一种用于缓解西瓜连作的抑菌解毒复合生防菌剂及其应用的制作方法

1.本发明涉及农业微生物领域，具体涉及一种缓解西瓜连作障碍，防治西瓜枯萎病、降解西瓜自毒物质的复合生防菌剂及其应用。


背景技术：

2.西瓜(citrullus lanatus(thunb.)matsum.et nakai)是世界十大水果之一，是人们在夏季必备的消暑佳品。我国西瓜的产出量和消费量位居世界第一，但是由于长期连作引起的西瓜减产问题也日益突显。长期连作使西瓜根际分泌的自毒物质在土壤介质中积累，当其到达一定浓度时便会对植株产生毒害作用，同时募集土壤有害病原菌，造成土壤微生物群落结构异常，土壤理化性质恶化等问题，都影响着西瓜果实的最终产量和品质。由尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum f.sp.niveum)引起的西瓜枯萎病是一种毁灭性的土传病害，该菌在土壤中存活时间可超过6年，发病时，病原菌侵入维管束中大量繁殖并分泌有害的次级代谢物，造成西瓜植株死亡。该病害具有发病普遍、爆发性强的特点，在发病严重时，可使西瓜减产30％～50％，甚至造成绝产。
3.目前，轮作倒茬、土壤熏蒸、施用杀菌剂和培育抗性品种是防治西瓜枯萎病等土传病害的常用方法，但都存在着一定的缺陷。如轮作倒茬不利于机械化推广、土壤熏蒸和杀菌剂的使用对环境造成严重污染以及抗性品种选育周期长、难度大。也有部分采用生物防治的方法，利用生防菌对西瓜枯萎病进行防治，但由于所用生防菌种类单一，并且对西瓜根际分泌的自毒物质化学耐受性差，使其无法在西瓜根际稳定定殖，导致防治效果不佳。因此，寻求对西瓜自毒物质耐受性强且对西瓜枯萎病菌有良好防效的功能型复合生防菌，对于缓解西瓜连作障碍，提高西瓜产量和稳定西瓜产业发展具有重要意义。
4.微小杆菌属(exiguobacterium)和芽孢杆菌(bacillus)属在自然界分布广泛，它们对外界有害因子抵抗能力强，具有良好的繁殖能力和抑菌效果，在生产上被大量应用。如202010003186.1公开了一株乙酰微小杆菌amcc，该菌可有效防治番茄根结线虫病。202010644065.5公开了一株短小芽孢杆菌hr10，该菌对林木具有促生作用，其发酵液可致松木枯梢病菌s.sapinea营养体菌丝畸形，抑制病原菌生长。202110368744.9公开了一株地衣芽孢杆菌xw02，该菌具有良好的盐碱耐受性，其产生的抑菌物质对大白菜黑腐病等具有较好的防治作用。目前尚未发现乙酰微小杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌组合具有高自毒物质耐受性，同时能够防治西瓜枯萎病的相关报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于，针对现有技术存在的不足，提供一种由三菌株组合的pfc合剂，该合剂对西瓜枯萎病菌有较强的拮抗和防控西瓜枯萎病作用，同时对西瓜自毒物质的耐受性强，在其作用下可显著提高生长速度，可应用于农业生产上缓解西瓜连作障碍。为了解决上述问题，本发明采用的技术方案如下：
6.本发明提供了一种用于防治西瓜枯萎病的pfc合剂，菌种组分为乙酰微小杆菌
pnc25(保藏编号：gmdcc no.60108)、短小芽孢杆菌fr026(保藏编号：gmdcc no.60725)和地衣芽孢杆菌chs55(保藏编号：cgmcc no.7038)。
7.上述的pfc合剂，其特征在于，由菌株pnc25、fr026和chs55的三种菌株的发酵液按1:1:1复配而成，其中所述的乙酰微小杆菌pnc25、短小芽孢杆菌fr026和地衣芽孢杆菌chs55的活菌浓度均为1
×
108～109cfu/ml。
8.上述pnc25、fr026和chs55菌株的发酵液及pfc合剂的制备方法为，将三种保藏菌株pnc25、fr026和chs55分别接种至lb固体培养基活化，后置于恒温培养箱中培养24h；将培养后的三种菌株，挑选单菌落至lb液体培养基中，置于恒温振荡器内，培养12h，制成种子液；将三种菌株的种子液用lb培养液稀释20倍，培养24h，即可获得单一菌剂发酵液；将三种单一菌剂发酵液按体积比为1:1:1复配，即可制成pfc合剂。所述的培养温度为28℃，振荡速率为200r/min。
9.本发明提供的pfc合剂在缓解西瓜重茬的抑菌解毒的应用。
10.上述的pfc合剂合剂在使用时，可在西瓜育苗期和移栽期使用，将pfc合剂灌根即可。
11.本发明有以下三个优点：
12.(1)本发明提供的pfc合剂由乙酰微小杆菌pnc25、短小芽孢杆菌fr026和地衣芽孢杆菌chs55组成，它们在联合培养时，存在较好的生长协同关系，能够促进彼此的生长。
