一种快速筛选单克隆细胞的方法和试剂盒与流程

1.本发明属于单克隆细胞筛选技术领域，具体涉及一种快速筛选单克隆细胞的方法和试剂盒。


背景技术：

2.单克隆细胞是一群具有单一特性的细胞，获得单克隆细胞的方法分为有限稀释法、流式细胞分选和半固体培养基筛选。有限稀释法尤为常用，是指通过多次（3～5次）微孔板培养细胞、检测和筛选达到100%阳性率的阳性孔，过程中涉及大量细胞培养和检测，因此人力、物料和时间消耗都很多。流式细胞分选是根据细胞的某一特性，通过流式细胞分选仪器，得到单一细胞，其缺点是由于使用压力操作等原因，获得的细胞成活率低，并且操作过程存在污染高的风险。半固体培养基单细胞挑选可由全人工或自动化实现，其缺点主要体现在两个方面，一是半固体培养基筛选的细胞需要重新进行驯化，中间可能因为细胞特性丢失或者死亡而筛选失败。而人工挑选的工作量繁重，并且精度不高，而自动筛选仪器维护保养费用高，机器机械臂的精度影响挑选精度。


技术实现要素：

3.为了克服现有技术中的上述不足，本发明的目的之一在于提供一种快速筛选单克隆细胞的方法。
4.本发明的目的之二在于提供一种快速筛选单克隆细胞的试剂盒。
5.为了实现上述目的之一，本发明采用以下技术方案：本发明提供一种快速筛选单克隆细胞的方法，包括以下步骤：s1、用微球复溶液溶胀磁性微球，充分反应不低于3min，然后在离心机的离心力为1000～1500g下离心，离心完成后弃掉上清液，得到溶胀后的磁性微球；s2、用偶联缓冲液溶解蛋白或肽段，调节所述蛋白或肽段的浓度不低于1mg/ml；s3、将溶胀后的磁性微球与所述蛋白或肽段按照1:4～20的摩尔比混合，在室温下反应30min～3h，使所述磁性微球与所述蛋白或肽段进行结合反应，得到反应后的磁性微球悬液；s4、通过离心的方法或磁力吸附聚集的方法，去除s3中得到的磁性微球悬液中未结合的所述蛋白或肽段，得到结合蛋白或肽段的磁性微球悬液；s5、将微孔板盒放置在磁力板上后，在所述微孔板盒中放置板条，形成微孔，在所述微孔板盒的上方安装板盖，组装成微孔板，所述微孔板盒设置有出液管口，所述板盖为两层中空的结构，所述板盖的底层设有出液孔，所述出液孔与所述微孔对应，所述板盖还设置有进液管口，关闭所述出液管口，从所述进液管口往所述微孔中加入5～20ml的所述结合蛋白或肽段的磁性微球悬液，室温下静置1～10min，使得结合蛋白或肽段的磁性微球在充分均匀附着在所述微孔底部的半透膜，所述半透膜能够允许缓冲液和细胞培养基透过，不允许细胞或者生物大分子透过，然后从所述出液管口排除所述微孔板盒中的液体；
s6、将待分选地混合细胞制成细胞悬液，从所述进液管口加入所述细胞悬液，37℃孵育不超过60 min；s7、将所述微孔板放置在所述磁力板上，以不少于5倍微孔板体积的细胞培养基连续灌注，没有与所述结合蛋白或肽段的磁性微球结合的细胞被冲洗出，随所述细胞培养基从所述微孔板盒的所述出液管口流出，与所述结合蛋白或肽段的磁性微球结合的细胞被吸附在所述微孔底部的半透膜上，与所述微孔底部的半透膜吸附细胞即为捕获的目标细胞；s8、往所述捕获的目标细胞的微孔板中加入培养基，适合的条件下培养7～14天后，通过显微镜观察所述捕获的目标细胞，可见所述微孔中有单个细胞或者多个细胞团；s9、有单个细胞的微孔中的所述单个细胞即为已经筛选得到的单克隆细胞；s10、对于有多个细胞团的微孔，当细胞成团生长直到在所述半透膜上形成肉眼可见白色斑点时，能够用微针截取载有单个细胞团的半透膜，将所述载有单个细胞团的半透膜转移至新的培养容器中培养，从而获得单克隆细胞。
6.进一步地，所述磁性微球为冻干态的磁性微球。
7.进一步地，所述微球复溶液为0.01m浓度的na2co3溶液，ph值为9
