80、90、95、96、97、98或99％互补的序列的rna。
[0172]
在实例中，提供了一种包含与本发明的rna的序列100％互补的序列(即，该互补序列在沿其长度的每个位置与另一rna序列互补)的rna，其中本发明的rna的序列包含所述ce或trs(或其互补序列)。在实例中，提供了一种包含与本发明的rna的rna序列在沿其长度不少于80、90、95、96、97、98或99％的位置互补的序列的rna，其中本发明rna的序列包含所述ce或trs(或其互补序列)。
[0173]
在实例中，本文的rna是( )ssrna；或(-)ssrna。在实例中，本文的rna是施用于人或动物受试者用于治疗或预防受试者病毒感染的( )ssrna，其中病毒是( )ssrna病毒。在实例中，本文的rna是施用于人或动物受试者用于治疗或预防受试者病毒感染的(-)ssrna，其中病毒是(-)ssrna病毒。
[0174]
在另一配置中，提供了编码本文所述rna的dna。任选地，dna包含在vlp或其它颗粒中，例如包含纳米颗粒或脂质体，其能够将dna导入细胞中用于在细胞中转录以产生其rna转录物，如本发明的rna。例如，rna转录物是本文公开的任何rna，例如本文描述的( )ssrna。在实例中，dna是单链dna或双链dna。在实例中，dna是如本文所述的rna(如( )ssrna或(-)ssrna)的ssdna互补序列(如至少80、90、56或99％互补序列，或100％互补序列)。在实例中，dna是编码如本文所述的rna(如( )ssrna或(-)ssrna)的ssdna的ssdna互补序列(如至少80、90、56或99％互补序列，或100％互补序列)。在实例中，dna编码( )ssrna；或(-)ssrna。在实例中，dna编码( )ssrna用于施用于人或动物受试者以治疗或预防受试者的病毒感染，其中病毒是( )ssrna病毒。在实例中，dna编码(-)ssrna用于施用于人或动物受试者以治疗或预防受试者的病毒感染，其中病毒是(-)ssrna病毒。任选地，本文的rna或dna分别通过例如使用基因枪将rna或dna注射入患者体内来施用(或用于施用)于人或动物受试者。
[0175]
将本文任何dna或rna施用于受试者可以通过将递送载体(例如选自脂质体、颗粒、外来体、微泡和病毒载体)施用于受试者来进行。例如，参考wo2016165825a1中例如合适的颗粒和制造方法，其描述并入本文以用于本发明。
[0176]
本发明的dna可以包含在表达载体中，其中载体包含用于转录dna以产生其rna转录物的启动子。此类转录可以在受试者的宿主细胞(例如人细胞，如肺、肾或心脏细胞)中进行以产生本发明的rna。在替代方案中，此类转录可以在生产细胞系(例如人细胞系，如肺、肾或心脏细胞系)中进行，其中生产细胞系产生多种本发明的rna。
[0177]
在实例中，本发明提供了一种产生多个颗粒的方法，该方法包含将多个颗粒(例如，vlp、脂质体、纳米颗粒、外来体或微泡)与多个本发明的rna(例如，其中rna是相同的)组合，其中至少一种rna掺入多个颗粒的相应颗粒中和/或上；并且任选地配制颗粒以产生用于施用于人或动物受试者以治疗或预防病毒感染的药物组合物。在实例中，本发明提供了
一种产生由一种或多种类型的蛋白质(如病毒的结构蛋白，例如病毒衣壳和/或刺突蛋白，例如s、m和e(并且任选地还有n)蛋白)形成的多个颗粒的方法，该方法包含在本发明的多个rna(例如其中所述rna是相同的)存在下将所述蛋白质形成为多个颗粒(例如vlp、脂质体、纳米颗粒、外来体或微泡)，其中至少一种rna掺入所述多个颗粒的相应颗粒中和/或其上；并且任选地配制颗粒以产生用于施用于人或动物受试者以治疗或预防病毒感染的药物组合物。任选地，提供了通过该方法获得或可获得的此类组合物。一种替代的组合物包含本文所述的多种dna或rna，例如使用基因枪施用于受试者的裸dna或rna。在替代方案中，使用如本文所述的dna代替方法中的rna。
[0178]
例如，组合物包含在药物施用装置或容器中，如吸入器、iv袋、注射器或注射笔。在实例中，组合物包含稀释剂、赋形剂或载体。实例载体是吸入载体，其中组合物通过吸入施用于受试者以治疗或预防病毒感染。在实例中，组合物进一步包含类固醇。在实例中，组合物进一步包含抗炎剂(例如nsaid，如皮质类固醇)。在实例中，组合物进一步包含抗病毒剂，例如干扰素(如α-或β-干扰素)。
[0179]
在实例中，抗病毒剂选自：
[0180]
[0181][0182]
本发明还提供了一种检测样品中病毒rna的方法，其中病毒使用不连续rna转录过程进行复制，该不连续rna转录过程包含使第一trs-ce(例如ce1)与第二trs-ce(例如ce2)杂交，该方法包含使样品与本发明的rna接触并检测本发明的rna和样品所包含的病毒rna之间形成的杂交体。任选地，该方法包含检测本发明的rna与病毒的( )ss rna基因组、病毒的mrna、病毒的sgrna或病毒的(-)ssrna的杂交体的存在。任选地，该方法包含使用受试者的样品(例如血液样品)进行如本文所述的检测方法。
[0183]
在实例中，该方法是一种用于在已经获得样品的人或动物受试者中诊断病毒感染的方法。
[0184]
本发明提供了：本文所述的本发明的任何rna用于诊断人或动物受试者中的病毒感染的用途，其中该病毒使用不连续rna转录过程进行复制。任选地，该用途包含检测本发明的rna与病毒的rna(例如，病毒的( )ss rna基因组、病毒的mrna、病毒的sgrna或病毒的(-)ssrna)的杂交体的存在。任选地，该用途包括使用受试者的样品(例如血液样品)进行如本文所述的检测方法。
[0185]
可以通过检测本发明的rna所包含或附着的标记来进行检测。本发明的rna可以固定在固体支持物上(例如平板或珠子上，如磁珠)，这是本领域技术人员熟悉的测试或测定知识。本领域技术人员也熟悉合适的标记和标签，如荧光标签、rna标签(例如rna条形码)、化学标记、放射同种型标记或其它标记。在实例中，检测方法是elisa测定。标记(例如荧光标记)的检测可包含测定样品中标记的量和/或可以包括将样品中标记的量与参考量进行比较，该参考量是使用阳性对照测定的，该阳性对照包含与用相同标记标记的本发明rna杂交的病毒rna。
[0186]
合适的样品可以是包含从人或动物受试者获得的细胞的样品，例如血液、口腔、阴道、鼻、肺、肾或心脏细胞；或受试者的上皮或粘膜细胞。优选地，细胞是人上皮或粘膜细胞，例如人的口或咽喉细胞，如使用拭子获得的细胞。在实例中，样品是血液、血清、痰或唾液样品。例如，病毒是冠状病毒，并且样品是痰样品。例如，病毒是冠状病毒，并且样品是肺细胞样品。例如，病毒是冠状病毒，并且样品是口腔细胞样品。例如，病毒是冠状病毒，并且样品是口部细胞样品。例如，病毒是冠状病毒，并且样品是咽喉细胞样品。该方法或用途可以包括从样品中获得病毒rna，例如通过裂解样品所包含的宿主细胞，这可以在样品与本发明的标记或标记的rna接触之前进行。
