一种米根霉固态发酵培养基及其制备方法与流程

1.本发明涉及米根霉培养基技术领域，具体为一种米根霉固态发酵培养基及其制备方法。


背景技术：

2.生物发酵法是工业上生产乳酸的重要方法之一，发酵法使用的微生物主要是乳杆菌属和根霉菌属，米根霉属于根霉菌属，其是一种在土壤、空气及其他物质上常见的霉菌，米根霉菌落疏松或稠密，最初白色后变为灰褐至黑褐色，匍匐枝爬行，无色，假根发达，指状或根状分枝，囊托楔形，菌丝形成厚垣孢子，发育温度为30-37℃，能糖化淀粉、转化蔗糖，产生乳酸、反丁烯二酸及微量酒精，产l-乳酸能力强，且生产的乳酸品质相对较高，目前已成为乳酸工业化生产的重要菌种。
3.传统方法中培养米根霉的周期较长，培养需要大量的液体和大容积的发酵培养槽，同时发酵培养槽设备需要消耗大量能源，为此，本技术从传统工艺的不足出发，研究出一种米根霉的固态发酵培养基，该固态培养基可方便移动，高效便捷，同时大大缩短米根霉的发酵培养周期，减少液体和能源的消耗量。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种米根霉固态发酵培养基及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种米根霉固态发酵培养基，所述固态发酵培养基由碳源、氮源、无机盐、添加剂、酵母提取物、琼脂组成；
6.所述碳源为葡萄糖、马铃薯蔗糖、麦芽汁中的任意一种；
7.所述氮源为蛋白胨、尿素、硫酸铵中的任意一种或多种组合；
8.所述无机盐为七水硫酸镁、七水硫酸锌、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、碳酸钙、硫酸铵、硫酸镁、硫酸锌、碳酸钙、氯化铁、氯化镁、氯化钙、氯化钾、氯化钠、碳酸氢钠中的任意一种或多种组合；
9.所述添加剂为l-半胱氨酸s-硫酸钠钠倍半水合物。
10.进一步的，所述培养基的各组分如下：葡萄糖、七水硫酸镁、七水硫酸锌、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、氯化铁、蛋白胨、尿素、琼脂、l-半胱氨酸s-硫酸钠钠倍半水合物、酵母提取物。
11.进一步的，所述培养基由以下成分组成：葡萄糖60-75g/l、七水硫酸镁0.2-0.45g/l、七水硫酸锌0.04-0.07g/l、磷酸氢二钾0.2-0.45g/l、硫酸铵0.1-0.75g/l、碳酸钙40-60g/l、氯化铁0.005-0.011g/l、蛋白胨4-5g/l、尿素1.2-2.2g/l、琼脂12-15g/l、l-半胱氨酸s-硫酸钠钠倍半水合物2.5-3.5g/l、酵母提取物5.5-6.5g/l。
12.进一步的，所述培养基由以下成分组成：葡萄糖70g/l、七水硫酸镁0.25g/l、七水硫酸锌0.05g/l、磷酸氢二钾0.3g/l、硫酸铵0.4g/l、碳酸钙47g/l、氯化铁0.01g/l、蛋白胨
4g/l、尿素1.6g/l、琼脂13g/l、l-半胱氨酸s-硫酸钠钠倍半水合物2.8g/l、酵母提取物6.1g/l。
13.进一步的，所述固态发酵培养基为圆柱体；所述培养基的直径为70-150mm，厚度为7-15mm。
14.一种米根霉固态发酵培养基的制备方法包括以下步骤：
15.1)取葡萄糖、蛋白胨，搅拌均匀，加入七水硫酸镁、七水硫酸锌、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、尿素、氯化铁，混合均匀，加入琼脂，在温度为120-125℃、压力为0.11-0.14mpa条件下高温高压灭菌，取出放入摇床中，处理3-5min，制得混合液；
16.2)向步骤1)制得的混合液中加入添加剂l-半胱氨酸s-硫酸钠钠倍半水合物、酵母提取物，搅拌均匀，冷却至25-40℃，静置至琼脂完全凝固，制得米根霉固态发酵培养基。
17.进一步的，一种米根霉固态发酵培养基的制备方法包括以下步骤：
18.1)取葡萄糖、蛋白胨，搅拌均匀，在温度为50-60℃条件下，加入七水硫酸镁、七水硫酸锌、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、尿素、氯化铁，混合均匀，加入琼脂，在温度为120-125℃、压力为0.11-0.14mpa条件下高温高压灭菌60-80min，取出放入摇床中，控制转速为200-250r/min、温度为35-37℃，处理3-5min，制得混合液；
19.2)向步骤1)制得的混合液中加入琼脂、添加剂l-半胱氨酸s-硫酸钠钠倍半水合物、酵母提取物，搅拌均匀，控制温度为95-105℃、压力为0.08-0.12mpa条件下，冷却至25-40℃，静置至琼脂完全凝固，制得米根霉固态发酵培养基。
20.进一步的，所述米根霉固态发酵培养基应在避光、干燥、环境温度为15-25℃条件下保存，备用。