±
0.5。
8.进一步地，所述偶联缓冲液选自ａ型偶联缓冲液或者ｂ型偶联缓冲液，所述ａ型偶联缓冲液中含有0.01m浓度的na2co3、1m浓度的琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺甲基)
ꢀ‑
环己烷-1-羧酸盐，ph值为9
±
0.2；所述ｂ型偶联缓冲液中含有0.01m 浓度的naｈco3－na2co3、1m浓度的包括琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺甲基)
ꢀ‑
环己烷-1-羧酸盐，ph值为7
±
0.5。
9.进一步地，所述s8中，往所述捕获的目标细胞的微孔板中加入培养基，适合的条件下培养7～14天后，通过显微镜观察所述捕获的目标细胞。
10.进一步地，所述s10中，对于有多个细胞团的微孔，当细胞成团生长14天后，在所述半透膜上形成肉眼可见白色斑点时，能够用微针截取载有单个细胞团的半透膜。
11.进一步地，所述微孔板盒的壁高于所述微孔的孔壁0.4～0.5cm。
12.为了实现上述目的之二，本发明采用以下技术方案：本发明提供一种快速筛选单克隆细胞试剂盒，包括所述磁性微球、所述微球复溶液、所述偶联缓冲液、所述蛋白或肽段、所述半透膜、所述微孔板包括微孔板盒、板条、板盖，所述板条设置在所述微孔板盒中，所述微孔板盒的壁、所述板条、所述板盖形成的空间构成所述微孔，所述半透膜设置在所述微孔的底部，所述微孔板盒设置有所述出液管口，所述板盖为两层中空的结构，所述板盖的底层设有所述出液孔，所述出液孔与所述微孔对应，所述板盖还设置有所述进液管口。
13.进一步地，还包括注射器，所述注射器能够与所述进液管口连接。
14.与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：（1）本发明提供的一种快速筛选单克隆细胞的方法通过在微孔板中的微孔底部设置半透膜，该半透膜能够允许缓冲液和细胞培养基透过，不允许细胞或者生物大分子透过，将含有目标细胞混合细胞悬液通过结合蛋白或肽段的磁性微球吸附到半透膜上，然后进行细胞培养，观察微孔中细胞的克隆情况，对于有多个细胞团的微孔，当细胞成团生长直到在所述半透膜上形成肉眼可见由细胞团形成的白色斑点时，能够用微针截取载有单个细胞团的半透膜，转移至新的培养容器中培养，从而获得单克隆细胞，不仅能捕获目标细胞，还能
以更快捷和对细胞损伤更小的方式完成对细胞的单克隆化，相比有限稀释法本方法能精准定位所要筛选的细胞，相比半固体培养基本方法又避免细胞的重新驯化，因此既提高了细胞筛选的准确性，又提高了细胞筛选的有效性。
15.（2）本发明提供的一种快速筛选单克隆细胞试剂盒能够快速便捷地进行目标细胞的筛选，还能以更快捷和对细胞损伤更小的方式完成对细胞的单克隆化，维持细胞在一个适合的培养环境中，与外界接触少，不存在细胞污染的可能。
附图说明
16.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
17.图1是实施例1提供的使用本发明快速筛选单克隆细胞试剂盒对分泌抗体的细胞筛选的示意图。
18.图2是实施例1提供的微孔板的结构图。
具体实施方式
19.为了使本技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下将结合实施例对本技术的技术方案进行清楚、完整的描述。应当理解此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。