[0187]
代替在方法或用途中将本发明的rna与病毒rna杂交，或者本发明的dna可与病毒rna杂交，例如，其中dna固定在固体支持物上。在实例中，病毒rna是( )ssrna并且dna是(-)ssdna。在另一实例中，病毒rna是(-)ssrna并且dna是( )ssdna。
[0188]
( )ssrna
[0189]
本发明还提供了与本文公开的颗粒或vlp rna相同的分离的rna。还提供了多种此类rna，其中该rna是相同的。替代地，多个rna包含彼此不同的第一和第二此类rna。多种rna可包含在组合物中，如本文公开的药物组合物或用于诊断或检测方法或用途的组合物。
[0190]
本发明的配置提供了：
[0191]
正链单链rna(( )ssrna)，其中rna包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个)序列，该序列中的每一个是(i)具有( )ssrna基因组的病毒(例如，本文公开的任何此类病毒，如cov)的转录调控序列核心元件(trs-l ce)序列或(ii)病毒的trs-b ce的互补序列(cs)，其中rna不含病毒的一个、多个或所有可读框(orf)序列或其互补序列。
[0192]
在实例中，(i)的每个ce包含在trs-l序列中。在实例中，(ii)的每个cs包含trs-b序列的互补序列。在实例中，所述序列的5
′‑
most是trs-l序列，并且其它序列中的每一个是病毒的trs-b序列的互补序列。
[0193]
当在宿主细胞中时，如上所述，(i)的ce能够与(-)ssrna的trs-b e杂交。当该trs-b包含在病毒生命周期中产生的(-)ssrna互补链中时，(i)的ce当在本发明的rna中对于如上所述的转录和/或翻译的起始可能是无功能的，从而对于病毒复制所需的病毒蛋白的表达是无功能的。因此，如上所述，这为负链、转录和翻译提供了与病毒的竞争。因此，病毒复制减少。
[0194]
当在如上所述的宿主细胞中时，本发明的( )ss rna的cs能够在(-)ssrna转录物中被转录，该转录物包含能够与病毒的( )ssrna的trl-ce杂交的ce。该杂交体对于病毒的orf蛋白产物的生产是无功能的。因此，提供了与病毒对正链、转录和翻译的竞争，如上所述。此外，任何表达的、截短的或其它有缺陷的病毒蛋白可与野生型病毒蛋白竞争，导致宿主细胞中有缺陷的或非生产性的病毒产生。因此，病毒复制减少。
[0195]
另一配置提供了：
[0196]
一种( )ssrna(任选地，如紧接前一段落所描述的rna)，其包含多个序列，每个序列包含病毒的trs-b ce的互补序列(cs)，其中rna不含病毒的一个、多个或所有可读框(orf)序列。
[0197]
这里，病毒是( )ssrna基因组病毒，并且每个cs是与( )ssrna病毒基因组互补的(-)ssrna所包含的trs-b ce的互补序列。在实例中，本发明rna的每个cs之间的互补性在ce-trs-b ce的多个连续核苷酸上进行比较(例如，在至少6个连续核苷酸的相同长度上进行比较，如6、7或8个连续核苷酸)。
[0198]
任选地，每个cs与病毒的trs-b ce序列100％互补，或者除了1、2或3(优选1)个核苷酸位置之外100％互补。
[0199]
病毒( )ssrna基因组包含trs-前导(trs-l)序列，其中trs-l包含ce，并且病毒具有生命周期，该生命周期包含在trs-l ce与第二ce杂交的过程中转录以产生mrna，其中第二ce包含在trs-体(trs-b)中，其中trs-b包含在(-)ssrna中，该(-)ssrna是病毒的( )
ssrna的互补序列并且其中每种mrna包含orf。如本领域技术人员所知，orf编码蛋白质产物。
[0200]
优选地，本发明的( )ssrna的每个ce或cs紧接在编码该病毒的( )ssrna的截短的(例如，c末端截短的)或突变的orf的rna序列的5
′
。例如，与病毒( )ssrna的完整对应orf相比，rna序列被截短，并且包含(a)病毒( )ssrna中orf的前5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、80、100或150个连续核苷酸(即，5
′‑
most核苷酸)；或(ii)病毒( )ssrna的orf序列的不超过70、60、50、40、30、30或10％的连续核苷酸。例如，与病毒rna基因组的完整s orf相比，rna序列被截短，并且包含(a)病毒( )ssrna中orf的前5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、80、100或150个连续核苷酸；或(ii)病毒( )ssrna的orf序列的不超过70、60、50、40、30、30或10％的连续核苷酸。例如，与病毒rna基因组的完整e orf相比，rna序列被截短，并且包含(a)病毒( )ssrna中orf的前5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、80、100或150个连续核苷酸；或(ii)病毒( )ssrna的orf序列的不超过70、60、50、40、30、30或10％的连续核苷酸。例如，与病毒rna基因组的完整m orf相比，rna序列被截短，并且包含(a)病毒( )ssrna中orf的前5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、80、100或150个连续核苷酸；或(ii)病毒( )ssrna的orf序列的不超过70、60、50、40、30、30或10％的连续核苷酸。例如，与病毒rna基因组的完整n orf相比，rna序列被截短，并且包含(a)病毒( )ssrna中orf的前5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、80、100或150个连续核苷酸；或(ii)病毒( )ssrna的orf序列的不超过70、60、50、40、30、30或10％的连续核苷酸。特征(a)可用于保存天然病毒trs/orf序列连接，用于例如在细胞中正确转录和/或翻译本发明的rna的该部分。截短或突变的序列可被翻译成由病毒orf编码的对应突变或截短形式的蛋白质(例如，形成截短或突变的s、e、m或n)，其对病毒复制、增殖或感染性无功能。以这种方式，本发明的rna在宿主细胞中不能自我复制形成病毒颗粒。对于控制目的是有用的，使得病毒颗粒的产生是不可能的。