13.(2)本发明提供的pfc合剂具有良好的“抑菌解毒”双重功能，对西瓜枯萎病菌具有较强的拮抗作用，在田间防效高达61.1％，比单菌株使用效果佳，并且西瓜自毒物质能够促进其生长，将三菌复配有助于将其代谢功能进行结合，从而稳定其在自毒物质下的生长速率。
14.(3)本发明提供pfc合剂属于生防菌剂，不会产生由化学药物带来的环境污染问题，并且各生防菌株培养条件简单且价格低廉，易于工业化生产，能够大规模推广应用，具备良好的应用前景。
附图说明
15.图1：pnc25菌落形态
16.图2：fr026菌落形态
17.图3：chs55菌落形态
18.图4：西瓜枯萎病菌的平板拮抗效果图
19.生物样品保藏信息
20.本发明提供的pnc25菌株，分类名为exiguobacterium acetylicum，菌种保藏号为gdmcc no.60108，保藏单位名称为广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏时间为2016年11月15日。
21.本发明提供的fr026菌株，分类名为bacillus pumilus，菌种保藏号为gdmcc no.60725，保藏单位名称为广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏时间为2019年07月11日。
22.本发明提供的chs55菌株，分类名为地衣芽孢杆菌bacillus licheniformis，菌种保藏号为cgmcc no.4738，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中
心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏时间为2011年07月01日。
具体实施方式
23.实施例1 pfc合剂制备
24.(1)培养基配制：lb固体培养基配方(氯化钠10g、胰蛋白胨10g、酵母粉5g、琼脂粉15g，用蒸馏水定容至1l，调节ph≈7.2)在121℃下灭菌30min。lb液体培养基配方(氯化钠10g、胰蛋白胨10g、酵母粉5g，用蒸馏水定容至1l，调节ph≈7.2)在121℃下灭菌30min。
25.(2)菌株活化：将保存于
‑
80℃的三种生防菌株pnc25(保藏编号：gdmcc no.60108)、fr026(保藏编号：gdmcc no.60725)和chs55(保藏编号：cgmcc no.4738)接种于lb固体培养基中活化，置于28℃恒温培养箱中24h。
26.(3)种子液制备：将活化后的三种菌种，分别挑选单菌落接种于lb液体培养基中，置于28℃、200r/min的恒温振荡器中培养12h，即可制得种子液。
27.(4)发酵液制备：将种子液按体积比(5:100)用lb液体培养基稀释，后在28℃、200r/min培养24h，测定培养后发酵液的od
600
值，用无菌水调整吸光度od
600
＝1即可获得发酵液。
28.(5)pfc合剂制备：将三种生防菌pnc25、fr026和chs55的发酵液按体积比为1:1:1复配，即可制成pfc合剂。
29.实施例2 pfc合剂与西瓜枯萎病菌协同/拮抗效果分析
30.本案例探究以下两个内容：1.比较pnc25、fr026和chs55三种菌株在单独培养和共培养下的生长繁殖量，探究三菌间是否存在的协同生长关系。2.比较pfc合剂与西瓜枯萎病菌在单独培养和共培养的生长繁殖量，探究pfc合剂与西瓜枯萎病菌间是否存在拮抗关系。具体操作如下：
31.(1)pda培养液配制：马铃薯200g，切碎加水煮沸20min，过滤，在滤液中加入葡萄糖20g，用蒸馏水定容至1l。
32.(2)三种菌株培养：取10ml离心管，加入4ml的pda培养液，四个处理分别加入pnc25、fr026、chs55发酵液和pfc合剂各400μl，再分别加入无菌水400μl无菌水，置于28℃、200r/min的恒温振荡器中培养48h，测定600nm处的od值。记ξ1为pfc合剂的od
600
，y1为pnc25、fr026和chs55三菌的od
600
的平均值。
33.(3)pfc合剂与西瓜枯萎病菌共培养：取10ml离心管，加入4ml的pda培养液，设三个处理组a.加入pfc合剂和西瓜枯萎病菌分生孢子悬浮液各400μl；b.加入pfc合剂和无菌水各400μl；c.加入西瓜枯萎病菌分生孢子悬浮液和无菌水各400μl；置于28℃、200r/min的恒温振荡器中培养48h，测定600nm处的od值。记ξ2为pfc合剂与枯萎病菌共培养的od
600
，y2为pfc合剂与枯萎病菌单独培养的od
600
