一种纯化醋酸布雷默浪丹的方法与流程

1.本发明涉及多肽的纯化，具体涉及一种纯化醋酸布雷默浪丹的方法。


背景技术：

2.醋酸布雷默浪丹又称布雷默浪丹pt141、布雷默浪丹杂质、布雷美拉肽、布美诺肽等，其为环状七肽化合物；用于治疗女性性功能障碍药物，pt-141已在给药于正常绝经前妇女的ⅰ期临床试验中显现阳性结果。pt141通过激活大脑中的内源性途径来调节性欲和性反应，帮助伴有低活跃性性欲障碍况的绝经前女性保持正常性欲。且醋酸布雷默浪丹具有一种新颖的作用机制，其是α-黑素细胞刺激激素的类似物，作为一种环状黑皮质素多肽，可以对大脑内参与性反应的通路起到调节作用。
3.现有技术如公开号cn2009101315987a公开了一种布雷默浪丹的固相合成方法，包括在载体树脂上连接对羧基苯酚基团，然后和fmoc-lys(boc)-oh发生酯化反应，然后连接具有fmoc-保护基团的氨基酸，获得保护的七肽树脂；再依次脱去fmoc-保护基团，用缩合试剂进行反应，得到保护的七肽树脂后，进行乙酰化反应，然后进行切割，获得三氟醋酸布雷默浪丹粗品，然后在液相中进行侧链成环的反应，再经过色谱柱进行分离纯化，冷冻干燥，即获得醋酸布雷默浪丹精品。该制备方法包括分离纯化、冷冻干燥等步骤，成本较高，且容易产生较难除去的杂质；除此之前，有机合成制得的多肽，由于肽延伸反应的一部分重复、一部分缺失或者产生的截断序列等，合成了目标肽的各种相似肽或类似物，因此有必要将产生的目标肽与相似肽或类似物进行分离。然而专门针对醋酸布雷默浪丹纯化方面的报道极少。因此，研究醋酸布雷默浪丹的纯化方法得到纯度更高的产品具有重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种能够得到较高纯度和收率的纯化醋酸布雷默浪丹的方法。
5.本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种纯化醋酸布雷默浪丹的方法，包括以下步骤：s1：将醋酸布雷默浪丹粗品溶于混合溶剂a中得到混合物a；s2：将混合物a再溶于混合溶剂b中得到混合物b；s3：将混合物b固液分离，洗涤，并合并滤液，干燥，得到醋酸布雷默浪丹精品；混合溶剂a包括有机磺酸化合物；其中，有机磺酸化合物的结构式如下：。
6.本发明采用有机磺酸化合物作为混合溶剂a的成分，并对醋酸布雷默浪丹粗品进
行纯化，提高了醋酸布雷默浪丹的纯度和收率；其可能对醋酸布雷默浪丹中含有的氨基酸残基或游离的n端具有一定的识别作用，进而达到纯化醋酸布雷默浪丹的效果。
7.需要说明地是，在本发明的一些实施例中，有机磺酸化合物由5-苄氧基-5-羟基苯甲醛、乙酰乙酸乙酯、尿素进行磺化反应制得。
8.进一步需要说明地是，有机磺酸化合物的制备方法，包括以下步骤：将5-苄氧基-5-羟基苯甲醛、无水乙醇、乙酰乙酸乙酯、尿素、氨基磺酸置于容器中，在60~75℃加热回流反应，洗涤，重结晶，再抽滤，洗涤，干燥，得到产物a；将产物a与二氯甲烷置于容器中，然后缓慢滴加氯磺酸的二氯甲烷溶液，滴加完毕后，置于40~45℃下回流反应1~2h，冷却室温，置于冷冻条件下静置分层，洗涤，抽滤，干燥，得到有机磺酸化合物。
9.更进一步需要说明地是，按重量份计，5-苄氧基-5-羟基苯甲醛为5.5~10.5份、无水乙醇为45~75份、乙酰乙酸乙酯为7.5~12.5份、尿素为4.65~8.55份、氨基磺酸为2.5~5.5份。
10.更进一步需要说明地是，按重量份计，产物a为2.7~4.5份、二氯甲烷为10~15份、氯磺酸的二氯甲烷溶液中氯磺酸为2~5份与二氯甲烷为10~15份。
11.需要说明地是，在本发明的一些实施例中，步骤s1中，混合溶剂a还包括水、甲醇、乙醇、丙醇、苯甲醇、乙二醇、正丁醇、异丁醇中的至少一种。
12.更进一步需要说明地是，混合溶剂a还包括水、异丁醇，其中混合溶剂a中水与异丁醇体积比为1:2~4。