[0201]
在本发明的rna的实例中，第一(5
′‑
most)cs是病毒的trs前导序列(trs-l)所包含的ce的互补序列(例如，100％互补序列)。替代地，第一cs是病毒的trs-体(trs-b)序列所包含的ce的互补序列。
[0202]
优选地，本文的互补序列可以是另一序列的100％互补序列。在替代方案中，除了在1、2或3个核苷酸位置处，互补序列可以与其它序列(例如，其它ce)完全互补，例如，ce序列5
′‑
acgaac-3
′
与序列5
′‑
guucgu-3
′
100％互补；而5
′‑
acgaac-3
′
与序列5
′‑
uuucgu-3
′
(例如，当在宿主细胞如人细胞中时)互补，但该序列彼此不是100％互补的。
[0203]
在实例中，
[0204]
(a)本发明的( )ssrna在5
′
至3
′
方向上包含第一cs和第二cs，其中该第一cs是病毒的trs-l所包含的ce，并且该第二cs是病毒的第一trs-b所包含的ce的互补序列，其中该病毒是( )ssrna病毒；并且任选地，本发明的( )ssrna包含第三ce，该第三ce是病毒的第二trs-b所包含的ce的互补序列；
[0205]
(b)本发明的( )ssrna在5
′
至3
′
方向上包含第一cs和第二cs，其中该第二cs是病毒的第一trs-b所包含的ce的互补序列，并且该第一cs是病毒的第二trs-b所包含的ce的互补序列，其中该病毒是( )ssrna病毒；并且任选地，本发明的( )ssrna包含第三cs，该第三cs是病毒的另外的trs-b所包含的ce的互补序列；或
[0206]
(c)本发明的( )ssrna在5
′
至3
′
方向上包含ce和第一cs，该ce是由病毒的trs-l所
包含的，并且该第一cs是病毒的第一trs-b所包含的ce的互补序列，其中该病毒是( )ssrna病毒；并且任选地，本发明的( )ssrna包含第二cs，该第二cs是病毒的第二trs-b所包含的ce的互补序列。
[0207]“病毒的trs-l”在此应理解为指病毒( )ssrna的trs-l。“病毒的trs-b”在此应理解为指病毒( )ssrna的互补序列的trs-b，其中该互补序列是负链单链rna((-)ssrna)。此类(-)ssrna可以是通常在病毒复制期间制备的链，这对于( )ssrna病毒是典型的，并且对于本领域技术人员是显而易见的。
[0208]
第一和第二cs可以彼此相同。第二和第三cs可以彼此相同。所有的cs可以彼此相同。cs(并且任选地还有ce)可以具有相同的核苷酸长度(例如，6、7或8个连续核苷酸)。任选地，第一cs可以是第一trs-b的ce的100％互补序列。a100％互补是指第一cs的序列在其整个长度上与ce互补，即第一cs的每个核苷酸是ce的对应核苷酸的互补，使得第一cs的5
′‑
most核苷酸是ce的3
′‑
most核苷酸的互补，以此类推。
[0209]
在实例中，本发明的rna或其互补序列不含病毒的一个、多个或所有可读框(orf)序列，并且每个所述orf是选自orf1a、orf1b、orf3a、orf6、orf 7a、orf7b、orf8a、orf8b、orf10、编码蛋白s的orf、编码蛋白e的orf、编码蛋白m的orf和编码蛋白n的orf的cov orf。任选地，本发明的rna或其互补序列不含编码蛋白s的orf、编码蛋白e的orf、编码蛋白m的orf和编码蛋白n的orf中的一种、两种、三种或全部。例如，本发明的rna或其互补序列不含编码蛋白s的orf。例如，本发明的rna或其互补序列不含编码蛋白e的orf。例如，本发明的rna或其互补序列不含编码蛋白m的orf。例如，本发明的rna或其互补序列不含编码蛋白n的orf。例如，病毒是sars-或mers-cov，如sars-cov或sars-cov-2。
[0210]
在实施例中，( )ssrna是mrna。例如，rna能够在宿主细胞(例如，本文公开的任何宿主细胞)中转录以产生其互补序列rna，其中该互补序列是负链单链rna((-)ssrna)。任选地，互补序列rna包含( )ssrna的一个(或每个)trs-ce的互补序列。例如，(-)ssrna所包含的每个trs-ce互补序列都包含在相应的trs体(trs-b)序列中。
[0211]
任选地，rna包含5
′
甲基化帽和3
′
多聚a尾序列。
[0212]
本发明的rna可以是重组或分离的rna。分离的rna可以是不含细胞物质或颗粒或不与互补rna或互补dna结合的rna。在替代方案中，rna可与互补rna或互补dna结合。
[0213]
在实例中，( )ssrna不与dna混合。在实例中，( )ssrna不与互补dna(即能够与rna杂交的dna，如当rna存在于宿主细胞如人宿主细胞中时)混合。在实例中，( )ssrna不与互补rna(即，能够与rna杂交的rna，如当rna存在于宿主细胞如人宿主细胞中时)混合。
[0214]
还提供了包含多个本发明的( )ssrna的组合物。在实例中，rna是相同的。在另一实例中，组合物包含本发明的不同( )ssrna(例如，包含trs-b互补序列的序列不同，任选地其中trs-b包含共同的ce序列，其中ce序列与病毒( )ssrna基因组所包含的trs-ce序列100％相同)。
[0215]
(-)ssrna和dna
[0216]
本发明还提供了分离的(-)ss rna，其与本文公开的颗粒或vlp rna或其互补序列相同。还提供了多种此类rna，其中该rna是相同的。替代地，多个rna包含彼此不同的第一和第二此类rna。多种rna可包含在组合物中，如本文公开的药物组合物或用于诊断或检测方法或用途的组合物。
[0217]
本发明的配置提供了：
[0218]
负链单链rna((-)ssrna)，其中rna包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个)序列，该序列中的每一个是(i)具有( )ssrna基因组的病毒(例如，本文公开的任何此类病毒，如cov)的转录调控序列核心元件(trs-l ce)序列的互补序列(cs)或(ii)病毒的trs-b ce，其中rna不含病毒的一个、多个或所有可读框(orf)序列或其互补序列。
[0219]
在实例中，(i)的每个cs包含trs-l序列的互补序列。在实例中，(ii)的每个ce包含在trs-b序列中。在实例中，所述序列的3
′‑
most是trs-l序列的互补序列，并且其它序列中的每一个是病毒的trs-b序列。
[0220]
