聚乳酸两性离子化合物、合成方法及应用

1.本公开涉及美容领域，尤其涉及一种聚乳酸两性离子化合物、合成方法及应用。


背景技术：

2.人体衰老是一种自发的必然过程，常见表现包括形态变化和生理功能衰退；形态变化如细胞变少，新陈代谢变缓，皮肤松弛塌陷。
3.聚左旋聚乳酸(poly-l-lactic acid，plla)，是一种可降解的合成聚合物，被广泛应用于医用、包装等领域，并经过美国fda认证属于可用于人体的生物医用材料。目前常采用左旋聚乳酸作为医疗美容行业的注射填充品。注射左旋聚乳酸后，首先能够起到填充的作用，改善皮肤塌陷；其次在其降解的过程中，在体内经过酶分解，会降解成左旋乳酸，对皮肤的表皮层细胞新陈代谢具有促进作用，可以达到调节微环境，让表皮细胞分裂顺畅，达到紧致嫩肤的作用；另外人体内含有乳酸，并且地球上所有生命体都是左旋氨基酸构成的，对于左旋化合物具有非常好的相容性。故而人体的免疫系统会识别其为无害物质，巨噬细胞不会去吞噬左旋聚乳酸。
4.虽然人体的免疫系统不会吞噬掉左旋聚乳酸，但是乳酸在人体内是一种“废料”，是肌肉在燃烧碳水化合物的过程中不完全分解的产物，在果糖酶的水解作用下会恢复成糖分将热量重新储存起来。但皮肤细胞无法利用这部分能量，便会激发纤维母细胞产生大量的胶原蛋白，将入侵的异物包裹起来，造成聚乳酸难以被降解，从而激发排异反应。例如有时注射后会产生明显的结节和硬块，需要等数月甚至更久才能自行缓解。


技术实现要素：

5.(一)要解决的技术问题
6.针对上述技术问题，本公开提供了一种聚乳酸两性离子化合物、合成方法及应用，以期至少部分地解决上述技术问题中的至少之一。
7.(二)技术方案
8.为了解决上述技术问题，本公开的技术方案如下：
9.作为本公开的一方面，提供一种聚乳酸两性离子化合物的合成方法，包括：
10.(1)将两性离子化合物与l-丙交酯混合，并加热使l-丙交酯融化；
11.(2)向所述步骤(1)的混合物中加入催化剂搅拌反应，得到所述聚乳酸两性离子化合物；
12.其中，所述两性离子化合物包括甘油磷酸胆碱，或甘油磷酸胆碱修饰物中的一种；
13.所述甘油磷酸胆碱修饰物包括如下的式(i)或式(ii)：
[0014][0015]
在其中一个实施例中，所述步骤(1)中还包括生物降解材料，其中，所述生物降解材料包括l-乙交酯和ε-己内酯中的一种或两种；
[0016]
其中，所述l-乙交酯与所述l-丙交酯的摩尔比为(0-100)∶1；
[0017]
所述ε-己内酯与所述l-丙交酯的摩尔比为(0-100)∶1。
[0018]
在其中一个实施例中所述两性离子化合物与所述l-丙交酯的摩尔比为1∶(10-100000)；
[0019]
所述催化剂与所述l-丙交酯的摩尔比为(0.00001-0.1)∶1。
[0020]
在其中一个实施例中，所述两性离子化合物与所述l-丙交酯的摩尔比为1∶(50-250)；
[0021]
所述催化剂与所述l-丙交酯的摩尔比为(0.002-0.1)∶1。
[0022]
在其中一个实施例中，所述催化剂包括以下一种或多种：β-二酮分别与锌离子、镁离子、钙离子配位形成的配位化合物；酮亚胺分别与锌离子、镁离子、钙离子配位形成的配位化合物；胺基酚分别与锌离子、镁离子、钙离子配位形成的配位化合物；β-二亚胺分别与锌离子、镁离子、钙离子配位形成的配位化合物；席夫碱分别与锌离子、镁离子、钙离子配位形成的配位化合物；以及乳酸锌、醋酸锌、氯化锌、氯化钙、氧化钙、氯化镁、氧化镁、二丁基镁、氧化铁、醋酸铁、氯化铁、二茂铁、铁的羧酸盐、乙酰丙酮铁、卟啉铁和氯化铝。
[0023]
在其中一个实施例中，在步骤(2)之后还包括：
[0024]