20.实施例1本实施例提供一种快速筛选分泌单克隆细胞的方法，包括以下步骤：s1、冻干微球管中加入复溶缓冲液，充分混匀，并静置5 min，往冻干微球管中加入磁性微球，用微球复溶缓冲液溶胀磁性微球，充分反应30 min，反应完成后，加入洗涤液，在离心机离心力1000g下离心，离心完成后弃掉上清，洗涤两次，得到的溶胀后的磁性微球备用；s2、用a型偶联缓冲液溶解cd28蛋白或肽段，调节cd28蛋白或肽段的浓度1mg/ml，ａ型偶联缓冲液中含有0.01m浓度的na2co3、1m浓度的琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺甲基)
ꢀ‑
环己烷-1-羧酸盐，ph值为9
±
0.2；s3、将溶胀后的磁性微球与cd28蛋白或肽段按照1:4的摩尔比混合，在室温下反应30min，使磁性微球与cd28蛋白或肽段进行结合反应，得到反应后的磁性微球悬液；s4、通过离心的方法，去除反应后的磁性微球悬液中未结合的cd28蛋白或肽段，得到结合cd28蛋白或肽段的磁性微球悬液；s5、将微孔板盒放置在磁力板上后，放置板条，安装板盖，形成微孔板，微孔板盒的壁、板条、板盖形成的空间构成微孔，微孔板盒设置有出液管口，板盖为两层中空的结构，板盖的底层设有出液孔，出液孔与微孔对应，板盖还设置有进液管口，关闭出液管口，从进液管口用普通注射器往微孔中加入5ml的结合cd28蛋白或肽段的磁性微球悬液，室温下静置1min，使得结合cd28蛋白或肽段的磁性微球在充分均匀附着在微孔底部的半透膜，半透膜能够允许缓冲液和细胞培养基透过，不允许细胞或者生物大分子透过，然后从出液管口排
除微孔板盒中的液体；s6、打开出液管口，再从进液管口加入10ml 0.05m磷酸盐缓冲液，待液体全部流出后，关闭出液管口。用普通注射器从进液管口加入收集的融合后14天经过hat和ht培养的杂交瘤细胞悬液，取下注射器，将微孔板和磁力板同时放置在二氧化碳培养箱，37℃孵育62 min；s7、取出微孔板和磁力板，将微孔板放置在磁力板上，打开出液管口，并从进液管口分两次以5倍微孔板体积的完全培养基连续灌注，待液体全部流出后，关闭出液管口，取下注射器和磁力板，将微孔板放置在二氧化碳培养箱，37度进行细胞培养，其中，没有与结合cd28蛋白或肽段的磁性微球结合的细胞被冲洗出，随细胞培养基从微孔板盒的出液管口流出，与结合cd28蛋白或肽段的磁性微球结合的细胞被吸附在微孔底部的半透膜上，与微孔底部的半透膜吸附细胞即为捕获的目标细胞；s8、往捕获的目标细胞的微孔板中加入培养基，目标细胞培养7天后，显微镜下观察细胞生长状态，并取培养基上清进行elisa检测。结果显示，显微镜下细胞生长状态与有限稀释法获得的细胞生长状态无明显差异，可见微孔中有单个细胞和多个细胞团，有单个细胞的微孔中的单个细胞即为已经筛选得到的单克隆细胞，可以直接将微孔板的细胞转移至扩增培养板中，2天后，显微镜下观察，细胞生长状态稳定良好。
21.微孔中克隆的多个细胞团边缘清晰，高倍镜下细胞为均匀的圆球形，边缘完整。cd28蛋白或肽段包被的elisa 检测od值大于1.0的阳性孔率达到100%，达到筛选单克隆的目的，当细胞成团生长直到在半透膜上形成肉眼可见白色斑点时，细胞数量大于105的细胞团肉眼可见，能够用微针截取载有单个细胞团的半透膜，将载有单个细胞团的半透膜转移至新的培养容器中培养，从而获得单克隆细胞。
22.实施例2本实施例提供一种快速筛选单克隆细胞的方法，包括以下步骤：s1、冻干微球管中加入复溶缓冲液，充分混匀，并静置20 min，往冻干微球管中加入磁性微球，用微球复溶缓冲液溶胀磁性微球，充分反应25 min，反应完成后，加入洗涤液，在离心机离心力1500g下离心，离心完成后弃掉上清，pbs洗涤两次，得到的溶胀后的磁性微球备用；s2、用a型偶联缓冲液溶解cd28蛋白或肽段，调节cd28蛋白或肽段的浓度20 mg/ml，ａ型偶联缓冲液中含有0.01m浓度的na2co3、1m浓度的琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺甲基)
