一种人外周血干细胞提取方法及应用与流程

1.本发明涉及干生物医学技术领域，尤其涉及一种人外周血干细胞提取方法及应用。


背景技术：

2.近30年里，造血干细胞被广泛地应用于血液病治疗的临床实践，已成为治疗和治愈恶性血液病、重型再生障碍性贫血、某些实体瘤、某些异常免疫病、某些遗传病、代谢病和极重度骨髓型放射病的最有效方法，已成为现代医学异军突起的重要方向。
3.生理状况下造血干细胞是定位在人体内平均氧浓度为3％的低氧环境中，而造血干细胞采集及处理程序则是在比人体内氧浓度高得多的21％氧气浓度环境下完成，目前全世界进行的普通细胞培养条件，都是远远超过生理条件的高氧气浓度。只是许多细胞对这种有毒的高氧环境的耐受能力比较高，干细胞这种相对脆弱的细胞则不同。研究人员发现，即便是短暂暴露于高氧环境下，也会给造血干细胞带来明显负面影响，造成造血干细胞数量减少、功能降低最终导致移植疗效下降。他们将这种效应称作为超出生理范围的氧休克/应激动 (extraphysiologicoxygen shock/stress，ephoss)。因此，需要提供一种避免给干细胞带来损害的干细胞提取方法。