21.上述制备方法得到的米根霉固态发酵培养基的应用，具体为固态发酵培养基可用于培养发酵米根霉；
22.将米根霉种子培养液接种到上述制备得到的固态发酵培养基中，控制温度为32-37℃，ph为7.0-9.0条件下，发酵培养24-48h，得到发酵产物乳酸。
23.与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：本发明提供的米根霉固态发酵用培养基合理选择碳源、氮源、无机盐的种类，调整各类物质的配比，为米根霉提供了最佳的生长环境；琼脂固体培养基，在发酵培养过程染菌风险较低，有助于提升发酵产物的质量。另外，现有技术中，琼脂固体在制备固体培养基时常会出现，琼脂溶解不均匀，培养基易出现上、下分层，甚至于出现培养基开裂的现象。本技术中为了解决该问题，选择了添加剂l-半胱氨酸s-硫酸钠钠倍半水合物，作为氨基酸的衍生物，l-半胱氨酸s-硫酸钠钠倍半水合物可以增加琼脂与培养基体系的相容性，使其在体重中均匀分布，凝固成型后不会出现分层、断裂，从而避免了因分层、裂开带来的培养发酵产物不稳定、染菌的风险。另外，加入l-半胱氨酸s-硫酸钠钠倍半水合物还可为培养发酵过程提供更多的营养物质，利于米根霉的高效繁殖及生长，发酵过程染菌风险低。
24.本发明制备得到的米根霉固态发酵培养基方便移动，高效便捷，相比于传统的液态培养基，该固态培育环境对液体的需求量大大减少，对资源和能源的消耗量减少，制备成本降低，可用于规模化生产。
具体实施方式
25.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.实施例1
27.一种米根霉固态发酵培养基各组分如下：葡萄糖、七水硫酸镁、七水硫酸锌、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、氯化铁、蛋白胨、尿素、琼脂、l-半胱氨酸s-硫酸钠钠倍半水合物、酵母提取物。
28.固态发酵培养基由以下成分组成：葡萄糖60g/l、七水硫酸镁0.2g/l、七水硫酸锌0.07g/l、磷酸氢二钾0.2g/l、硫酸铵0.55g/l、碳酸钙42g/l、氯化铁0.005g/l、蛋白胨4g/l、尿素2.2g/l、琼脂12g/l、l-半胱氨酸s-硫酸钠钠倍半水合物2.5g/l、酵母提取物5.5g/l。
29.进一步的，所述固态发酵培养基为圆柱体；所述培养基的直径为100mm，厚度为10mm。
30.米根霉固态发酵培养基的制备方法包括以下步骤：
31.1)取葡萄糖、蛋白胨，搅拌均匀，在温度为50℃条件下，加入七水硫酸镁、七水硫酸锌、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、尿素、氯化铁，混合均匀，加入琼脂，在温度为120℃、压力为0.11mpa条件下高温高压灭菌60min，取出放入摇床中，控制转速为200r/min、温度为35℃，处理3min，制得混合液；
32.2)向步骤1)制得的混合液中加入添加剂l-半胱氨酸s-硫酸钠钠倍半水合物、酵母提取物(安琪酵母fm802)，搅拌均匀，控制温度为95℃、压力为0.08mpa条件下，冷却至25℃，静置至琼脂完全凝固，制得米根霉固态发酵培养基，置于避光、干燥、环境温度为15℃条件下保存，备用。
33.将米根霉种子培养液接种到上述制备得到的固态发酵培养基中，控制温度为32℃，ph为7.0条件下，发酵培养，得到发酵产物乳酸。
34.本实施例中使用米根霉为米根霉菌株hp25-3#，保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc no.12078。
35.实施例2
36.一种米根霉固态发酵培养基各组分如下：葡萄糖、七水硫酸镁、七水硫酸锌、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、氯化铁、蛋白胨、尿素、琼脂、l-半胱氨酸s-硫酸钠钠倍半水合物、酵母提取物。
37.固态发酵培养基由以下成分组成：葡萄糖70g/l、七水硫酸镁0.25g/l、七水硫酸锌0.05g/l、磷酸氢二钾0.3g/l、硫酸铵0.4g/l、碳酸钙47g/l、氯化铁0.01g/l、蛋白胨4g/l、尿素1.6g/l、琼脂13g/l、l-半胱氨酸s-硫酸钠钠倍半水合物2.8g/l、酵母提取物6.1g/l。
38.固态发酵培养基为圆柱体，培养基的直径为100mm，厚度为10mm。
39.米根霉固态发酵培养基的制备方法包括以下步骤：
40.1)取葡萄糖、蛋白胨，搅拌均匀，在温度为55℃条件下，加入七水硫酸镁、七水硫酸锌、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、尿素、氯化铁，混合均匀，加入琼脂，在温度为123℃、压力为0.12mpa条件下高温高压灭菌65min，取出放入摇床中，控制转速为225r/min、温度为35