(3)聚乳酸两性离子化合物的提纯：将步骤(2)中得到的所述聚乳酸两性离子化合物加入到用于溶解所述聚乳酸两性离子化合物的有机溶剂中，以将所述聚乳酸两性离子化合物溶解，得到聚合物溶液；然后，将聚合物溶液滴加至用于析出所述聚乳酸两性离子化合物的有机溶剂中沉淀析出，并将沉淀物干燥。
[0025]
在其中一个实施例中，用于溶解所述聚乳酸两性离子化合物的有机溶剂包括氯仿、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯中的一种或多种；
[0026]
用于析出所述聚乳酸两性离子化合物的有机溶剂包括乙醚、甲醇、乙醇中的一种或多种。
[0027]
在其中一个实施例中，在所述步骤(1)中，反应条件为无水无氧，反应温度为100-250℃；在所述步骤(2)中，反应温度为100-250℃，反应时间为2-24h。
[0028]
作为本公开的另一方面，提供一种利用上述方法制备得到的聚乳酸两性离子化合物。
[0029]
作为本公开的第三方面，提供一种上述聚乳酸两性离子化合物在美容注射填充品
方面的应用。
[0030]
(三)有益效果
[0031]
1.本公开通过采用高分子活性聚合方法在聚乳酸上嫁接两性离子化合物(甘油磷酸胆碱或甘油磷酸胆碱修饰物)形成聚乳酸两性离子化合物，磷脂酰胆碱分子上的两个脂肪酰基完全被水解的产物是人体内正常存在的水溶性两性离子物质。因此，本公开中的聚乳酸两性离子化合物不仅保持了聚乳酸的可降解性，而且甘油磷酸胆碱或其修饰物的两性离子特性可以使聚乳酸在皮肤组织中避免蛋白等的粘附，提高抗蛋白粘附特性，从而提高聚乳酸在皮肤组织中的稳定性，避免形成肿块，降低副作用。同时降解形成的甘油磷酸胆碱小分子和乳酸小分子产生协同作用，提高新陈代谢水平，刺激细胞增长，恢复肌肤弹性、光滑性。另外，本公开中的聚乳酸两性离子化合物降解后的产物甘油磷酸胆碱和乳酸均为体内存在的物质，具有较好的安全性。
[0032]
2.本公开提供的聚乳酸两性离子化合物降解产生的甘油磷酸胆碱，在机体内酶的作用下分解成胆碱和甘油磷酸脂。胆碱在体内用于参加乙酰胆碱的生物合成，而乙酰胆碱是神经触发递质的一种，老年痴呆症的发病机制又与神经递质乙酰胆碱缺乏密切相关，因此，本公开提供的聚乳酸两性离子化合物降解产生的甘油磷酸胆碱还具有显著的健脑和预防老年痴呆症等功效；甘油磷酸脂是卵磷脂的前身，参与卵磷脂的合成。同时甘油磷酸胆碱作皮肤调理剂，可提高脂肪酶的活性，防止脂肪堆积，提高脂肪与肌肉的新陈代谢，改善皮肤状态。
[0033]
3.本公开采用的聚合方法一步即可得到目标化合物，制备步骤简单，制备过程绿色无毒，且实验条件要求较低，适合工业化制备。
[0034]
4.采用本公开提供的聚合方法得到聚合物的收率为89-93.5％。
附图说明
[0035]
图1是本公开的聚乳酸两性离子化合物的核磁图谱；
[0036]
图2是本公开的聚乳酸两性离子化合物抗蛋白粘附性能测试图；
[0037]
图3是本公开的聚乳酸两性离子化合物水解性能的测试图；
[0038]
图4是本公开的聚乳酸两性离子化合物安全性的测试图。
具体实施方式
[0039]
为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开作进一步的详细说明。
[0040]
本公开还提供了一种聚乳酸两性离子化合物的合成方法，包括：
[0041]
(1)将两性离子化合物与l-丙交酯混合，并加热使l-丙交酯融化；
[0042]
(2)向所述步骤(1)的混合物中加入催化剂搅拌反应，得到所述聚乳酸两性离子化合物；
[0043]
其中，所述两性离子化合物包括甘油磷酸胆碱，或甘油磷酸胆碱修饰物中的一种；