ꢀ‑
环己烷-1-羧酸盐，ph值为9
±
0.2；s3、将溶胀后的磁性微球与cd28蛋白或肽段按照1:8的摩尔比混合，在室温下反应1h，使磁性微球与cd28蛋白或肽段进行结合反应，得到反应后的磁性微球悬液；s4、通过磁力吸附聚集的方法，去除反应后的磁性微球悬液中未结合的cd28蛋白或肽段，得到结合cd28蛋白或肽段的磁性微球悬液；s5、将微孔板盒放置在磁力板上后，在微孔板盒中放置板条，形成微孔，在微孔板盒的上方安装板盖，组装成微孔板，微孔板盒设置有出液管口，板盖为两层中空的结构，板盖的底层设有出液孔，出液孔与微孔对应，板盖还设置有进液管口，关闭出液管口，从进液管口往微孔中加入10ml的结合cd28蛋白或肽段的磁性微球悬液，室温下静置6 min，使得结合cd28蛋白或肽段的磁性微球在充分均匀附着在微孔底部的半透膜，半透膜能够允许缓冲
液和细胞培养基透过，不允许细胞或者生物大分子透过，然后从出液管口排除微孔板盒中的液体；s6、打开出液管口，再从进液管口加入10ml 0.05m磷酸盐缓冲液，待液体全部流出后，关闭出液管口。用普通注射器从进液管口加入收集的融合后14天经过hat和ht培养的杂交瘤细胞悬液，取下注射器，将微孔板和磁力板同时放置在二氧化碳培养箱，37℃孵育30 min；s7、取出微孔板和磁力板，将微孔板放置在磁力板上，打开出液管口，并从进液管口分两次以25倍微孔板体积的完全培养基连续灌注，待液体全部流出后，关闭出液管口，取下注射器和磁力板，将微孔板放置在二氧化碳培养箱，37度进行细胞培养，其中，与结合cd28蛋白或肽段的磁性微球结合的细胞被吸附在微孔底部的半透膜上，与微孔底部的半透膜吸附细胞即为捕获的目标细胞；s8、往捕获的目标细胞的微孔板中加入培养基，目标细胞培养14天后，显微镜下观察细胞生长状态，并取培养基上清进行elisa检测。结果显示，显微镜下细胞生长状态与有限稀释法获得的细胞生长状态无明显差异，可见微孔中有单个细胞和多个细胞团，有单个细胞的微孔中的单个细胞即为已经筛选得到的单克隆细胞，可以直接将微孔板的细胞转移至扩增培养板中，2天后，显微镜下观察，细胞生长状态稳定良好。
23.微孔中克隆的多个细胞团边缘清晰，高倍镜下细胞为均匀的圆球形，边缘完整。cd28蛋白或肽段包被的elisa 检测od值大于1.0的阳性孔率达到100%，达到筛选单克隆的目的，当细胞成团生长直到在半透膜上形成肉眼可见白色斑点时，细胞数量大于105的细胞团肉眼可见，能够用微针截取载有单个细胞团的半透膜，将载有单个细胞团的半透膜转移至新的培养容器中培养，从而获得单克隆细胞。
24.实施例3本实施例提供一种快速筛选单克隆细胞的方法，包括以下步骤：s1、冻干微球管中加入复溶缓冲液，充分混匀，并静置20 min，往冻干微球管中加入磁性微球，用微球复溶缓冲液溶胀磁性微球，充分反应20 min，反应完成后，加入洗涤液，在离心机离心力1500g下离心，离心完成后弃掉上清，pbs洗涤两次，得到的溶胀后的磁性微球备用；s2、用a型偶联缓冲液溶解cd28蛋白或肽段，调节cd28蛋白或肽段的浓度10 mg/ml，ａ型偶联缓冲液中含有0.01m浓度的na2co3、1m浓度的琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺甲基)
ꢀ‑
环己烷-1-羧酸盐，ph值为9
±