13.需要说明地是，在本发明的一些实施例中，步骤s1中，混合溶剂a中有机磺酸化合物的浓度至少为55mm。
14.进一步需要说明地是，在本发明的一些实施例中，步骤s1中，混合溶剂a中有机磺酸化合物的浓度为55~75mm；具体优选为55mm、60mm、65mm、70mm、75mm。
15.需要说明地是，在本发明的一些实施例中，步骤s1中，混合物a中醋酸布雷默浪丹粗品的浓度至少为25mm。
16.需要说明地是，在本发明的一些实施例中，步骤s1中，混合物a中醋酸布雷默浪丹粗品的浓度为25~40mm；具体优选为25mm、30mm、35mm、40mm。
17.需要说明地是，在本发明的一些实施例中，步骤s2中，混合溶剂b含有极性溶剂和非极性溶剂，其中极性溶剂与非极性溶剂的体积比为1:1~3。
18.进一步需要说明地是，在本发明的一些实施例中，极性溶剂为甲酸、乙酸、丙酸、甲酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸乙酯、碳酸二甲酯、异丙醚、二苯醚中的至少一种；非极性溶剂为己烷、庚烷、辛烷、甲基环己烷、乙基环己烷、异庚烷、环庚烷中的至少一种。
19.进一步需要说明地是，极性溶剂为丙酸、甲酸乙酯；非极性溶剂为甲基环己烷；其中丙酸、甲酸乙酯与甲基环己烷的体积比为1:1:1~3。
20.进一步需要说明地是，极性溶剂为丙酸、甲酸乙酯、乙酸乙酯；非极性溶剂为庚烷；其中丙酸、甲酸乙酯、乙酸乙酯与庚烷的体积比为1:1:1:1~3。
21.需要说明地是，在本发明的一些实施例中，步骤s2中，混合物a与混合溶剂b的体积比为1:10~20。
22.需要说明地是，在本发明的一些实施例中，醋酸布雷默浪丹的纯度高于99.5%，收
率高于89.5%。
23.本发明还公开了有机磺酸化合物在提高醋酸布雷默浪丹纯度和/或收率中的用途。
24.本发明由于采用有机磺酸化合物作为混合溶剂a的成分，并对醋酸布雷默浪丹粗品进行纯化，提高了醋酸布雷默浪丹的纯度和收率；因此，本发明是一种能够得到较高纯度和收率的纯化醋酸布雷默浪丹的方法。
附图说明
25.图1为实施例1中有机磺酸化合物的红外谱图。
具体实施方式
26.为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明进行详细描述，但是应当理解，这些实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明的保护范围也不限于下述的实施例。本发明下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
27.需要说明地是，在本发明的一些实施例中，一种纯化醋酸布雷默浪丹的方法，包括以下步骤：s1：将醋酸布雷默浪丹粗品溶于混合溶剂a中，其中混合溶剂a中有机磺酸化合物的浓度55~75mm，得到混合物a，且混合物a中醋酸布雷默浪丹粗品的浓度为25~40mm；s2：将上述混合物a再溶于混合溶剂b中得到混合物b，其中混合物a与混合溶剂b的体积比为1:10~20；s3：将上述混合物b在室温下振荡过夜，然后以6000~8000rpm转速下离心5~10min，固液分离，将滤饼洗涤，并合并滤液，真空干燥，得到醋酸布雷默浪丹精品，采用hplc分析产物，测得其纯度高于99.5%，收率高于95.7%。
