一种转氨酶及使用其进行催化制备的方法与流程

id no:2或seq id no:3所示的氨基酸序列；
12.r1、r2、r3、r4和r5分别独立地为h、卤素、c1‑
c3烷基、c1‑
c3烷氧基或cn。
13.在某一方案中，所述的化合物b里，某些基团的定义可如下所述，其余基团的定义如上任一方案所述：(针对此表述，以下简称在某一方案中)
14.在卤素中，所述的卤素优选氟、氯、溴或碘，更优选氟或氯。
15.在某一方案中：在c1‑
c3烷基中，所述的c1‑
c3烷基优选甲基、乙基、正丙基或异丙基，更优选甲基。
16.在某一方案中：在c1‑
c3烷氧基中，所述的c1‑
c3烷氧基优选甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基，更优选甲氧基。
17.在某一方案中：r1为h、卤素或cn，优选h、氟、氯或cn，更优选h。
18.在某一方案中：r2为h、c1‑
c3烷基或cn，优选h、甲基或cn，更优选h。
19.在某一方案中：r3为h、卤素、c1‑
c3烷氧基或cn，优选h、氟、氯、甲氧基或cn，更优选cn。
20.在某一方案中：r4为h、c1‑
c3烷基或cn，优选h、甲基或cn，更优选h。
21.在某一方案中：r5为h、卤素或cn，优选h、氟、氯或cn，更优选h。
22.在某一方案中：r1和r5为h。
23.在某一方案中：r1、r2、r4和r5为h。
24.在某一方案中：所述的化合物b为如下任一方案：
25.方案一：
26.r1为h、卤素或cn；
27.r2为h、c1‑
c3烷基或cn；
28.r3为h、卤素、c1‑
c3烷氧基或cn；
29.r4为h、c1‑
c3烷基或cn；
30.r5为h、卤素或cn；
31.方案二：
32.r1为h；
33.r2为h、c1‑
c3烷基或cn；
34.r3为h、卤素、c1‑
c3烷氧基或cn；
35.r4为h、c1‑
c3烷基或cn；
36.r5为h；
37.方案三：
38.r1为h；
39.r2为h；
40.r3为h、卤素、c1‑
c3烷氧基或cn；
41.r4为h；
42.r5为h。
43.在某一方案中：所述的化合物b为如下任一化合物：
[0044][0045]
在所述的转氨化反应中，所述的缓冲液可为本领域该类转氨化反应常规的缓冲液，以不影响反应即可，例如为磷酸氢二钠
‑
磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钾
‑
磷酸二氢钾缓冲液、tris
‑
hcl缓冲液或hepes缓冲液。
[0046]
所述的转氨化反应还可进一步包含加酸维持反应体系的ph的步骤，以不影响反应即可，所述的酸例如盐酸、磷酸或硫酸，所述的酸的用量根据氨基供体的量变化，将反应体系的ph维持在7.5
‑
9.0(例如ph8.0)的用量即可。
[0047]
在所述的转氨化反应中，所述的氨基供体可为本领域该类转氨化反应常规的氨基供体，例如nh2c1‑
c6烷基，所述的c1‑
c6烷基例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基或叔丁基，优选异丙基。
[0048]
所述的转氨化反应还可进一步包含助溶剂，所述的助溶剂可为本领域该类转氨化反应常规的助溶剂，例如砜类溶剂，优选二甲基亚砜；所述的化合物b与所述的助溶剂的质量体积比可为0.1g/ml～1.0g/ml，例如0.5g/ml。
[0049]
在所述的转氨化反应中，所述的磷酸吡多醛与所述的化合物b的质量比可为本领域该类转氨化反应常规的比例，例如0.01:1～0.1:1，例如0.01:1或0.02：1。
[0050]
在所述的转氨化反应中，所述的转氨酶与所述的化合物b的质量比可为本领域该类转氨化反应常规的比例，例如0.1:1～1.0:1，例如0.1:1、0.2:1或0.5:1。
[0051]
在所述的转氨化反应中，反应温度可为本领域该类转氨化反应常规的温度，例如30
‑
45℃，例如40℃或45℃。
[0052]
在所述的转氨化反应中，所述的转氨化反应以所述的化合物b消失或不再反应为反应终点，反应时间例如2h～80h，优选4h～39.5h。
[0053]
在所述的转氨化反应中，所述的化合物b与所述的缓冲液中水的质量体积比可为本领域该类转氨化反应常规的比例，例如1.0g/l～80g/l，再例如1.1g/l～54g/l。