[0044]
所述甘油磷酸胆碱修饰物包括如下的式(i)或式(ii)：
[0045][0046]
本公开通过采用高分子活性聚合方法在聚乳酸上嫁接两性离子化合物(甘油磷酸胆碱或甘油磷酸胆碱修饰物)形成聚乳酸两性离子化合物，磷脂酰胆碱分子上的两个脂肪酰基完全被水解的产物是人体内正常存在的水溶性两性离子物质。因此，本公开中的聚乳酸两性离子化合物不仅保持了聚乳酸的可降解性，而且甘油磷酸胆碱或其修饰物的两性离子特性可以使聚乳酸在皮肤组织中避免蛋白等的粘附，提高抗蛋白粘附特性，从而提高聚乳酸在皮肤组织中的稳定性，避免形成肿块，降低副作用。同时降解形成的甘油磷酸胆碱小分子和乳酸小分子产生协同作用，提高新陈代谢水平，刺激细胞增长，恢复肌肤弹性、光滑性。另外，本公开中的聚乳酸两性离子化合物降解后的产物甘油磷酸胆碱和乳酸均为体内存在的物质，具有较好的安全性。
[0047]
另外，本公开提供的聚乳酸两性离子化合物降解后的产物甘油磷酸胆碱在机体内酶的作用下分解成胆碱和甘油磷酸脂。胆碱在体内用于参加乙酰胆碱的生物合成，而乙酰胆碱是神经触发递质的一种，老年痴呆症的发病机制又与神经递质乙酰胆碱缺乏密切相关，因此，本公开提供的聚乳酸两性离子化合物降解产生的甘油磷酸胆碱还具有显著的健脑和预防老年痴呆症等功效；甘油磷酸脂是卵磷脂的前身，参与卵磷脂的合成。同时甘油磷酸胆碱作皮肤调理剂，可提高脂肪酶的活性，防止脂肪堆积，提高脂肪与肌肉的新陈代谢，改善皮肤状态。
[0048]
此外，本公开采用的聚合方法一步即可得到目标化合物，制备步骤简单，制备过程绿色无毒，且实验条件要求较低，适合工业化制备。
[0049]
根据本公开的实施例，甘油磷酸胆碱修饰物式(i)的合成方法包括：
[0050]
①
取甘油磷酸胆碱溶解于无水吡啶中，配成质量浓度为0.1-10％的溶液，再加入三苯基氯甲烷得到反应液，其中，三苯基氯甲烷与甘油磷酸胆碱摩尔比在(1-2)∶1。
[0051]
②
将步骤
①
中的反应液在30-70℃下反应1-12h，然后用乙酸乙酯萃取得到有机液，浓缩有机液得到残渣。
[0052]
③
将步骤
②
中得到的残渣在0℃下用无水的n，n-二甲基甲酰胺溶解，配成质量浓度为0.1-10％的溶液，然后向溶液中缓慢添加1-10％的氢化钠，并在0℃搅拌30分钟后加入溴化苄，溴化苄与甘油磷酸胆碱摩尔比为(1-4)∶1，将上述混合物加热至室温并搅拌过夜。
[0053]
④
向步骤
③
中得到的混合物中加入饱和nh4cl溶液使反应停止，并用乙酸乙酯萃取，浓缩有机层，得到苄基化产物。
[0054]
⑤
将步骤
④
得到的苄基化产物溶解于二氯甲烷和甲醇(v/v＝1∶1)的混合溶剂中，配成质量浓度为0.1-10％的溶液，然后向溶液中添加对甲苯磺酸，搅拌4小时得到反应混合
物，其中，对甲苯磺酸在溶液中的质量浓度为1-10％；最后用饱和碳酸氢钠溶液中和反应混合物，用乙酸乙酯萃取得到有机液，浓缩有机液得到甘油磷酸胆碱修饰物式(i)。
[0055]
甘油磷酸胆碱修饰物式(i)的合成路线如下：
[0056][0057]
根据本公开的实施例，甘油磷酸胆碱修饰物式(ii)的合成方法包括：
[0058]
①
取甘油磷酸胆碱溶解于无水吡啶中，配成质量浓度为0.1-10％的溶液，再加入三苯基氯甲烷得到反应液，其中，三苯基氯甲烷与甘油磷酸胆碱摩尔比为(1-2)∶1。
[0059]
②
将步骤
①
中的反应液在30-70℃反应1-12h，然后用乙酸乙酯萃取，并浓缩有机层得到甘油磷酸胆碱修饰物式(ii)。
[0060]
甘油磷酸胆碱修饰物式(ii)的合成路线如下：
[0061][0062]
根据本公开的实施例，在步骤(2)之后还包括：