28.更进一步需要说明地是，在本发明的一些实施例中，有机磺酸化合物的制备方法，包括以下步骤：按重量份计，将5.5~10.5份5-苄氧基-5-羟基苯甲醛、45~75份无水乙醇、7.5~12.5份乙酰乙酸乙酯、4.65~8.55份尿素、2.5~5.5份氨基磺酸置于三口烧瓶中，在60~75℃加热回流反应2~5h，冷却至室温，并置于冰箱中静置10~12h，抽滤，然后依次用乙醚、冰水和50~70%乙醇洗涤3~5次，得到的固体用无水乙醇重结晶，再抽滤，用蒸馏水洗涤3~5次，真空干燥，得到产物a；将2.7~4.5份产物a与10~15份二氯甲烷置于三颈烧瓶中，然后缓慢滴加氯磺酸的二氯甲烷溶液，其中氯磺酸为2~5份与二氯甲烷为10~15份，滴加完毕后，置于40~45℃下回流反应1~2h，冷却室温，并置于冰箱中静置10~12h，分层，倒出上层溶液，下层油状物加入无水乙醚，静置，析出沉淀，然后用无水乙醚洗涤沉淀至ph为6~7，抽滤，真空干燥，得到有机磺酸化合物，其产率为75.8~79.3%，结构式如下：
。
29.以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：实施例1：一种纯化醋酸布雷默浪丹的方法，包括以下步骤：s1：将醋酸布雷默浪丹粗品溶于混合溶剂a中，其中混合溶剂a中包括水、异丁醇，水与异丁醇体积比为1:3，且有机磺酸化合物的浓度55mm，得到混合物a，且得到的混合物a中醋酸布雷默浪丹粗品的浓度为25mm；s2：将上述混合物a再溶于混合溶剂b中得到混合物b，混合溶剂b中丙酸、甲酸乙酯与甲基环己烷的体积比为1:1:1，其中混合物a与混合溶剂b的体积比为1:10；s3：将上述混合物b在室温下振荡过夜，然后以6000rpm转速下离心10min，固液分离，将滤饼洗涤，并合并滤液，真空干燥，得到醋酸布雷默浪丹精品。
30.进一步地，本实施例中有机磺酸化合物的制备方法如下：按重量份计，将5.6份5-苄氧基-5-羟基苯甲醛、50份无水乙醇、7.95份乙酰乙酸乙酯、4.75份尿素、2.5份氨基磺酸置于三口烧瓶中，在70℃加热回流反应3h，冷却至室温，并置于冰箱中静置12h，抽滤，然后依次用乙醚、冰水和50%乙醇洗涤3次，得到的固体用无水乙醇重结晶，再抽滤，用蒸馏水洗涤3次，真空干燥，得到产物a；将2.8份产物a与12份二氯甲烷置于三颈烧瓶中，然后缓慢滴加氯磺酸的二氯甲烷溶液，其中氯磺酸为2.5份与二氯甲烷为10份，滴加完毕后，置于45℃下回流反应2h，冷却室温，置于并置于冰箱中静置12h，分层，倒出上层溶液，下层油状物加入无水乙醚，静置，析出沉淀，然后用无水乙醚洗涤沉淀至ph为6.5，抽滤，真空干燥，得到有机磺酸化合物，其产率为77.2%，结构式如下：。
31.采用am-400核磁共振仪进行核磁表征，1h nmr(400mhz, dmso)：7.81(d, 1h, oh)、7.45(d, 2h, ch)、7.36(t, 3h, ch)、7.22(s, 1h, ch)、7.16(s, 1h, ch)、6.95(d, 1h, ch)、6.86(s, 1h, ch)、5.33(s, 1h, oh)、5.15(s, 2h, ch2)、4.64(s, 2h, ch2)、1.99(s, 1h, oh)。
32.实施例2：一种纯化醋酸布雷默浪丹的方法，与实施例1不同的是：步骤s1中，混合溶剂a中水与异丁醇体积比为1:4，有机磺酸化合物的浓度为75mm，其他步骤均与实施1相同。
33.实施例3：一种纯化醋酸布雷默浪丹的方法，与实施例1不同的是：步骤s2中，混合溶剂b中丙酸、甲酸乙酯与甲基环己烷的体积比为1:1:3。
34.实施例4：
一种纯化醋酸布雷默浪丹的方法，与实施例1不同的是：步骤s2中，混合溶剂b中丙酸、甲酸乙酯、乙酸乙酯与庚烷的体积比为1:1:1:3。
35.实施例5：一种纯化醋酸布雷默浪丹的方法，与实施例1不同的是：步骤s2中，混合物a与混合溶剂b的体积比为1:20。
36.实施例6：为了进一步优化醋酸布雷默浪丹的纯度，采取的优选措施还包括：在混合溶剂b中添加辛癸酸甘油酯，其中混合溶剂b中丙酸、甲酸乙酯、辛癸酸甘油酯与甲基环己烷的体积比为1:1:0.5~1:1~3。由于辛癸酸甘油酯与各种溶剂、油脂等具有优良的互溶性，将其添加混合溶剂b中，其可能与其他溶剂相互作用，进而对醋酸布雷默浪丹进行纯化，得到纯度较高的醋酸布雷默浪丹。