当在如上所述的宿主细胞中时，(i)的cs能够与( )ssrna的trs-l ce杂交。当该trs-l包含在病毒生命周期中产生的( )ssrna链中时，(i)的cs当在本发明的rna中时可使( )ss rna对转录和/或翻译的起始无功能，从而对病毒复制所需的病毒蛋白的表达是无功能的。因此，提供了与病毒对正链、转录和翻译的竞争，如上所述。因此，病毒复制减少。
[0221]
当在如上所述的宿主细胞中时，本发明的(-)ss rna的每个ce能够与病毒的( )ssrna的trl-ce杂交。该杂交体对于病毒的orf蛋白产物的生产是无功能的。因此，提供了与病毒对正链、转录和翻译的竞争，如上所述。此外，任何表达的、截短的或其它有缺陷的病毒蛋白可与野生型病毒蛋白竞争，导致宿主细胞中有缺陷的或非生产性的病毒产生。因此，病毒复制减少。
[0222]
另一配置提供了：
[0223]
一种(-)ssrna(任选地，如紧接前一段落所描述的rna)，其包含多个序列，每个序列包含病毒的trs-b ce，其中rna不含病毒的一个、多个或所有可读框(orf)序列或其互补序列。
[0224]
任选地，每个ce与病毒的trs-b ce序列100％相同，或者除了1、2或3(优选1)个核苷酸位置之外100％相同。
[0225]
优选地，本发明的( )ssrna的每个ce或cs紧接在编码该病毒的( )ssrna的截短的(例如，c末端截短的)或突变的orf的rna序列的互补序列的3
′
。例如，与病毒( )ssrna的完整对应orf相比，rna序列被截短，并且包含(a)病毒( )ssrna中orf的前5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、80、100或150个连续核苷酸(即，5
′‑
most核苷酸)；或
[0226]
(ii)病毒( )ssrna的orf序列的不超过70、60、50、40、30、30或10％的连续核苷酸。例如，与病毒rna基因组的完整s orf相比，rna序列被截短，并且包含(a)病毒( )ssrna中orf的前5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、80、100或150个连续核苷酸；或(ii)病毒( )ssrna的orf序列的不超过70、60、50、40、30、30或10％的连续核苷酸。例如，与病毒rna基因组的完整e orf相比，rna序列被截短，并且包含(a)病毒( )ssrna中orf的前5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、80、100或150个连续核苷酸；或(ii)病毒( )ssrna的orf序列的不超过70、60、50、40、30、30或10％的连续核苷酸。例如，与病毒rna基因组的完整m orf相比，rna序列被截短，并且包含(a)病毒( )ssrna中orf的前5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、80、100或150个连续核苷酸；或(ii)病毒( )ssrna的orf序列的不超过70、60、50、40、30、30或10％的连续核苷酸。例如，与病毒rna基因组的完整n orf相比，rna序列被截短，并且包含(a)病毒( )ssrna中orf的前5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、80、100或150个连续核苷酸；或
(ii)病毒( )ssrna的orf序列的不超过70、60、50、40、30、30或10％的连续核苷酸。特征(a)可用于保存天然病毒trs/orf序列连接，用于例如在细胞中正确转录和/或翻译本发明的rna的该部分。截短或突变的序列可被翻译成由病毒orf编码的对应突变或截短形式的蛋白质(例如，形成截短或突变的s、e、m或n)，其对病毒复制、增殖或感染性无功能。以这种方式，本发明的rna在宿主细胞中不能自我复制形成病毒颗粒。对于控制目的是有用的，使得病毒颗粒的产生是不可能的。
[0227]
在本发明的(-)ss rna的实例中，最后的(3
′‑
most)cs是病毒的( )ss rna的trs-前导序列(trs-l)所包含的ce的互补序列(例如，100％互补序列)。此外或替代地，第一ce是病毒的trs-体(trs-b)ce序列。
[0228]
在实例中，
[0229]
(a)本发明的( )ssrna在3
′
至5
′
方向上包含第一cs和第二cs，其中该第一cs是病毒的trs-l所包含的ce的互补序列，并且该第二cs是病毒的第一trs-l所包含的ce的互补序列，其中该病毒是( )ssrna病毒；并且任选地，本发明的(-)ssrna包含第三cs，该第三cs是病毒的trs-l所包含的ce的互补序列；或
[0230]
(b)本发明的(-)ssrna在3
′
至5
′
方向上包含第一ce和第二ce，其中该第二ce是病毒的第一trs-b所包含的ce，并且该第一ce是病毒的第二trs-b所包含的ce，其中该病毒是( )ssrna病毒；并且任选地，本发明的(-)ssrna包含第三ce，该第三ce是病毒的另外的trs-b所包含的ce。
[0231]“病毒的trs-l”在此应理解为指病毒( )ssrna的trs-l。“病毒的trs-b”在此应理解为指病毒( )ssrna的互补序列的trs-b，其中该互补序列是负链单链rna((-)ssrna)。此类(-)ssrna可以是通常在病毒复制期间制备的链，这对于( )ssrna病毒是典型的，并且对于本领域技术人员是显而易见的。
[0232]
第一和第二cs可以彼此相同。第一和第二ce可以彼此相同。第二和第三ce可以彼此相同。所有的cs可以彼此相同。所有的ce可以彼此相同。ce(并且任选地还有cs)可以具有相同的核苷酸长度(例如，6、7或8个连续核苷酸)。任选地，第一ce可以与第一trs-b的ce 100％相同。
[0233]
本发明的(-)ss rna可以是重组或分离的rna。分离的rna可以是不含细胞物质或颗粒或不与互补rna或互补dna结合的rna。在替代方案中，rna可与互补rna或互补dna结合。
[0234]
在实例中，(-)ss rna不与dna混合。在实例中，(-)ssrna不与互补dna(即能够与rna杂交的dna，如当rna存在于宿主细胞如人宿主细胞中时)混合。在实例中，(-)ssrna不与互补rna(即，能够与rna杂交的rna，如当rna存在于宿主细胞如人宿主细胞中时)混合。
[0235]
还提供了包含多个本发明的(-)ssrna的组合物。在实例中，rna是相同的。在另一实例中，组合物包含本发明的不同(-)ssrna(例如，包含trs-b的序列不同，任选地其中trs-b包含共同的ce序列，其中ce序列与病毒( )ssrna基因组所包含的trs-ce序列100％相同)。