的平均值。
34.实验结果由表1数据可知，pnc25、fr026和chs55三种菌株在单独培养48h后，od600值分别为0.71、1.42和1.00，可看出fr026的生长速率最快，chs55次之，pnc25最慢，三菌od
600
的平均值y1＝1.04＜ξ1＝1.67，说明在三菌联合培养时，存在生长协同关系，菌株各自产生的次级代谢物能够作为彼此间的生长因子，起到促进生长的作用。在pfc合剂与枯萎病菌的培养中，pfc合剂与枯萎病菌的od
600
值分别为1.67和1.28，平均值y2＝1.48＞ξ2＝1.27，
说明由pnc25、fr026和chs55菌株组成的pfc合剂与枯萎病菌相互竞争营养与生存空间，生长上存在拮抗关系，即pfc合剂能够抑制西瓜枯萎病菌的生长。
35.表1 pfc合剂与西瓜枯萎病菌协同/拮抗效果分析(48h)
[0036][0037]
注：不同字母表示在p＜0.05差异显著。
[0038]
实施例3 pfc合剂与西瓜枯萎病菌平板拮抗活性测定
[0039]
本案列采用平板对峙法探究pfc合剂、pnc25、fr026和chs55菌株对西瓜枯萎病菌的抑制效果。具体步骤如下：
[0040]
将活化后的西瓜枯萎病菌用灭菌后的打孔器从菌落的外边缘均匀的打成直径为5mm的圆形菌块。将菌块(5mm)接种在pda培养基中心，处理组在培养基中心其四个方位距离约27mm处分别接种10μl的pfc合剂、pnc25、fr026和chs55发酵液，对照组则加入等量的无菌水，分别置于28℃的恒温培养箱中培养10d，待对照菌长满整个平板后，记录病原菌靠近细菌处直径的大小并计算抑菌率。抑菌率＝(对照组菌落直径
‑
处理组菌落直径)/对照组菌落直径
×
100％
[0041]
实验结果由表2数据可知，pfc合剂、pnc25、fr026和chs55的抑菌率分别为55.7％、59.2％、10.7％和49.9％，可知该合剂中，pnc25的抑菌效果最佳，chs55次之，fr026的抑菌效果最差，pfc合剂抑菌与对照组相比差异显著(p＜0.05)，其抑菌效果可稳定至50％以上，防治效果良好。表明pfc合剂在防治西瓜枯萎病时，主要是由pnc25与chs55的代谢产物发挥抑制西瓜枯萎病菌的生长的作用，而fr026菌株的抑菌效果虽不明显，但却能够促进pnc25与chs55菌株生长，提高pfc菌剂的生长繁殖量，起到联合防治效果。
[0042]
表2 pfc合剂与枯萎病菌平板拮抗活性测定
[0043][0044]
注：不同字母表示在p＜0.05差异显著。
[0045]
实施例4 pfc合剂对西瓜种子发芽和幼苗出土的影响
[0046]
本案例探究pfc合剂对西瓜种子发芽率和子叶出土率的影响效果。具体步骤如下：取西瓜玲珑种子于40℃烘箱中20min，放入55℃温水搅拌15min，取出后在30℃下浸种3h～4h。浸好的种子用1％的naclo浸泡10min，后用无菌水冲洗两遍，除去残留的naclo。处理组
分别用pfc合剂、pnc25、fr026和chs55发酵液和百菌清浸泡30min，对照组用无菌水处理。处理时底下垫上灭菌滤纸，加15ml灭菌水湿润，加液体时以浸没种子为宜。常温下放置36h催芽，每隔12h记录种子发芽情况，计算发芽率。每个处理30粒种子，重复3次。
[0047]
对催芽完成的西瓜苗进行播种，将胚根朝下播种在育苗盘中，用基质覆盖约1.5cm，按上述处理分别用pfc合剂、pnc25、fr026和chs55、百菌清和无菌水进行浇灌，每次浇灌30ml，浇灌时应注意观察苗床湿度，尽量保持湿度适中，谨防育苗失败，每个处理设置三个重复，每个重复24株苗，5d后每隔1d记录子叶出土率。
[0048]
实验结果由表3数据可知，西瓜种子在pfc合剂浸泡的36h、48h和60h的发芽率分别为76.7％、82.2％和83.3％，在36h时种子发芽率略高于百菌清(68.9％)，低于无菌水(88.9％)，在60h时种子发芽率无显著差异(p＞0.05)，表明pfc合剂对种子萌发无抑制作用。使用pfc合剂浇灌西瓜苗，在浇灌后的5d、6d和7d的子叶出土率分别为11.1％、77.8％和97.2％，相较于百菌清和无菌水处理略高，对幼苗萌发有一定促进作用，但无显著差异(p＞0.05)。综上，可知pfc合剂对西瓜种子和幼苗无毒害作用，可在西瓜种子发芽和苗期时使用，有利于防止西瓜在早期感染枯萎病菌。
[0049]
表3 pfc合剂对西瓜种子萌发和幼苗出土的影响效果
[0050][0051]
注：不同字母表示在p＜0.05差异显著；hpi(hours post inoculation)，接菌后的小时数；dpi(days post inoculation)，接菌后的天数.
