一种猪肝中提取5核苷酸酶方法与流程

1.本发明涉及5核苷酸酶提取技术领域，尤其涉及一种猪肝中提取 5核苷酸酶方法。


背景技术：

2.5'-核苷酸酶(5'-nt)是一种对底物特异性不高的水解酶，可作用于多种核苷酸。此酶主要来源于肝脏，广泛存在于人体组织，如肝、胆、肠、脑、心、胰等。定位于细胞质膜上，在肝内此酶主要存在于胆小管和窦状隙膜内。5'-nt测定主要用于肝胆系统疾病的诊断和骨骼疾病的鉴别诊断。血清5'-nt活性升高主要见于肝胆系统疾病，如阻塞性黄疸、肝癌、肝炎等，其活性变化与alp一致。但骨骼系统疾病，如肿瘤转移、畸形性骨炎、佝偻病、甲状旁腺功能亢进等，通常 alp活性升高，而5'-nt正常。因此alp和5'-nt同时测定有助于肝胆和骨骼系统疾病的鉴别诊断。
3.目前市场上有(5'-nt)测定试剂盒的有很多，例如四川迈克，北京九强等厂家，他们用比色法在生化分析仪上使用广泛，在这些试剂盒配套的校准品和质控品中要添加高纯度的5'-nt，尤其在制作标准物质时需要高浓度高纯度的5'-nt。5'-核苷酸酶目前使用的都是从高值患者血清中找，找到后添加到血清基质中解决校准质控问题。血清基质具有生物安全风险，人体血清中含有物质很多，在检测过程中带来干扰，进口的原材料很贵，一直困扰体外诊断试剂行业。


技术实现要素：

4.基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种猪肝中提取5 核苷酸酶方法。
5.本发明提出的一种猪肝中提取5核苷酸酶方法，包括以下步骤：
6.s1：取1份新鲜猪肝5份水捣碎，先用纱布过滤，然后用4微米滤膜过滤，得到酶粗液；
7.s2：用生化分析仪和相应诊断试剂检测酶粗液中的肌酸激酶和 5'-核苷酸酶的含量，记录第二点的吸光度；
8.s3：用加入50克每升的高岭土吸附酶粗液中大颗粒杂质加入后静置30分钟，过滤；
9.s4：加入白蛋白酶在37℃条件下，恒温保温48小时，酶液会出现漂浮物，将漂浮物过滤掉得到上清液，检测酶粗液中肌酸激酶和 5'-核苷酸酶和肌酸激酶的含量，记录第二点的吸光度值；
10.s5：加入凝血酶37℃恒温保存48小时，将新鲜肝脏中带来的凝血因子去除得到酶精液，过滤，离心，得到低浓度5'-核苷酸酶液体；
11.s6：用生化分析仪和相应诊断试剂检测酶粗液中肌酸激酶和5'
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核苷酸酶的含量，记录第二点的吸光度值酶液中肌酸激酶含量为0，第二点吸光度值接近0值时说明该液体中5'-核苷酸酶纯度较高，杂质较少)，用分子量1000的透析袋进行透析8小时得到高浓度5'-核苷酸酶液体。
12.优选地，所述s4中白蛋白酶浓度为2ku/l。
13.优选地，所述s5中凝血酶浓度为1ku/l。
14.本发明的有益效果为：
15.本发明提出的5核苷酸酶提取方法，建立了非临床基质5'-核苷酸酶校准品、质控品的制备方法和评价方案，解决了5'-核苷酸酶测定试剂盒临床生化检验过程中系统定标准确性、临床检测过程内部质量控制及生化试剂长期稳定性考察的问题，低成本、高性能。
附图说明
16.图1为本发明提出的一种猪肝中提取5核苷酸酶方法的酶液过滤后的result：1775浓度ck第二点吸光度值相应曲线图(黑色加粗曲线为酶液过滤后的ck主波长的反应曲线，断裂曲线为副波长的反应曲线，黑色曲线为主波长减去副波长的反应曲线)；
17.图2为本发明提出的一种猪肝中提取5核苷酸酶方法的酶液过滤后的result：47.7浓度5nt及第二点吸光度值相应曲线图(黑色加粗曲线为酶液过滤后的5nt主波长的反应曲线，断裂曲线为副波长的反应曲线，黑色曲线为主波长减去副波长的反应曲线)；
18.图3为本发明提出的一种猪肝中提取5核苷酸酶方法的去除其他酶类物质后result：20浓度的ck及第二点吸光度值相应曲线(黑色加粗曲线为酶液过滤后的ck主波长的反应曲线，断裂曲线为副波长的反应曲线，黑色曲线为主波长减去副波长的反应曲线)；
19.图4为本发明提出的一种猪肝中提取5核苷酸酶方法的去除其他酶类物质后result：145.0浓度的5nt及第二点吸光度值相应曲线(黑色加粗曲线为酶液过滤后的5nt主波长的反应曲线，断裂曲线为副波长的反应曲线，黑色曲线为主波长减去副波长的反应曲线)；图5为本发明提出的一种猪肝中提取5核苷酸酶方法制备流程结
具体实施方式
20.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
21.实施例1，参照图5，一种猪肝中提取5核苷酸酶方法，s1：取 1份新鲜猪肝5份水捣碎，先用纱布过滤，然后用4微米滤膜过滤，得到酶粗液；
22.s2：用生化分析仪和相应诊断试剂检测酶粗液中的肌酸激酶和 5'-核苷酸酶的含量，记录第二点的吸光度；
23.s3：用加入50克每升的高岭土吸附酶粗液中大颗粒杂质加入后静置30分钟，过滤；
24.s4：加入浓度为2ku/l的白蛋白酶在37℃条件下，恒温保温48 小时，酶液会出现漂浮物，将漂浮物过滤掉得到上清液，检测酶粗液中肌酸激酶和5'-核苷酸酶和肌酸激酶的含量，记录第二点的吸光度值；
25.s5：加入浓度为1ku/l的凝血酶，在37℃恒温保存48小时，将新鲜肝脏中带来的凝血因子去除得到酶精液，过滤，离心，得到低浓度5'-核苷酸酶液体；
26.s6：用生化分析仪和相应诊断试剂检测酶粗液中肌酸激酶和5'
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核苷酸酶的含量，记录第二点的吸光度值酶液中肌酸激酶含量为0，第二点吸光度值接近0值时说明该液体中5'-核苷酸酶纯度较高，杂质较少)，用分子量1000的透析袋进行透析8小时得到高浓度5'-核苷酸酶液体。
27.本实验使用河北艾欧路生产的肌酸激酶测定试剂盒和5核苷酸酶测定试剂盒及英国朗道公司生产的相应校准质控。
28.酶液过滤后的ck,5nt的浓度及第二点吸光度值相应曲线分别如图1和图2所示；
29.酶液过滤后的ck浓度为result：1775浓度，酶液过滤后的5nt 浓度为result：47.7；
30.去除其他酶类物质后的ck,5nt的浓度及第二点吸光度值相应曲线分别如图3和图4所示；
31.去除其他酶类物质后的ck浓度为result：20，去除其他酶类物质后的5nt浓度为result：145.0。
32.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。