[0236]
本发明还提供了包含与本发明的( )链rna的rna序列互补(例如100％互补)的dna序列或由其组成的(-)链dna。任选地，dna序列可操作地连接到启动子，用于使用dna作为模板转录rna。启动子通常是dna链中dna序列的5
′
。转录可以在生产细胞中进行，如真核、原核、哺乳动物、酵母、人、昆虫或啮齿动物细胞。例如，生产细胞是hek293细胞。例如，生产细胞是cos细胞。例如，生产细胞是cho细胞。
[0237]
因此，在配置中，提供了：
[0238]
一种产生本发明的多种rna的方法，其中该方法不含使用生产细胞的编码rna的核酸在生产细胞中表达rna，并任选地从细胞中分离多种rna。
[0239]
在实例中，生产细胞核酸是本发明的(-)链dna；在另一实例中，生产细胞核酸是本发明的(-)链rna；并且任选地，病毒是( )ss rna病毒。因此，产生了多种( )ss rna，其可用于本文的检测或诊断方法或用途，其中病毒是( )ssrna病毒。替代地，产生多种( )ss rnas，其可在用( )ss rna病毒感染细胞之前、之后或同时引入宿主细胞，用于与病毒竞争并减少其复制，如本文所描述的。在实例中，因此，提供：
[0240]
一种产生本发明的颗粒(例如，vlp)的方法，该方法包含将所述多种rna与病毒的多种结构蛋白或衣壳蛋白组合，由此形成的颗粒各自包含一种或多种rna；并且任选地，该方法包含分离颗粒(例如，以产生其中颗粒不与非颗粒相关联rna混合的组合物)。任选地，该组合物是如本文所述的药物组合物。
[0241]
概念：
[0242]
提供了以下概念；这些不应被解释为权利要求(本文中的权利要求在下文中，以标题“权利要求”开始：)。
[0243]
1.一种用于施用于人或动物受试者以治疗受试者的病毒感染或降低其风险的颗粒，其中所述病毒包含rna基因组，
[0244]
(a)其中所述病毒能够感染所述受试者的宿主细胞，所述病毒基因组包含rna序列(l)，其中l包含第一转录调控序列核心元件(trs-ce1)，其中所述病毒的复制包含第一亚基因组rna(sgrna1)的转录，(b)其中sgrna1包含第二转录调控序列核心元件(trs-ce2)，其中trs-ce1能够与在所述宿主细胞中的trs-ce2杂交；
[0245]
(c)其中所述颗粒包含rna，其中所述颗粒能够将所述颗粒rna引入所述受试者的宿主细胞中用于转录所述颗粒rna，其中所述颗粒rna或其转录物包含trs-ce；
[0246]
(d)其中当病毒rna与所述颗粒rna或所述转录物一起存在于宿主细胞中时，所述颗粒rna或转录物的所述trc-ce与所述病毒rna所包含的trs-ce杂交，其中所述杂交减少了病毒复制。
[0247]
在替代方案中，概念1提供了：
[0248]
一种用于施用于人或动物受试者以治疗受试者的病毒感染或降低其风险的颗粒(例如，病毒样颗粒(vlp))，其中所述病毒包含rna基因组，其中所述病毒能够感染所述受试者的宿主细胞(例如，人细胞)，所述病毒基因组包含rna序列(l)，其中l包含第一转录调控序列核心元件(trs-ce1)，其中所述病毒的复制包含第一亚基因组rna(sgrna1)的转录，其中sgrna1包含第二转录调控序列核心元件(trs-ce2)，其中trs-ce1能够在所述宿主细胞中与trs-ce2杂交；其中所述颗粒包含rna，其中所述颗粒能够将所述颗粒rna引入所述受试者的宿主细胞中用于转录所述颗粒rna，其中所述颗粒rna或其转录物
[0249]
(i)包含(a)trs-ce1或(b)能够在宿主细胞中与trs-ce1杂交的序列；和/或
[0250]
(ii)包含(a)trs-ce2或(b)能够在宿主细胞中与trs-ce2杂交的序列；
[0251]
其中当所述病毒rna与所述颗粒rna或所述转录物一起存在于宿主细胞中时，
[0252]
(iii)组分(i)(a)与由所述病毒rna编码的sgrna1所包含的trs-ce2杂交；
[0253]
(iv)组分(i)(b)与所述病毒rna所包含的trs-ce1杂交；
[0254]
(v)组分(ii)(a)与所述病毒rna所包含的trs-ce1杂交；和/或
[0255]
(vi)组分(ii)(b)与由所述病毒rna编码的sgrna1所包含的trs-ce2杂交；其中(iii)至(vi)中任一项所述的杂交减少了病毒复制。
[0256]
2.根据概念1所述的颗粒，其中：
[0257]
(a)所述颗粒rna(例如，( )ss rna)包含可操作用于蛋白质翻译的调控元件，其中所述调控元件可操作地连接组分(i)(a)或(ii)(b)的5
′
；
[0258]
(b)所述颗粒rna(例如，( )ss rna)包含组分(i)(a)或(ii)(b)，并且所述颗粒rna不含rna序列，所述rna序列是所述组分的3
′
并且可表达以产生所述病毒复制、增殖或感染性所需的蛋白质的氨基酸序列；
[0259]
(c)颗粒rna(例如，(-)ss rna)包含组分(i)(b)或(ii)(a)，并且所述颗粒rna不含rna序列，所述rna序列是所述组分的5
′
并且可表达以产生编码所述病毒复制、增殖或感染性所需的蛋白质的氨基酸序列的rna序列。
[0260]
3.根据前述概念中任一项所述的颗粒，其中所述颗粒rna(例如，(-)ss rna)或其转录物(例如，(-)ss rna转录物)包含trs-ce的多个拷贝，每个拷贝能够在宿主细胞中与trs-ce1杂交，其中所述trs-ce的拷贝中没有一个可操作地连接到rna序列，所述rna序列可表达以产生编码所述病毒复制或增殖所必需的蛋白质的rna序列。
[0261]
4.根据前述概念中任一项所述的颗粒，其中所述颗粒rna能够在宿主细胞中进行复制。
[0262]
5.根据前述概念中任一项所述的颗粒，其中所述颗粒rna包含由所述病毒基因组编码的rna依赖性rna聚合酶(rdrp)识别和结合所需的调控元件；任选地，其中所述调控元件与所述病毒基因组所包含的调控元件相同。
[0263]
6.根据前述概念中任一项所述的颗粒，其中所述颗粒rna包含能够被病毒包装机器识别以将颗粒rna包装到能够感染宿主细胞的病毒衣壳的包装信号。
[0264]
7.根据前述概念中任一项所述的颗粒，其中由(iii)至(vi)中任-项产生的rna杂交体能够是由所述宿主细胞延伸的3
′
以产生rna产物，其中所述rna产物在所述细胞中对于所述病毒复制、增殖或感染性所需蛋白质的表达是非生产性的。
[0265]