37.一种纯化醋酸布雷默浪丹的方法，与实施例1不同的是：步骤s2中，混合溶剂b中丙酸、甲酸乙酯、辛癸酸甘油酯与甲基环己烷的体积比为1:1:0.5:3。
38.实施例7：一种纯化醋酸布雷默浪丹的方法，与实施例5不同的是：步骤s2中，混合溶剂b中丙酸、甲酸乙酯、辛癸酸甘油酯与甲基环己烷的体积比为1:1:1:3。
39.实施例8：一种纯化醋酸布雷默浪丹的方法，与实施例4不同的是：步骤s2中，混合溶剂b中丙酸、甲酸乙酯、乙酸乙酯、辛癸酸甘油酯与庚烷的体积比为1:1:0.5:1:3。
40.实施例9：一种纯化醋酸布雷默浪丹的方法，与实施例5不同的是：步骤s1中，在混合溶剂a中不添加有机磺酸化合物。
41.对比例1：一种纯化醋酸布雷默浪丹的方法，与实施例1不同的是：步骤s1中，在混合溶剂a中不添加有机磺酸化合物。
42.测试表征：92.有机磺酸化合物红外光谱测试采用360ft红外光谱仪对有机磺酸化合物进行结构表征，测试范围为400-4000cm-1
。
43.图1为实施例1中有机磺酸化合物的红外谱图。由图1可以看出，在3362cm-1
附近出现的较宽的特征吸收峰为-oh的伸缩振动；在2947cm-1
附近出现的特征吸收峰为c-h的伸缩振动；在1650~1520cm-1
出现的较宽的特征吸收峰为c=c、c=n的伸缩振动；在1249cm-1
、1174cm-1
附近出现的特征吸收峰为s-o的伸缩振动，因此采用5-苄氧基-5-羟基苯甲醛、乙酰乙酸乙酯、尿素进行磺化反应制得有机磺酸化合物。
44.2.醋酸布雷默浪丹的面积区域测试采用hplc法对得到的固体与滤液进行分析，从处理后固体的hplc分析结果计算出醋酸布雷默浪丹的hplc面积百分比（对于处理后的固体，磺酸化合物的峰从总面积中减去）。
45.醋酸布雷默浪丹比率(%)=醋酸布雷默浪丹峰面积/测试样品总峰面积
表1 滤饼中醋酸布雷默浪丹的面积比率由表1可以看出，处理后，实施例1-5中醋酸布雷默浪丹比率增加百分比高于3.2%，这说明有机磺酸化合物能够使醋酸布雷默浪丹形成盐而成为固体，进而达到纯化醋酸布雷默浪丹的目的；对比实施例1与对比例1，处理后，实施例1中醋酸布雷默浪丹比率增加百分比高于对比例1，这说明在纯化醋酸布雷默浪丹的步骤s1中的混合溶剂a中添加有机磺酸化合物，达到了纯化醋酸布雷默浪丹的效果；对比实施例1与实施例6-7、实施例4与实施例8、实施例9与对比例1，实施例6-7中醋酸布雷默浪丹比率增加百分比高于实施例1，实施例8中醋酸布雷默浪丹比率增加百分比高于实施例4，实施例9中醋酸布雷默浪丹比率增加百分比高于对比例1，说明在纯化醋酸布雷默浪丹的步骤s2中的混合溶剂b中添加辛癸酸甘油酯，进一步提高了醋酸布雷默浪丹的纯化效率。
46.3. 醋酸布雷默浪丹纯度与收率测试采用hplc对得到的滤液与滤饼中的目标产物进行分析，计算其纯度与收率。
47.表2 醋酸布雷默浪丹的纯度与收率
由表2可以看出，实施例1-5中醋酸布雷默浪丹的纯度高于99.7%，收率高于89.5%，对比实施例1与对比例1，实施例1中醋酸布雷默浪丹的纯度与收率均高于对比例1，这说明在纯化醋酸布雷默浪丹的步骤s1中的混合溶剂a中添加有机磺酸化合物，提高了醋酸布雷默浪丹的纯度和收率；对比实施例1与实施例6-7、实施例4与实施例8、实施例9与对比例1，实施例6-7中醋酸布雷默浪丹的纯度与收率均高于实施例1，实施例8中醋酸布雷默浪丹的纯度与收率均高于实施例4，实施例9中醋酸布雷默浪丹的纯度与收率均高于对比例1，说明在纯化醋酸布雷默浪丹的步骤s2中的混合溶剂b中添加辛癸酸甘油酯，进一步提高了醋酸布雷默浪丹的纯度与收率。
48.本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
49.以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。