技术特征：
1.一种猪肝中提取5核苷酸酶方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：取1份新鲜猪肝5份水捣碎，先用纱布过滤，然后用4微米滤膜过滤，得到酶粗液；s2：用生化分析仪和相应诊断试剂检测酶粗液中的肌酸激酶和5'-核苷酸酶的含量，记录第二点的吸光度；s3：用加入50克每升的高岭土吸附酶粗液中大颗粒杂质加入后静置30分钟，过滤；s4：加入白蛋白酶在37℃条件下，恒温保温48小时，酶液会出现漂浮物，将漂浮物过滤掉得到上清液，检测酶粗液中肌酸激酶和5'-核苷酸酶和肌酸激酶的含量，记录第二点的吸光度值；s5：加入凝血酶37℃恒温保存48小时，将新鲜肝脏中带来的凝血因子去除得到酶精液，过滤，离心，得到低浓度5'-核苷酸酶液体；s6：用生化分析仪和相应诊断试剂检测酶粗液中肌酸激酶和5'-核苷酸酶的含量，记录第二点的吸光度值酶液中肌酸激酶含量为0，第二点吸光度值接近0值时说明该液体中5'-核苷酸酶纯度较高，杂质较少)，用分子量1000的透析袋进行透析8小时得到高浓度5'-核苷酸酶液体。2.根据权利要求1所述的一种猪肝中提取5核苷酸酶方法，其特征在于，所述s4中白蛋白酶浓度为2ku/l。3.根据权利要求1所述的一种猪肝中提取5核苷酸酶方法，其特征在于，所述s5中凝血酶浓度为1ku/l。

技术总结
本发明公开了一种猪肝中提取5核苷酸酶方法，包括以下步骤，取新鲜猪肝，用5份水捣碎，用纱布过滤，再用4微米的过滤膜过滤，用生化分析仪和相应诊断试剂检测酶粗液中的肌酸激酶和5'-核苷酸酶的含量，记录第二点的吸光度加入50克每升的高岭土吸附酶粗液的大颗粒，过滤，加入蛋白酶，37℃恒温放置48小时，过滤去除上面漂浮物，加入凝血酶37℃恒温放置48小时，过滤去除沉淀物得到酶精液。本发明提出的5核苷酸酶提取方法，建立了非临床基质5'-核苷酸酶校准品、质控品的制备方法和评价方案，解决了5'-核苷酸酶测定试剂盒临床生化检验过程中系统定标准确性、临床检测过程内部质量控制及生化试剂长期稳定性考察的问题，低成本、高性能。高性能。高性能。


技术研发人员：王素玉 王丽 邹志良 王煌煌
受保护的技术使用者：河北艾欧路生物科技有限责任公司
技术研发日：2022.05.30
技术公布日：2022/12/5