8.根据前述概念中任一项所述的颗粒，其中所述颗粒包含所述宿主细胞的受体或配体，所述受体或配体与所述病毒用于结合所述宿主细胞的所述受体或配体相同；任选地，其中所述配体是病毒刺突糖蛋白和/或所述配体能够结合所述宿主细胞的表面上的ace2蛋白(例如，其中所述病毒是sars-cov或sars-cov-2病毒)或所述宿主细胞的所述表面上的dpp4蛋白(例如，其中所述病毒是mers-cov病毒)。
[0266]
9.根据前述概念中任一项所述的颗粒，其中
[0267]
(a)所述病毒的复制包含第一和第二亚基因组rna(sgrna)的转录，其中每个sgrna包含转录调控序列核心元件(trs-ce)，其中所述sgrna的每个trs-ce能够与宿主细胞中的所述颗粒rna所包含的trs-ce1的序列杂交；或
[0268]
(b)所述颗粒rna的转录产生第一和第二亚基因组rna(sgrna)，其中每个sgrna包含转录调控序列体核心元件(trs-b ce)，其中所述sgrna的每个trs-ce能够与宿主细胞中所述病毒rna所包含的trs-l ce1序列杂交。
[0269]
10.根据前述概念中任一项所述的颗粒，其中所述颗粒在所述受试者的细胞中(例
如，在人细胞中)是非自身复制的。
[0270]
11.根据前述概念中任一项所述的颗粒，其中所述病毒的所述rna基因组是正链rna基因组并且所述颗粒rna是正链rna。
[0271]
12.根据前述概念中任一项所述的颗粒，其中trs-ce1是6至12个连续核苷酸和/或trs-ce2是6至12个连续核苷酸。
[0272]
13.根据前述概念中任一项所述的颗粒，其中ce1在5
′
至3
′
方向上是acgaac和/或ce2在5
′
至3
′
方向上是guucgu。
[0273]
14.根据前述概念中任一项所述的颗粒，其中所述颗粒rna包含与ce2100％互补的rna序列，并且其中所述rna序列与ce1相同。
[0274]
15.根据前述概念中任一项所述的颗粒，其中ce2的所述序列与ce1 100％互补；或ce2在除了1、2或3个核苷酸之外的ce2的所有所述核苷酸上与ce1互补。
[0275]
16.根据前述概念中任一项所述的颗粒，其中trs-ce1包含在8至25个连续核苷酸的病毒转录调控序列(trs1)中和/或trs-ce2包含在8至30个连续核苷酸的病毒trs(trs2)中。
[0276]
17.根据概念16所述的颗粒，其中trs1在5
′
至3
′
方向包含序列nnn-ce1，其中ce1在所述trs1的3
′
末端；或nnn-ce1-nnn，其中每个n是选自a、u、c和g的任何核苷酸；任选地其中ce1在5
′
至3
′
方向上是acgaac。
[0277]
18.根据概念16或17所述的颗粒，其中trs1在5
′
至3
′
方向上包含，
[0278]
(a)uaa-ce1、ucucuaa-ce1、agu-ce1或ugagu-ce1；
[0279]
(b)ce1-uu、ce1-uuu、ce1-uaa、ce1-uaacu、ce1-uaaau或ce1-uu；
[0280]
(c)uaa-ce1-uu、uaa-ce1-uuu、ucucuaa-ce1-uuu、ggucuaa-ce1-uaacu、ggucuaa-ce1-uaaau、agu-ce1-uu或ugagu-ce1-uu；或
[0281]
(d)cuaa-ce1、uaa-ce1或ucuaa-ce1。
[0282]
19.根据概念16至18所述的颗粒，其中trs2在5
′
至3
′
方向上包含序列nnn-ce2，其中ce2在所述trs2的所述3
′
末端；或nnn-ce2-nnn，其中每个n是选自a、u、c和g的任何核苷酸；任选地其中ce2在5
′
至3
′
方向上是acgaac。
[0283]
20.根据概念16至19中任一项所述的颗粒，其中trs2在5
′
至3
′
方向上包含，
[0284]
(a)uaa-ce2、ucucuaa-ce2、agu-ce2或ugagu-ce2；
[0285]
(b)ce2-uu、ce2-uuu、ce2-uaa、ce2-uaacu、ce2-uaaau或ce2-uu；或
[0286]
(c)uaa-ce2-uu、uaa-ce2-uuu、ucucuaa-ce2-uuu、ggucuaa-ce2-uaacu、ggucuaa-ce2-uaaau、agu-ce2-uu或ugagu-ce2-uu；
[0287]
21.根据前述概念中任一项所述的颗粒，其中所述病毒选自套式病毒；冠状病毒亚科病毒；环曲病毒亚科病毒；sars或mers病毒；或sars-cov、sars-cov-2或mers-cov病毒。
[0288]
22.根据前述概念中任一项所述的颗粒，其中sgrna1是(-)ss rna，所述颗粒rna是( )ssrna并且所述病毒基因组是( )ss rna。
[0289]
23.根据前述概念中任一项所述的颗粒，其中所述颗粒rna
[0290]
(i)包含trs-ce1；和/或
[0291]
(ii)能够在宿主细胞中与trs-ce2杂交的序列；
[0292]
其中当所述病毒rna与所述颗粒rna一起存在于宿主细胞中时，
[0293]
(iii)组分(i)与由所述病毒rna编码的sgrna1所包含的trs-ce2杂交；和/或
[0294]
(iv)组分(ii)的互补序列与所述病毒rna所包含的trs-ce1杂交，其中(iii)和/或(iv)的所述杂交减少了病毒复制。
[0295]
24.根据前述概念中任一项所述的颗粒，其中
[0296]
(a)所述颗粒rna的cel of或所述颗粒的组分(ii)(b)的ce1包含trs-l序列，如与所述病毒的trs-l序列相同或至少90、95、96、97、98或99％相同的trs-l序列；和/或
[0297]
(b)所述颗粒rna或所述颗粒的组分(i)(b)的ce2包含在trs-b序列中，如与所述病毒的trs-b序列相同或至少90、95、96、97、98或99％相同的trs-b序列。
[0298]
25.根据前述概念中任一项所述的颗粒，其中所述颗粒rna不大于所述病毒rna基因组长度的120％。
[0299]
26.根据前述概念中任一项所述的颗粒，其中所述颗粒rna可通过用rna序列替换所述病毒rna基因组的每个可读框(orf)的部分或全部所述序列而获得，所述rna序列不超过它替换的所述orf序列大小的120％(优选100％)，其中使所述病毒的每个orf都变成无功能的，但所述病毒rna的所述trs序列保留在所述颗粒rna中。
[0300]
27.一种( )ssrna(任选地，如任何前述概念中所描述的rna)，所述rna包含多个序列，所述每个序列包含由感染人或动物受试者的宿主细胞的病毒产生的sgnra的trs-b ce的互补序列(cs)，其中所述( )ssrna不含所述病毒的一个、多个或所有可读框(orf)序列并且可在宿主细胞中转录以产生一个或多个转录物，所述每个转录物包含trs-b ce；其中每个trs-b ce能够与所述病毒的trs-lce杂交，由此每个转录物能够抑制