0.2；s3、将溶胀后的磁性微球与cd28蛋白或肽段按照1:20的摩尔比混合，在室温下反应3h，使磁性微球与cd28蛋白或肽段进行结合反应，得到反应后的磁性微球悬液；s4、通过磁力吸附聚集的方法，去除反应后的磁性微球悬液中未结合的cd28蛋白或肽段，得到结合cd28蛋白或肽段的磁性微球悬液；s5、将微孔板盒放置在磁力板上后，放置板条，安装板盖，形成微孔板，微孔板盒的壁、板条、板盖形成的空间构成微孔，微孔板盒设置有出液管口，板盖为两层中空的结构，板盖的底层设有出液孔，出液孔与微孔对应，板盖还设置有进液管口，关闭出液管口，从进液管口往微孔中加入20ml的结合cd28蛋白或肽段的磁性微球悬液，室温下静置10min，使得结合cd28蛋白或肽段的磁性微球在充分均匀附着在微孔底部的半透膜，半透膜能够允许缓冲
液和细胞培养基透过，不允许细胞或者生物大分子透过，然后从出液管口排除微孔板盒中的液体；s6、打开出液管口，再从进液管口加入10ml 0.05m磷酸盐缓冲液，待液体全部流出后，关闭出液管口。用普通注射器从进液管口加入收集的融合后14天经过hat和ht培养的杂交瘤细胞悬液，取下注射器，将微孔板和磁力板同时放置在二氧化碳培养箱，37℃孵育5 min；s7、取出微孔板和磁力板，将微孔板放置在磁力板上，打开出液管口，并从进液管口分两次以10倍微孔板体积的完全培养基连续灌注，待液体全部流出后，关闭出液管口，取下注射器和磁力板，将微孔板放置在二氧化碳培养箱，37度进行细胞培养，其中，与结合cd28蛋白或肽段的磁性微球结合的细胞被吸附在微孔底部的半透膜上，与微孔底部的半透膜吸附细胞即为捕获的目标细胞；s8、往捕获的目标细胞的微孔板中加入培养基，目标细胞培养10天后，显微镜下观察细胞生长状态，并取培养基上清进行elisa检测。结果显示，显微镜下细胞生长状态与有限稀释法获得的细胞生长状态无明显差异，可见微孔中有单个细胞和多个细胞团，有单个细胞的微孔中的单个细胞即为已经筛选得到的单克隆细胞，可以直接将微孔板的细胞转移至扩增培养板中，2天后，显微镜下观察，细胞生长状态稳定良好。
25.微孔中克隆的多个细胞团边缘清晰，高倍镜下细胞为均匀的圆球形，边缘完整。cd28蛋白或肽段包被的elisa 检测od值大于1.0的阳性孔率达到100%，达到筛选单克隆的目的，当细胞成团生长直到在半透膜上形成肉眼可见白色斑点时，细胞数量大于105的细胞团肉眼可见，能够用微针截取载有单个细胞团的半透膜，将载有单个细胞团的半透膜转移至新的培养容器中培养，从而获得单克隆细胞。
26.实施例4本实施例提供一种快速筛选具有特定表面蛋白标志物单克隆细胞的方法，包括以下步骤：s1、冻干微球管中加入复溶缓冲液，充分混匀，并静置20 min，往冻干微球管中加入磁性微球，用微球复溶缓冲液溶胀磁性微球，充分反应25 min，反应完成后，加入洗涤液，在离心机离心力1500g下离心，离心完成后弃掉上清，pbs洗涤两次，得到的溶胀后的磁性微球备用；s2、用b型偶联缓冲液溶解抗人cd56抗体，调节抗人cd56抗体的浓度2mg/ml，ｂ型偶联缓冲液中含有0.01m 浓度的naｈco3－na2co3、1m浓度的包括琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺甲基)
ꢀ‑
环己烷-1-羧酸盐，ph值为7
±
0.5；s3、将溶胀后的磁性微球与抗人cd56抗体按照1:4的摩尔比混合，在室温下反应1h，使磁性微球与抗体进行结合反应，得到反应后的磁性微球悬液；s4、通过磁力吸附聚集的方法，去除反应后的磁性微球悬液中未结合的抗人cd56抗体，得到结合cd56抗体的磁性微球悬液；s5、将微孔板盒放置在磁力板上后，在微孔板盒中放置板条，形成微孔，在微孔板盒的上方安装板盖，组装成微孔板，微孔板盒设置有出液管口，板盖为两层中空的结构，板盖的底层设有出液孔，出液孔与微孔对应，板盖还设置有进液管口，关闭出液管口，从进液管口往微孔中加入10ml的结合cd56抗体的磁性微球悬液，室温下静置6 min，使得结合cd56