[0063]
步骤(3)，聚乳酸两性离子化合物的提纯：将步骤(2)中得到的聚乳酸两性离子化合物加入到用于溶解聚乳酸两性离子化合物的有机溶剂中，以将聚乳酸两性离子化合物溶解，得到聚合物溶液；然后，将聚合物溶液滴加至用于析出聚乳酸两性离子化合物的有机溶剂中沉淀析出，并将沉淀物干燥。
[0064]
根据本公开的实施例，用于溶解聚乳酸两性离子化合物的有机溶剂包括氯仿、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯中的一种或多种。
[0065]
根据本公开的实施例，用于溶解聚乳酸两性离子化合物的有机溶剂可以为二氯甲烷。
[0066]
根据本公开的实施例，用于析出聚乳酸两性离子化合物的有机溶剂包括乙醚、甲醇、乙醇中的一种或多种。
[0067]
根据本公开的实施例，用于析出聚乳酸两性离子化合物的有机溶剂可以为乙醚。
[0068]
根据本公开的实施例，两性离子化合物与l-丙交酯的摩尔比为1∶(10-100000)；催化剂与l-丙交酯的摩尔比为(0.00001-0.1)∶1。
[0069]
根据本公开的实施例，两性离子化合物与l-丙交酯的摩尔比为1∶(50-250)；催化剂与l-丙交酯的摩尔比为(0.002-0.1)∶1。
[0070]
根据本公开的实施例，例如，甘油磷酸胆碱与l-丙交酯的摩尔比可以为1∶50、1∶100、1∶200，催化剂与l-丙交酯的摩尔比可以为0.002∶1、0.01∶1、0.1∶1等等。
[0071]
根据本公开的实施例，催化剂包括以下一种或多种：β-二酮分别与锌离子、镁离子、钙离子配位形成的配位化合物；酮亚胺分别与锌离子、镁离子、钙离子配位形成的配位化合物；胺基酚分别与锌离子、镁离子、钙离子配位形成的配位化合物；β-二亚胺分别与锌离子、镁离子、钙离子配位形成的配位化合物；席夫碱分别与锌离子、镁离子、钙离子配位形成的配位化合物；以及乳酸锌、醋酸锌、氯化锌、氯化钙、氧化钙、氯化镁、氧化镁、二丁基镁、
氧化铁、醋酸铁、氯化铁、二茂铁、铁的羧酸盐、乙酰丙酮铁、卟啉铁和氯化铝。
[0072]
根据本公开的实施例，例如，催化剂可以为醋酸锌。
[0073]
根据本公开的实施例，在步骤(1)中，反应条件为无水无氧，反应温度为100-250℃。
[0074]
根据本公开的实施例，例如，在步骤(1)中的反应温度可以为120℃、150℃、200℃等等。
[0075]
根据本公开的实施例，在步骤(2)中，反应温度为100-250℃，反应时间为2-24h。
[0076]
根据本公开的实施例，例如，在步骤(2)中的反应温度可以为120℃、150℃、200℃；反应时间可以为10h、16h、24h，等等。
[0077]
根据本公开的实施例，在步骤(1)中还包括生物降解材料，其中生物降解材料包括l-乙交酯和ε-己内酯中的一种或两种。
[0078]
根据本公开的实施例，在步骤(1)中，l-乙交酯与所述l-丙交酯的摩尔比为(0-100)：1；所述ε-己内酯与所述l-丙交酯的摩尔比为(0-100)：1。
[0079]
本公开还提供了利用上述方法合成的聚乳酸两性离子化合物，例如，式(i)、式(ii)、式(iii)、式(iv)，具体结构如下：
[0080]
[0081][0082]
其中，n和x为大于等于1的整数，y和z为大于等于0的整数。
[0083]
本公开还提供了一种上述聚乳酸两性离子化合物在美容注射填充品方面的应用。
[0084]
以下列举具体案例(即具体实施例)对本公开的技术方案作进一步说明。
[0085]
案例1
[0086]
一种由以下方法合成的聚乳酸两性离子化合物，包括：
[0087]