[0301]
一种或多种病毒orf蛋白产物的表达。
[0302]
28.根据概念27所述的rna，其中所述病毒是使用不连续rna转录进行复制的类型的( )ss rna病毒。
[0303]
29.根据概念27或28所述的rna，其中每个trs-b ce包含在相应转录物的trs-b中；任选地，其中所述trs-b包含概念19或20中所述的trs2序列。
[0304]
30.一种组合物，其包含多个根据前述概念中任一项所述的颗粒或rna。
[0305]
31.根据概念30所述的组合物，其用于施用于人或动物受试者以治疗所述受试者的病毒感染或降低其风险，或治疗所述受试者的病毒感染的症状或降低其风险。
[0306]
32.根据概念30或31所述的组合物，其中所述组合物包含在吸入器或喷雾器中；或包含在核酸注射装置中，如基因枪。
[0307]
33.一种治疗人或动物受试者的病毒感染或降低其风险的方法，所述方法包含将概念30、31或32的所述组合物施用于所述受试者。
[0308]
34.一种治疗人或动物受试者的病毒感染的症状(例如炎症)或降低其风险的方法，所述方法包含将概念30、31或32的所述组合物施用于所述受试者。
[0309]
35.一种抑制病毒在宿主细胞中复制的方法，其中所述病毒包含( )ss rna基因组，其中所述病毒基因组包含trs-lce并且编码包含trs-b ce(ce2)的sgrna转录物，所述方法包含
[0310]
a)使所述宿主细胞与本发明的颗粒或rna接触，并将本发明的所述rna(例如，颗粒rna)(下文称为第一rna)引入所述宿主细胞，其中所述第一rna是( )ss rna，所述( )ss rna包含是所述ce2的互补序列(例如，100％或至少80％互补序列)的序列；
[0311]
b)与步骤(a)同时地、在步骤(a)之后或在步骤(a)之前将所述病毒rna基因组引入所述宿主细胞；以及
[0312]
进行转录过程，其中所述第一rna在所述细胞中转录以产生包含ce2或能够与病毒trs-l ce杂交的序列的rna转录物，其中所述转录物与所述病毒的( )ss rna所包含的trs-l ce杂交以形成rna杂交体，并且所述杂交体用于产生包含前导序列(l)的mrna，其中所述前导不可操作地连接到编码所述病毒复制、增殖或感染性所需的蛋白质的氨基酸序列(a)的rna序列。
[0313]
任选地，所述杂交体在5
′
至3方向上延伸(例如，1、2、3或更多个密码子，任选地少于150个密码子)以产生所述mrna。
[0314]
36.根据概念35所述的方法，其中在所述转录物或所述序列中能够与病毒trs-l ce杂交的ces2紧接以下序列的3
′
：
[0315]
(a)编码mrna序列的rna序列，所述mrna序列可在宿主细胞中表达以产生所述病毒复制、增殖或感染性所不需要的蛋白质；或
[0316]
(b)rna序列，所述rna序列不包含可读框(orf)的互补序列；或
[0317]
(c)rna序列，所述rna序列不包含所述病毒的可读框(orf)的互补序列。
[0318]
37.一种产生多个颗粒的方法，所述方法包含将多个颗粒(例如vlp、脂质体、纳米颗粒、外来体或微泡)与多个rna组合，其中每个rna是本发明的rna，其中将至少一种rna掺入所述多个颗粒的相应颗粒中和/或上；并且任选地配制所述颗粒以产生用于施用于人或动物受试者以治疗或预防病毒感染的药物组合物。
[0319]
38.一种检测样品中病毒rna的方法，其中所述病毒使用不连续rna转录过程进行复制，所述不连续rna转录过程包含使第一trs-ce(ce1)与第二trs-ce(ce2)杂交，所述方法包含使所述样品与本发明中的rna(第一rna)接触并检测在所述第一rna和所述样品所包含的病毒rna之间形成的杂交体。
[0320]
39.一种包含dna序列的dna，所述dna序列是本发明rna的互补序列；任选地，其中所述dna序列可操作地连接到用于在宿主细胞中转录所述rna的启动子。
[0321]
40.本发明的rna或dna在诊断人或动物受试者中的病毒感染中的用途，其中所述病毒使用不连续rna转录过程进行复制。
[0322]
41.一种治疗或预防人或动物受试者中的病毒感染的方法，所述方法包含将本发明的颗粒或rna施用于所述受试者。
[0323]
应当理解，本文描述的特定实施例是通过说明而不是作为对本发明的限制而示出的。在不脱离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施例中。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规研究来确定本文描述的特定程序的许多等同物。此类等同物被认为是在本发明的范围内并且由权利要求覆盖。说明书中提及的所有出版物和专利申请都表明本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请(包括所有提及的专利申请和专利的美国等同物)都通过引用并入本文，其程度与每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指示通过引用并入的程度相同。当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”结合使用时，术语“一个(a/an)”的使用可以意指“一个(one)”，但它也与“一个或多个”，“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。权利要求中使用的术语“或”用于意指“和/或”，除非明确指出仅指备选方案或者备选方案是相互排斥的，尽管本公开支持仅指
备选方案和“和/或”的定义。在本技术中，术语“约”用于表示包括装置的误差的固有变化的值，用于确定该值的方法，或在研究对象中存在的变化。
[0324]
如在本说明书和权利要求中所使用的，词语“包含”(以及任何形式的包含，如“comprise和comprises”)，“具有”(以及任何形式的具有，如“have和has”)，“包括”(以及任何形式的包括，如“includes和include”)或“含有”(以及任何形式的含有，如“contains”和“contain”)是包括性的或开放式的，并且不排除附加的、未引用的元件或方法步骤。
[0325]