技术实现要素：

4.为解决背景技术中提到的问题，本发明的目的在于提供一种人外周血干细胞提取方法及应用。
5.为了实现上述目标，本发明的技术方案为：
6.一种人外周血干细胞提取方法，包括如下步骤：
7.(1)：取新鲜抗凝血与羟乙基淀粉550按1:1比例混合，并加入环孢菌素 a，环保菌素a的浓度为0.3μg/ml，37℃条件下反应5-10分钟，得到混合液；
8.(2)：向步骤(1)所得的混合液中加入全血及组织稀释液，混匀，20℃～30 ℃条件下自然沉降20～30分钟，吸取上清液备用，其中全血及组织稀释液的体积为步骤(1)中所得的混合液的体积的二分之一；
9.(3)：向步骤(2)所得的上清液中加入细胞洗涤液，混匀，离心15分钟，弃上清液保留沉淀细胞，其中细胞洗涤液的体积为步骤(2)中所得上清液的两倍；
10.(4)：向步骤(3)所得的细胞沉淀中加入全血及组织稀释液形成混合液，调整细胞浓度为2
×
108～1
×
109个/ml，将所得混合液同细胞分离液加入离心管内，其中混合液叠加于细胞分离液的液面之上，混合液的体积为分离液的两倍；
11.(5)：将步骤(4)的混合液与细胞分离液离心20分钟，离心管中由上至下分为四层：
12.第一层：稀释液层；
13.第二层：环状乳白色层；
14.第三层：透明分离液层；
15.第四层：极少数红细胞层；
16.(6)：将步骤(5)所得环状乳白色层吸取后与细胞洗涤液混合，离心15 分钟，将沉淀洗涤即可得所需干细胞，其中，细胞洗涤液的体积为步骤(5)所得环状乳白色层的5～10倍。
17.一种人外周血干细胞提取方法在人体干细胞提取中的应用，包括如下步骤：
18.(1)：采用g-csf结合amd3100联合动员骨髓msc释放入血，连续5天皮下注射50μg/kg g-csf，第六天皮下注射5mg/kg amd3100，1小时后无菌条件下采血；
19.(2)：将步骤1所得血液与羟乙基淀粉550按1:1比例混合，并加入环孢菌素a，环保菌素a的浓度为0.3μg/ml，37℃条件下反应5-10分钟，得到混合液；
20.(3)：向步骤(2)所得的混合液中加入全血及组织稀释液，混匀，20℃～30 ℃条件下自然沉降20～30分钟，吸取上清液备用，其中全血及组织稀释液的体积为步骤(1)中所得的混合液的体积的二分之一；
21.(4)：向步骤(3)所得的上清液中加入细胞洗涤液，混匀，离心15分钟，弃上清液保留沉淀细胞，其中细胞洗涤液的体积为步骤(2)中所得上清液的两倍；
22.(5)：向步骤(4)所得的细胞沉淀中加入全血及组织稀释液形成混合液，调整细胞浓度为2
×
108～1
×
109个/ml，将所得混合液同细胞分离液加入离心管内，其中混合液叠加于细胞分离液的液面之上，混合液的体积为分离液的两倍；
23.(6)：将步骤(5)的混合液与细胞分离液离心20分钟，离心管中由上至下分为四层：
24.第一层：稀释液层；
25.第二层：环状乳白色层；
26.第三层：透明分离液层；
27.第四层：极少数红细胞层；
28.(7)：将步骤(6)所得环状乳白色层吸取后与细胞洗涤液混合，离心15 分钟，将沉淀洗涤即可得所需干细胞，其中，细胞洗涤液的体积为步骤(5)所得环状乳白色层的5～10倍。
29.本发明的有益效果为：向人外周血添加环孢菌素a能够保证在空气中收集人外周血中的造血干细胞时避免发生ephoss反应,从而增加了可用于移植的造血干细胞数目，提取的造血干细胞不分化，不转化，提取率高。
具体实施方式
30.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
31.实施例1：
32.一种人外周血干细胞提取方法在人体干细胞提取中的应用，包括如下步骤：
33.(1)：采用g-csf结合amd3100联合动员骨髓msc释放入血，连续5天皮下注射50μg/kg g-csf，第六天皮下注射5mg/kg amd3100，1小时后无菌条件下采血10ml；
34.(2)：将步骤1所得血液与羟乙基淀粉550(cat#：hes-tbd550)按1:1 比例混合，并加入环孢菌素a，环保菌素a的浓度为0.3μg/ml，37℃条件下反应10分钟，得到混合液；
35.(3)：向步骤(2)所得的混合液中加入全血及组织稀释液(cat#：2010c1119)，混匀，30℃条件下自然沉降30分钟，吸取上清液备用，其中全血及组织稀释液 (cat#：2010c1119)的体积为步骤(1)中所得的混合液的体积的二分之一；
36.(4)：向步骤(3)所得的上清液中加入细胞洗涤液(cat#：2010x1118)，混匀，以1800转/分离心15分钟，采用半径15cm水平转子，弃上清液保留沉淀细胞，其中细胞洗涤液的体积为步骤(2)中所得上清液的两倍；
37.(5)：向步骤(4)所得的细胞沉淀中加入全血及组织稀释液(cat#： 2010c1119)形成混合液，调整细胞浓度为1
×
109个/ml，将所得混合液同细胞分离液加入离心管内，其中混合液叠加于细胞分离液的液面之上，混合液的体积为分离液的两倍；
38.(6)：将步骤(5)的混合液与细胞分离液(分离液采用天津灏洋tbd实验室的分离液)以1500转/分离心20分钟，采用半径15cm水平转子，离心管中由上至下分为四层：
39.第一层：稀释液层；
40.第二层：环状乳白色层，含有干细胞；
41.第三层：透明分离液层；
42.第四层：极少数红细胞层；
43.(7)：将步骤(6)所得环状乳白色层吸取后与细胞洗涤液(cat#： 2010x1118)混合，以1800转/分离心15分钟，采用半径15cm水平轴转子，将沉淀洗涤两次即可得所需干细胞，细胞洗涤液(cat#：2010x1118)的体积为步骤(6)中所得环状乳白色层的10倍。
44.由于在血液中加入了环孢菌素a，能够保证在空气中收集人外周血中的造血干细胞时避免发生ephoss反应,从而增加了可用于移植的造血干细胞数目，提取的造血干细胞不分化，不转化，提取率可达到80％。
45.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所有的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。