(1)取50ml的schlenk瓶，在加热条件下，抽真空-通氮气循环三次，确保schlenk瓶中无水无氧；然后，向schlenk瓶中加入0.5mmol甘油磷酸胆碱和25mmol l-丙交酯，并在120℃的油浴条件下加热搅拌，使l-丙交酯全部融化；
[0088]
(2)待甘油磷酸胆碱和l-丙交酯混合均匀后，向schlenk瓶加入0.05mmol的乙酸锌，在120℃下搅拌反应24h，生成聚乳酸两性离子化合物；
[0089]
(3)聚乳酸两性离子化合物的提纯：反应结束后，取出schlenk瓶降温至室温，然后向schlenk瓶内加入二氯甲烷以溶解生成的聚乳酸两性离子化合物，得到聚合物溶液；之后，将聚合物溶液滴加至50ml的乙醚中进行沉淀并抽滤，完成一次提纯；如此重复溶解-沉淀-抽滤三次后，于真空条件下干燥，得到聚乳酸两性离子化合物，产率为89.5％。
[0090]
其中，上述聚乳酸两性离子化合物的合成路线如下：
[0091][0092]
本案例制备的聚乳酸两性离子化合物的核磁图如图1所示，其中，3.35ppm处(图1中的a)的峰为氮上所接甲基的氢峰，1.45-1.68ppm(图1中的b)和5.15-5.23ppm(图1中的c)处的峰分别为乳酸中两个氢峰，说明采用本案例的合成方法制备得出来目标产物。
[0093]
案例2
[0094]
(1)取50ml的schlenk瓶，在加热条件下，抽真空-通氮气循环三次，确保schlenk瓶中无水无氧；然后，向schlenk瓶中加入0.5mmol甘油磷酸胆碱和50mmol l-丙交酯，并在120℃的油浴条件下加热搅拌，使l-丙交酯全部融化；
[0095]
(2)待甘油磷酸胆碱和l-丙交酯混合均匀后，向schlenk瓶加入0.1mmol乙酸锌，在120℃下搅拌反应24h，生成聚乳酸两性离子化合物；
[0096]
(3)聚乳酸两性离子化合物的提纯：反应结束后，取出schlenk瓶降温至室温，然后向schlenk瓶内加入二氯甲烷以溶解生成的聚乳酸两性离子化合物，得到聚合物溶液；之后，将聚合物溶液滴加至50ml的乙醚中进行沉淀并抽滤，完成一次提纯；如此重复溶解-沉淀-抽滤三次后，于真空条件下干燥，得到聚乳酸两性离子化合物，产率为93.5％。
[0097]
案例3
[0098]
(1)取50ml的schlenk瓶，在加热条件下，抽真空-通氮气循环三次，确保schlenk瓶中无水无氧；然后，向schlenk瓶中加入0.5mmol甘油磷酸胆碱和100mmol l-丙交酯，并在120℃的油浴条件下加热搅拌，使l-丙交酯全部融化；
[0099]
(2)待甘油磷酸胆碱和l-丙交酯混合均匀后，向schlenk瓶加入0.2mmol乙酸锌，在120℃下搅拌反应24h，生成聚乳酸两性离子化合物；
[0100]
(3)聚乳酸两性离子化合物的提纯：反应结束后，取出schlenk瓶降温至室温，然后向schlenk瓶内加入二氯甲烷以溶解生成的聚乳酸两性离子化合物，得到聚合物溶液；之后，将聚合物溶液滴加至50ml的乙醚中进行沉淀并抽滤，完成一次提纯；如此重复溶解-沉淀-抽滤三次后，于真空条件下干燥，得到聚乳酸两性离子化合物，产率为91.3％。
[0101]
根据案例1-3可以看出，采用本公开提供的聚合方法可以得到聚乳酸两性离子化合物，且产率可以达到89-93.5％。
[0102]
以下对案例1-3中得到的聚乳酸两性离子化合物分别进行抗蛋白粘附性能、水解性能和安全性能进行测试，具体测试如下：
[0103]
(1)抗蛋白粘附性能
[0104]
①
分别采用案例1-3中制备的聚乳酸两性离子化合物制备纳米离子溶液，制备方法如下：
[0105]