[0052]
实施例5 pfc合剂对西瓜枯萎病的田间(ft)防效评价
[0053]
本案例在案例4处理的基础上，探究田间条件下pfc合剂对西瓜枯萎病的病害防治效果。将案例4中生长良好的健康西瓜幼苗移栽至栽培土中，在移栽后1d、10d分别浇灌pfc合剂、pnc25、fr026、chs55、百菌清和无菌水，每个处理设置12组，每组3个重复，每次浇灌25ml，浇灌时将液体灌入西瓜根际即可。在20d、30d接种西瓜枯萎病菌，每组在土壤加入病原菌的分生孢子液(1
×
105cfu/ml)50ml。在第二次接种西瓜枯萎病菌后5d后每隔3d调查病情指数，计算生防效果。
[0054][0055]
[0056]
实验结果由表4数据可知，pfc合剂处理对防治西瓜枯萎病具有较好效果，在18、21和24dpi的病情指数分别为25.0％、52.8％和75.0％，相比百菌清和无菌水处理的病害严重程度低，能够显著(p＜0.05)减缓病害发生。防治效果在18、21和24dpi分别为61.1％、37.6％和22.7％，相较于百菌清处理组31.5％、
‑
17.8％和
‑
3.0％的生防效果强(p＜0.05)。由pnc25、fr026和chs55菌剂处理的病害程度和生防效果可以看出，pfc合剂防治西瓜枯萎病菌的功能菌株为chs55，在18、21、24dpi的病害指数(41.7％、88.9％、91.7％)和生防效果(35.2％、3.9％、5.6％)均优于百菌清处理。综上，可知pfc合剂结合了pnc25、fr026和chs55三种菌株的生防特性，在田间条件下可发挥优异的生防效果，抑制西瓜枯萎病害的发生。
[0057]
表4 pfc合剂对西瓜枯萎病的田间防效评价
[0058][0059]
注：不同字母表示在p＜0.05差异显著。
[0060]
实施例6 pfc合剂在西瓜自毒物质存在下的促生效果评价
[0061]
本案例通过建立自毒物质
‑
生防菌共培养体系，探究pfc合剂在西瓜自毒物质存在下的生长情况。具体的操作步骤如下：
[0062]
自毒物质
‑
pda培养基：取灭菌后的pda培养基，将四种自毒物质(肉桂酸、阿魏酸、苯甲酸和香豆酸)分别按浓度为0.1mmol/l进行配置，对照则加入等量95％的乙醇溶液。将上述两种处理的培养基各取3.5ml，分别加入0.5ml的生防菌剂，置于28℃、200rpm振荡培养48h，分别在24h、36h和48h测定其od
600
并计算促生率，每个处理六个重复。
[0063][0064]
实验结果由表5数据可知，四种自毒物质对pfc合剂的生长均有一定促进效果。在不同自毒物质作用下，各单菌(pnc25、fr026和chs55)在24h、36h和48h的促生效果差异显著(p＜0.05)。其中，肉桂酸对chs55的促生效果明显，在24h、36h和48h的促生率g
ca
可达71.2％、57.4％和48.5％；阿魏酸和苯甲酸对pnc25的促生效果明显，在24h、36h和48h的促生率g
fa
为(78.9％、184.6％、21.1％)和促生率g
ba
为(27.4％、137.7％、61.4％)；香豆酸对pnc25和chs55的促生效果均较明显，在24h、36h和48h的促生率g
pa
分别为22.8％、63.4％、20.4％和59.0％、23.2％、14.9％。综上可知，pfc合剂能够结合三菌对自毒物质的利用，使平均促生效果处于一个较为稳定的数值。
[0065]
表5 pfc合剂在西瓜自毒物质下的促生效果评价
[0066][0067]
注：不同字母表示在p＜0.05差异显著；g
ca
、g
fa
、g
ba
和g
pa
分别表示在肉桂酸(cinnamic acid,ca)、阿魏酸(ferulic acid,fa)、苯甲酸(benzoic acid,ba)和香豆酸(pcoumaric acid,pa)作用下的促生率。