[0054]
在所述的转氨化反应中，所述的转氨化反应可包含如下步骤：在缓冲液中，加入所述的氨基供体和酸调节ph至7.5
‑
9.0(例如ph8.0)，所述的化合物b溶于助溶剂中加入，再加入所述的转氨酶和磷酸吡多醛进行所述的转氨化反应即可。所述的酸和所述的助溶剂如上所述。
[0055]
所述的转氨化反应结束后，还可包含后处理，所述的后处理优选包含如下步骤：加碱，调节ph至11～13，分层后，水相用甲基四氢呋喃萃取，分离有机相并浓缩至干，得所述的化合物c即可。
[0056]
本发明还提供了一种转氨酶，所述的转氨酶为源自玫瑰杆菌(ruegeria pomeroyi)转氨酶的突变体，其具有如seq id no:2或seq id no:3所示的氨基酸序列。
[0057]
本发明还提供了一种转氨酶在制备化合物c和/或化合物e中的应用，所述的转氨酶具有如seq id no:2或seq id no:3所示的氨基酸序列；
[0058][0059]
r1、r2、r3、r4和r5的定义如上所述；
[0060]
化合物c优选化合物e优选
[0061]
在所述的化合物c的制备方法中，当化合物b为时：
[0062]
所述的化合物b由溴苯乙酮(化合物a)进行如下所述的氰基化反应即得；
[0063][0064]
所述的氰基化反应优选包含如下步骤：
[0065]
在[pd(c3h5)cl]2、三苯基膦、溶剂和氰基化试剂存在的条件下，将对溴苯乙酮(化合物a)进行所述的氰基化反应得化合物b即可。
[0066]
在所述的氰基化反应中，所述的氰基化试剂可为本领域该类氰基化反应常规的试剂，例如k4[fe(cn)6]。
[0067]
在所述的氰基化反应中，所述的溶剂可为本领域该类氰基化反应常规的溶剂，例如酰胺类溶剂和/或水，所述的酰胺类溶剂例如二甲基乙酰。
[0068]
在所述的氰基化反应中，所述的[pd(c3h5)cl]2与所述的化合物a的摩尔比可为本领域该类氰基化反应常规的比例，例如0.001:1～0.01:1，再例如0.005:1～0.01:1。
[0069]
在所述的氰基化反应中，所述的三苯基膦与所述的化合物a的摩尔比可为本领域该类氰基化反应常规的比例，例如0.01:1～0.1:1，再例如0.02:1～0.03:1。
[0070]
在所述的氰基化反应中，所述的氰基化试剂与所述的化合物a的摩尔比可为本领域该类氰基化反应常规的比例，例如0.4:1～1:1，再例如0.5:1。
[0071]
在所述的氰基化反应中，所述的化合物a在所述的溶剂中的浓度可为本领域该类氰基化反应常规的浓度，例如0.1mol/l～1mol/l，再例如0.2mol/l～0.5mol/l。
[0072]
在所述的氰基化反应中，反应温度可为本领域该类氰基化反应常规的温度，例如60℃～95℃，再例如85℃～95℃。
[0073]
在所述的氰基化反应中，所述的氰基化反应的反应进程以所述的化合物a消失或不再反应为反应终点，反应时间例如15h～40h，再例如18h～25h。
[0074]
本发明还提供了一种s
‑4‑
(1
‑
氨基乙基)苯甲酸(化合物d)的制备方法，其包括如下步骤：
[0075]
当化合物c为时：
[0076]
将化合物c进行如下所示的水解反应得s
‑4‑
(1
‑
氨基乙基)苯甲酸(化合物d)即得；
[0077][0078]
所述的化合物c的制备方法如上所述；
[0079]
所述的水解反应优选包含如下步骤：
[0080]
在ph＝6.5
‑
8.0的缓冲液中，在氰基水解酶存在下，将化合物c进行所述的水解反应得s
‑4‑
(1
‑
氨基乙基)苯甲酸(化合物d)即可；
[0081]
所述氰基水解酶为瘤状类伯克霍尔德菌(paraburkholderia phymatum)的氰基水解酶，具有如seq id no:4所示的氨基酸序列。
[0082]
在所述的水解反应中，所述的缓冲液可为本领域该类水解反应常规的缓冲液，以不影响反应即可，例如为磷酸氢二钠
‑
磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钾
‑
磷酸二氢钾缓冲液、tris
‑
hcl缓冲液或hepes缓冲液。
[0083]
在所述的水解反应中，所述的氰基水解酶与所述的化合物c的质量比可为本领域该类水解反应常规的比例，例如0.05：1～0.3:1，再例如0.08:1～0.1:1。