取一定量的聚乳酸两性离子化合物，置于样品瓶中，加入5ml丙酮溶液，超声至完全溶解；然后，在干净的烧杯中加入95ml超纯水，采用磁力搅拌；之后，在搅拌状态下，将丙酮溶液缓慢逐滴加入到水中，继续磁力搅拌4h至丙酮完全挥发，形成纳米粒子溶液。
[0106]
案例1-3中得到的纳米离子溶液的粒径列于表1。
[0107]
表1
[0108]
样品粒径案例194-3
±
4.3nm案例2115.2
±
7.5nm案例3123.6
±
5.2nm
[0109]
②
分别对上述制备的纳米粒子溶液进行抗蛋白粘附测试
[0110]
称取适量的纳米粒子溶液，加入到含有10％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液溶液中，且磷酸盐缓冲溶液的ph＝7.4，并在37℃下保持，每隔10min，用动态光散射测试纳米粒子粒径。测试结果如图2所示。
[0111]
由图2可以看出，随着时间的变化，纳米粒子溶液的粒径变化不大，说明本公开中的纳米粒子具有良好的抗蛋白粘附的能力，在蛋白环境中保持较好的稳定性，且具有良好的体内循环稳定性。
[0112]
(2)水解性能测试
[0113]
分别采用案例1-3中制备的聚乳酸两性离子化合物进行水解实验，具体实验方法如下：
[0114]
称取适量的聚乳酸两性离子化合物，记录质量w0，然后加入到ph＝7.4的磷酸盐缓冲液得到聚合物悬浮液，将聚合物悬浮液在37℃下不断搅拌，且每隔24h后，过滤聚合物悬浮液，用超纯水冲洗3遍，并在40℃下真空干燥至恒重，记录质量w
t
，然后计算质量损失率w％，计算公式如下：
[0115]
w％＝(w
t-w0)/w0×
100％。
[0116]
上述对案例1-3中的聚乳酸两性离子化合物水解实验结果如图3所示。由图3可以看出，随着时间的增加，聚乳酸两性离子化合物的质量损失率逐渐增加，说明本公开提供的聚乳酸两性离子化合物在磷酸盐缓冲液产生了降解，说明本公开提供的聚乳酸两性离子化合物具有良好的降解性能。
[0117]
(3)安全性测试
[0118]
分别对案例1-3中的聚乳酸两性离子化合物进行毒性实验，具体方法如下：
[0119]
在96孔板中接种hela细胞，采用dmem营养液培养过夜使细胞完全贴壁；然后更换营养液为含有200ug/ml本公开中的聚乳酸两性离子化合物的dmem营养液，继续培养24h；之后用新鲜dmem营养液清洗3遍，加入含有10％cck-8的dmem营养液，继续培养4h；最后用酶标仪测试96孔板中细胞在450nm处的吸光度，并与空白对照组进行对比，得出被聚乳酸两性离子化合物处理的的细胞存活率数据。空白对照组为未被聚乳酸两性离子化合物处理的细胞，具体结果如图4。
[0120]
其中，cck-8试剂在电子耦合试剂(即细胞处于存活状态时)存在的情况下，可被nad 氧化还原成为水溶性的黄色甲瓒产物。存活的细胞越多，产生的甲瓒就越多，颜色也会越深，吸光度越高，所以可以认为吸光度的高低与存活细胞的数量成正比。
[0121]
由图4可以看出，被聚乳酸两性离子化合物处理的的细胞存活率数据与对照组的细胞存活数据相差不大，且细胞存活率均接近100％，说明案例1-3中制备的聚乳酸两性离子化合物均无细胞毒性，具有良好的生物相容性，具有体内应用前景。
[0122]
以上所述的具体实施例，对本公开的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详
细说明，应理解的是，以上所述仅为本公开的具体实施例而已，并不用于限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。