抗体的磁性微球在充分均匀附着在微孔底部的半透膜，半透膜能够允许缓冲液和细胞培养基透过，不允许细胞或者生物大分子透过，然后从出液管口排除微孔板盒中的液体；s6、打开出液管口，再从进液管口加入10ml 0.05m磷酸盐缓冲液，待液体全部流出后，关闭出液管口。用普通注射器从进液管口加入人外周血单个核细胞的悬液，细胞浓度在1x103～1x107个/ml范围内，取下注射器，将微孔板和磁力板同时放置在二氧化碳培养箱，37℃孵育30 min；s7、取出微孔板和磁力板，将微孔板放置在磁力板上，打开出液管口，并从进液管口分两次以25倍微孔板体积的完全培养基连续灌注，待液体全部流出后，关闭出液管口，取下注射器和磁力板，将微孔板放置在二氧化碳培养箱，37度进行细胞培养，其中，与结合cd56抗体的磁性微球结合的细胞被吸附在微孔底部的半透膜上，与微孔底部的半透膜吸附细胞即为捕获的目标细胞；s8、往捕获的目标细胞的微孔板中加入自然杀伤细胞培养基，目标细胞培养10-14天后，显微镜下观察细胞生长状态，结果显示，显微镜下细胞生长状态与流式分选获得的细胞生长状态无明显差异，可见微孔中有单个细胞和多个细胞团。微针截取载有单个细胞团的半透膜，将载有单个细胞团的半透膜转移至新的培养容器中培养7~10天后，取细胞进行流式检测分析，cd56 细胞比例不低于90%。
27.实施例5本实施例提供一种快速筛选cd45阴性cd34阳性单克隆细胞的方法，包括以下步骤：s1、冻干微球管中加入复溶缓冲液，充分混匀，并静置20 min，往冻干微球管中加入磁性微球，用微球复溶缓冲液溶胀磁性微球，充分反应20 min，反应完成后，加入洗涤液，在离心机离心力1500g下离心，离心完成后弃掉上清，pbs洗涤两次，得到的溶胀后的磁性微球备用；s2、用a型偶联缓冲液溶解或稀释抗人cd45 抗体，调节抗体的浓度不低于1 mg/ml，ａ型偶联缓冲液中含有0.01m浓度的na2co3、1m浓度的琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺甲基)
ꢀ‑
环己烷-1-羧酸盐，ph值为9
±
0.2；s3、将溶胀后的磁性微球与cd45 抗体按照1:10的摩尔比混合，在室温下反应30分钟，使磁性微球与cd45 抗体进行结合反应，得到反应后的磁性微球悬液；s4、通过磁力吸附聚集的方法，去除反应后的磁性微球悬液中未结合的cd45 抗体，得到结合cd45 抗体的磁性微球悬液；s5、将微孔板盒放置在磁力板上后，放置板条，安装板盖，形成微孔板，微孔板盒的壁、板条、板盖形成的空间构成微孔，微孔板盒设置有出液管口，板盖为两层中空的结构，板盖的底层设有出液孔，出液孔与微孔对应，板盖还设置有进液管口，关闭出液管口，从进液管口往微孔中加入20ml的结合cd45 抗体的磁性微球悬液，室温下静置10min，使得结合cd45 抗体的磁性微球在充分均匀附着在微孔底部的半透膜，半透膜能够允许缓冲液和细胞培养基透过，不允许细胞或者生物大分子透过，然后从出液管口排除微孔板盒中的液体；s6、打开出液管口，再从进液管口加入10ml 0.05m磷酸盐缓冲液，待液体全部流出后，关闭出液管口。用普通注射器从进液管口加入收集的人外周血单个核细胞悬液，取下注射器，将微孔板和磁力板同时放置在二氧化碳培养箱，37℃孵育5 min；