如本文所用的术语“或其组合”是指在该术语之前列出的项目的所有排列和组合。例如，“a、b、c或其组合”旨在包括以下至少一项：a、b、c、ab、ac、bc或abc，并且如果顺序在特定上下文中很重要，还包括ba、ca、cb、cba、bca、acb、bac或cab。继续该实例，明确包括的是包含一个或多个项目或术语的重复的组合，如bb、aaa、mb、bbc、aaabcccc、cbbaaa、cababb等。本领域技术人员将理解，通常对任何组合中的项目或术语的数量没有限制，除非从上下文中另外显而易见。
[0326]
本公开的任何部分可以与本公开的任何其它部分结合阅读，除非从上下文中另有明显意义。
[0327]
根据本公开内容，无需过多的实验就可以制造和实施本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法。虽然已经根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述的组合物和/或方法以及方法的步骤或步骤顺序进行改变。对本领域技术人员来说显而易见的所有这些类似的替代和修改被认为是在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。
[0328]
实例1：rna设计
[0329]
在sars-cov病毒和sars-cov-2病毒的基因组序列之间进行分析(下表2中的武汉)。如表2所示，将与病毒中各种orf相关的trs序列进行比对并显示出显著的类似性，使得能够进行下文详述的rna设计。
[0330]
表2：两种高致病性人冠状病毒(sars-cov和sars-cov-2)的trs序列比较
[0331][0332]
*
可读框(即-编码蛋白质)；
[0333]
**
sars trs是sars-cov的trs序列，如mara等人，“sars相关冠状病毒的基因组序列(the genome sequence ofthe sars-associated coronavirus)”，《科学(science)》2003年5月30，第300卷，5624期，第1399至1404页，doi：10.1126/science.1085953中所描述的，其中的公开内容和序列(例如，trs和ce序列)通过引用并入本文以用于本发明中的可能用途。
[0334]
将产生包含以下trs序列的rna(在正链ssrna的5
′
至3
′
方向上)
[0335]
rna设计1：seq b、d、h、j；rna中不存在s、e和m的编码序列
[0336]
rna设计2：seq d、h、j(每个序列紧接该序列转录和翻译的调控区的3
′
)；rna中不存在s、e和m的编码序列
[0337]
rna设计3：seq b、d、d、d；rna中不存在s的编码序列
[0338]
rna设计4：seq b、h、h、h；rna中不存在e的编码序列
[0339]
rna设计5：seq b、j、j、j；rna中不存在m的编码序列
[0340]
rna设计6：seq b、d、d、j、j；rna中不存在s或m的编码序列
[0341]
rna设计7：seq d、d、d；(每个序列紧接该序列转录和翻译的调控区的3
′
)；rna中不存在s的编码序列
[0342]
rna设计8：seq b、h、h、h；(每个序列紧接该序列转录和翻译的调控区的3
′
)；rna中不存在e的编码序列
[0343]
rna设计9：seq b、j、j、j；(每个序列紧接该序列转录和翻译的调控区的3
′
)；rna中不存在m的编码序列
[0344]
rna设计10：seq b、d、d、j、j；(每个序列紧接该序列转录和翻译的调控区的3
′
)；rna中不存在s或m的编码序列
[0345]
rna设计11：seq a、c、g、i；rna中不存在s、e和m的编码序列
[0346]
rna设计12：seq c、g、i(每个序列紧接该序列转录和翻译的调控区的3
′
)；rna中不
存在s、e和m的编码序列
[0347]
rna设计13：seq a、c、c、c；rna中不存在s的编码序列
[0348]
rna设计14：seq a、g、g、g；rna中不存在e的编码序列
[0349]
rna设计15：seq a、i、i、i；rna中不存在m的编码序列
[0350]
rna设计16：seq a、c、c、i、i；rna中不存在s或m的编码序列
[0351]
rna设计17：seq c、c、c；(每个序列紧接该序列转录和翻译的调控区的3
′
)；rna中不存在s的编码序列
[0352]
rna设计18：seq a、g、g、g；(每个序列紧接该序列转录和翻译的调控区的3
′
)；rna中不存在e的编码序列
[0353]
rna设计19：seq a、i、i、i；(每个序列紧接该序列转录和翻译的调控区的3
′
)；rna中不存在m的编码序列
[0354]
rna设计20：seq a、c、c、i、i；(每个序列紧接该序列转录和翻译的调控区的3
′
)；rna中不存在s或m的编码序列
[0355]
可产生仅包封一种rna设计(例如，设计1)或2种、3种或更多种设计(例如，其中每种vlp包含一种类型的rna设计)的vlp。在替代方案中，可生产仅包封一种rna设计(例如，设计1)的第一vlp，并且可生产仅包封一种rna设计(例如，设计2)的第二vlp，其不同于用于第一vlp的设计。可以将第一种vlp和第二种vlp同时或依次施用于患有cov或有cov风险的受试者，例如sars-cov2或sars-cov感染。施用可以是向肺施用。
[0356]
实例2：vlp生产和病毒感染的治疗
[0357]
产生正链rna，每个的长度在sars-cov-2或sars-cov病毒的rna基因组的10％大小(例如100％)内。每个rna包含病毒野生型基因组所包含的多个trs-b(并且任选地还包含野生型病毒基因组的前导)。例如，每种rna是实例1中任何设计的rna。每个trs-b紧接在不编码病毒蛋白的序列的5
′
，并且每个rna包含病毒基因组rna的5
′
帽和3
′
多聚-a尾。因此，rna不能表达以产生任何病毒蛋白。在实施例中，冠状病毒包装信号被掺入到每个rna中。每种rna能够被病毒的rdrp识别和复制。
[0358]
产生包含sars-cov-2或sars-cov病毒的衣壳和刺突蛋白的vlp。在生产过程中，本实例的rna被包封在vlp中。
[0359]
将产生包含vlp的可吸入药物制剂，并通过喷雾器或吸入器将其递送至人患者以递送至肺。该患者患有病毒感染。vlp将实例的rna递送到被病毒感染的宿主细胞中，并且可以将rna递送到肺中未被感染的细胞中。该治疗将减少感染或减缓患者感染或传播的进展。在替代方案中，将vlp全身施用于患者，例如通过iv施用。在另一替代方案中，使用鼻内施用。除vlp外，还可施用类固醇或干扰素。
[0360]
表3：序列概要
[0361][0362]