℃，处理5min，制得混合液；
41.2)向步骤1)制得的混合液中加入添加剂l-半胱氨酸s-硫酸钠钠倍半水合物、酵母提取物(安琪酵母fm802)，搅拌均匀，控制温度为95℃、压力为0.1mpa条件下，冷却至30℃，静置至琼脂完全凝固，制得米根霉固态发酵培养基，置于避光、干燥、环境温度为20℃条件下保存，备用。
42.将米根霉种子培养液接种到上述制备得到的固态发酵培养基中，控制温度为35℃，ph为7.4条件下，发酵培养，得到发酵产物乳酸。
43.本实施例中使用米根霉为米根霉菌株hp25-3#，保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc no.12078。
44.实施例3
45.一种米根霉固态发酵培养基各组分如下：葡萄糖、七水硫酸镁、七水硫酸锌、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、氯化铁、蛋白胨、尿素、琼脂、l-半胱氨酸s-硫酸钠钠倍半水合物、酵母提取物。
46.固态发酵培养基由以下成分组成：葡萄糖75g/l、七水硫酸镁0.45g/l、七水硫酸锌0.04g/l、磷酸氢二钾0.45g/l、硫酸铵0.2g/l、碳酸钙60g/l、氯化铁0.011g/l、蛋白胨4g/l、尿素2.0g/l、琼脂15g/l、l-半胱氨酸s-硫酸钠钠倍半水合物3.5g/l、酵母提取物6.5g/l。
47.进一步的，所述固态发酵培养基为圆柱体；所述培养基的直径为12mm，厚度为8mm。
48.米根霉固态发酵培养基的制备方法包括以下步骤：
49.1)取葡萄糖、蛋白胨，搅拌均匀，在温度为60℃条件下，加入七水硫酸镁、七水硫酸锌、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、尿素、氯化铁，混合均匀，加入琼脂，在温度为125℃、压力为0.14mpa条件下高温高压灭菌80min，取出放入摇床中，控制转速为250r/min、温度为37℃，处理5min，制得混合液；
50.2)向步骤1)制得的混合液中加入添加剂l-半胱氨酸s-硫酸钠钠倍半水合物、酵母提取物(安琪酵母fm802)，搅拌均匀，控制温度为105℃、压力为0.12mpa条件下，冷却至40℃，静置至琼脂完全凝固，制得米根霉固态发酵培养基，置于避光、干燥、环境温度为25℃条件下保存，备用。
51.将米根霉种子培养液接种到上述制备得到的固态发酵培养基中，控制温度为37℃，ph为9.0条件下，发酵培养，得到发酵产物乳酸。
52.本实施例中使用米根霉为米根霉菌株hp25-3#，保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc no.12078。
53.实施例4
54.一种米根霉固态发酵培养基各组分如下：葡萄糖、七水硫酸镁、七水硫酸锌、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、氯化铁、蛋白胨、尿素、琼脂、l-半胱氨酸s-硫酸钠钠倍半水合物、酵母提取物。
55.固态发酵培养基由以下成分组成：葡萄糖70g/l、七水硫酸镁0.25g/l、七水硫酸锌0.05g/l、磷酸氢二钾0.3g/l、硫酸铵0.4g/l、碳酸钙47g/l、氯化铁0.01g/l、蛋白胨4g/l、尿素1.6g/l、琼脂13g/l、l-半胱氨酸s-硫酸钠钠倍半水合物2.8g/l、酵母提取物6.1g/l。
56.进一步的，所述固态发酵培养基为圆柱体；所述培养基的直径为100mm，厚度为10mm。
57.米根霉固态发酵培养基的制备方法包括以下步骤：
58.1)取葡萄糖、蛋白胨，搅拌均匀，在温度为60℃条件下，加入硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、尿素、氯化铁，混合均匀，加入琼脂，在温度为125℃、压力为0.14mpa条件下高温高压灭菌80min，取出放入摇床中，控制转速为250r/min、温度为37℃，处理5min，制得混合液；
59.2)向步骤1)制得的混合液中加入添加剂l-半胱氨酸s-硫酸钠钠倍半水合物、酵母提取物(安琪酵母fm802)，搅拌均匀，控制温度为105℃、压力为0.12mpa条件下，冷却至40℃，静置至琼脂完全凝固，制得米根霉固态发酵培养基，置于避光、干燥、环境温度为25℃条件下保存，备用。
60.将米根霉种子培养液接种到上述制备得到的固态发酵培养基中，控制温度为35℃，ph为7.4条件下，发酵培养，得到发酵产物乳酸。
61.本实施例中使用米根霉为米根霉菌株hp25-3#，保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc no.12078。
62.实施例5