s7、取出微孔板和磁力板，将微孔板放置在磁力板上，打开出液管口，并从进液管口分两次以10倍微孔板体积的完全培养基连续灌注，收集流出的液体，标注为cd45-细胞悬液；s8、用b型偶联缓冲液分别溶解或稀释抗人cd34 抗体，调节抗体的浓度不低于1 mg/ml，ｂ型偶联缓冲液中含有0.01m 浓度的naｈco3－na2co3、1m浓度的包括琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺甲基)
ꢀ‑
环己烷-1-羧酸盐，ph值为7
±
0.5；将溶胀后的磁性微球与cd34 抗体按照1:20的摩尔比混合，在室温下反应30分钟，使磁性微球与cd34 抗体进行结合反应，得到反应后的磁性微球悬液；s9、通过磁力吸附聚集的方法，去除反应后的磁性微球悬液中未结合的cd34 抗体，得到结合cd34 抗体的磁性微球悬液；s10、将微孔板盒放置在磁力板上后，放置板条，安装板盖，形成微孔板，微孔板盒的壁、板条、板盖形成的空间构成微孔，微孔板盒设置有出液管口，板盖为两层中空的结构，板盖的底层设有出液孔，出液孔与微孔对应，板盖还设置有进液管口，关闭出液管口，从进液管口往微孔中加入20ml的结合cd34 抗体的磁性微球悬液，室温下静置10min，使得结合cd34 抗体的磁性微球在充分均匀附着在微孔底部的半透膜，半透膜能够允许缓冲液和细胞培养基透过，不允许细胞或者生物大分子透过，然后从出液管口排除微孔板盒中的液体；s11、打开出液管口，再从进液管口加入10ml 0.05m磷酸盐缓冲液，待液体全部流出后，关闭出液管口。用普通注射器从进液管口加入cd45-细胞悬液，取下注射器，将微孔板和磁力板同时放置在二氧化碳培养箱，37℃孵育5 min；s12、取出微孔板和磁力板，将微孔板放置在磁力板上，打开出液管口，并从进液管口分两次以10倍微孔板体积的完全培养基连续灌注；待液体全部流出后，关闭出液管口，取下注射器和磁力板，将微孔板放置在二氧化碳培养箱，37度进行细胞培养，其中，与结合cd34 抗体的磁性微球结合的细胞被吸附在微孔底部的半透膜上，与微孔底部的半透膜吸附细胞即为捕获的目标细胞；s13、往捕获的目标细胞的微孔板中加入培养基，目标细胞培养7天后，显微镜下观察细胞生长状态，结果显示，显微镜下细胞生长状态与流式分选法获得的细胞生长状态无明显差异，可见微孔中有单个细胞和多个细胞团，有单个细胞的微孔中的单个细胞即为已经筛选得到的单克隆细胞，可以直接将微孔板的细胞转移至扩增培养板中，2天后，显微镜下观察，细胞生长状态稳定良好。
28.微孔中克隆的多个细胞团边缘清晰，高倍镜下细胞为均匀的圆球形，边缘完整。微针截取载有单个细胞团的半透膜，将载有单个细胞团的半透膜转移至新的培养容器中培养，从而获得单克隆细胞，所获得的细胞进行流式检测分析，cd45-cd34 细胞占比不低于97%。
29.实施例6本发明提供的一种快速筛选单克隆细胞试剂盒能够快速便捷地进行目标细胞的筛选，还能以更快捷和对细胞损伤更小的方式完成对细胞的单克隆化，维持细胞在一个适合的培养环境中，与外界接触少，不存在细胞污染的可能，具体是本实施例的快速筛选单克隆细胞试剂盒，包括磁性微球、微球复溶液、偶联缓冲液、蛋白或肽段、半透膜、微孔板包括微孔板盒、板条、板盖，板条设置在微孔板盒中，微孔板盒的壁、板条、板盖形成的空间构成
微孔，半透膜设置在微孔的底部，微孔板盒设置有出液管口，板盖为两层中空的结构，板盖的底层设有出液孔，出液孔与微孔对应，板盖还设置有进液管口。
30.进一步地，还包括注射器，注射器能够与进液管口连接，微孔板盒的壁高于微孔的孔壁0.4～0.5cm。
31.上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。