63.一种米根霉固态发酵培养基各组分如下：葡萄糖、七水硫酸镁、七水硫酸锌、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、氯化铁、蛋白胨、尿素、琼脂、酵母提取物。
64.固态发酵培养基由以下成分组成：葡萄糖70g/l、七水硫酸镁0.25g/l、七水硫酸锌0.05g/l、磷酸氢二钾0.3g/l、硫酸铵0.4g/l、碳酸钙47g/l、氯化铁0.01g/l、蛋白胨4g/l、尿素1.6g/l、琼脂13g/l、酵母提取物6.1g/l。
65.固态发酵培养基为圆柱体，培养基的直径为100mm，厚度为10mm。
66.米根霉固态发酵培养基的制备方法包括以下步骤：
67.1)取葡萄糖、蛋白胨，搅拌均匀，在温度为55℃条件下，加入七水硫酸镁、七水硫酸锌、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、尿素、氯化铁，混合均匀，加入琼脂，在温度为123℃、压力为0.12mpa条件下高温高压灭菌65min，取出放入摇床中，控制转速为225r/min、温度为35℃，处理5min，制得混合液；
68.2)向步骤1)制得的混合液中加入酵母提取物(安琪酵母fm802)，搅拌均匀，控制温度为95℃、压力为0.1mpa条件下，冷却至30℃，静置至琼脂完全凝固，制得米根霉固态发酵培养基，置于避光、干燥、环境温度为20℃条件下保存，备用。
69.将米根霉种子培养液接种到上述制备得到的固态发酵培养基中，控制温度为37℃，ph为9.0条件下，发酵培养，得到发酵产物乳酸。
70.本实施例中使用米根霉为米根霉菌株hp25-3#，保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc no.12078。
71.实施例6
72.一种米根霉固态发酵培养基各组分如下：葡萄糖、七水硫酸镁、七水硫酸锌、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、氯化铁、蛋白胨、尿素、琼脂、色氨酸、酵母提取物。
73.固态发酵培养基由以下成分组成：葡萄糖70g/l、七水硫酸镁0.25g/l、七水硫酸锌0.05g/l、磷酸氢二钾0.3g/l、硫酸铵0.4g/l、碳酸钙47g/l、氯化铁0.01g/l、蛋白胨4g/l、尿素1.6g/l、琼脂13g/l、色氨酸2.8g/l、酵母提取物6.1g/l。
74.进一步的，所述固态发酵培养基为圆柱体；所述培养基的直径为100mm，厚度为
10mm。
75.米根霉固态发酵培养基的制备方法包括以下步骤：
76.1)取葡萄糖、蛋白胨，搅拌均匀，在温度为60℃条件下，加入七水硫酸镁、七水硫酸锌、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、尿素、氯化铁，混合均匀，加入琼脂，在温度为125℃、压力为0.14mpa条件下高温高压灭菌80min，取出放入摇床中，控制转速为250r/min、温度为37℃，处理5min，制得混合液；
77.2)向步骤1)制得的混合液中加入添加剂色氨酸、酵母提取物(安琪酵母fm802)，搅拌均匀，控制温度为105℃、压力为0.12mpa条件下，冷却至40℃，静置至琼脂完全凝固，制得米根霉固态发酵培养基，置于避光、干燥、环境温度为25℃条件下保存，备用。
78.将米根霉种子培养液接种到上述制备得到的固态发酵培养基中，控制温度为37℃，ph为9.0条件下，发酵培养，得到发酵产物乳酸。
79.本实施例中使用米根霉为米根霉菌株hp25-3#，保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc no.12078。
80.实验数据与分析
81.实施例1-6中米根霉种子培养液的配比均相同，种子培养液中总糖含量为8％，总氮含量为0.3％。取实施例1-6制备得到的固态发酵培养基，在无菌超净工作台中使用平板划线法将种子培养液接种至实施例1-6制备得到的固态发酵培养基。采用米根霉菌菌落在固体培养基表面生长面积占培养基总界面积的占比来表征转化率，各组培养基发酵检测数据如下表1；
[0082] 菌落数转化率，％实施例114380.2实施例215383.3实施例314781.4实施例412576.7实施例513078.7实施例611975.1
[0083]
表1
[0084]
从表1数据可知，实施例1-3制备得到的固态发酵培养基中米根霉菌培养转化率达到80％以上，综合来看实施例1-3制备得到的固态发酵培养基发酵培养米根霉菌的培养菌落数比实施例4-6中的菌落数多，培养转化率更高。因此也说明了本技术方案制备得到的固态发酵培养基更利于米根霉菌的生产，培养效果更好，效率更高。
[0085]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。