[0084]
在所述的水解反应中，所述的化合物c与所述的缓冲液中水的质量体积比可为本领域该类水解反应常规的比例，例如0.1g/l～1.0g/l，再例如0.6g/l～1.0g/l。
[0085]
所述的水解反应还可进一步包含助溶剂，所述的助溶剂可为本领域常规该类水解反应常规的助溶剂，例如砜类溶剂，再例如二甲基亚砜；所述的化合物c与所述的助溶剂的质量体积比可为0.5g/ml～2.0g/ml，例如1.2g/ml～1.5g/ml。
[0086]
所述的水解反应还可进一步包含加酸维持反应体系的ph的步骤，以不影响反应即可，所述的酸例如盐酸、磷酸或硫酸，所述的酸的用量根据化合物的量变化，将反应体系的ph维持在6.5
‑
8.0的用量即可。
[0087]
在所述的水解反应中，反应温度可为本领域该类水解反应常规的温度，例如10℃～40℃，再例如25℃～30℃。
[0088]
在所述的水解反应中，所述的水解反应以所述的化合物c消失或不再反应为反应终点，反应时间例如20～40小时，再例如23～30小时。
[0089]
所述的水解反应中，所述的水解反应可包含如下步骤：在缓冲液中，加入溶于助溶剂的化合物c，加酸调节ph至6.5
‑
8.0，再加入氰基水解酶进行水解反应，得所述的化合物d
即可。
[0090]
本发明的合成工艺路线如下：
[0091][0092]
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0093]
本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0094]
本发明的积极进步效果在于：本发明提供了一种新的转氨酶，以本技术中的转氨酶催化的转氨化反应与现有的转氨酶催化的转氨化反应相比，选择性高、原料转化率高、收率高且产物手性纯度高。此外，本发明还提供了一种s
‑4‑
(1
‑
氨基乙基)苯甲酸的制备方法，反应采用酶催化转化方法，选择性高，反应条件温和，避免大量有机试剂的使用，产品转化率较高，保证其工业化放大的可行性。
附图说明
[0095]
图1为实施例2中转氨酶1(seq id no:1)的反应结束后反应液的高效液相色谱图。
[0096]
图2为实施例2中转氨酶1(seq id no:1)的手性纯度图。
[0097]
图3为实施例2中转氨酶2(seq id no:2)的反应结束后反应液的高效液相色谱图。
[0098]
图4为实施例2中转氨酶2(seq id no:2)的手性纯度图。
[0099]
图5为实施例3中转氨酶2(seq id no:2)的反应结束后反应液的高效液相色谱图。
[0100]
图6为实施例3中转氨酶3(seq id no:3)的反应结束后反应液的高效液相色谱图
[0101]
图7为实施例4中反应结束后反应液的高效液相色谱图
[0102]
图8为实施例5中反应结束后反应液的高效液相色谱图
[0103]
图9为实施例5中反应结束后产品的质谱图
具体实施方式
[0104]
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0105]
实施例1
[0106]
以溴苯乙酮为原料制备4
‑
氰基苯乙酮
[0107]
在700μl反应瓶中，加入0.0457mg(0.125μmol,0.005eq.)金属钯催化剂例如[pd(c3h5)cl]2，含0.1311mg(0.5μmol,0.02eq.)三苯基膦的50μl(10vol.)二甲基乙酰胺溶液，再加入含有4.98mg(25μmol,1.0eq.)对溴苯乙酮的50μl(10vol.)二甲基乙酰胺溶液,含有5.28mg k4[fe(cn)6]
·
3h2o的30μl水溶液，调整并控制反应体系温度85
‑
95℃，连续搅拌18小时。检测结果显示，该反应的过程转化率为100％。
[0108]
实施例2
[0109]
全人工合成seq id no:1～3转氨酶并将其用于以下实验。
[0110]
比较转氨酶2(seq id no:2)与转氨酶1(seq id no:1)催化4
‑
氰基苯乙酮合成s
‑4‑
氰基苯基乙胺
[0111]
将磷酸二氢钾(2.55g)、三水合磷酸氢二钾(6.3g)，472ml异丙胺，210ml 85％磷酸溶于900ml去离子水中，配制备成含有氨基供体的缓冲液(ph 8.0)。取2个50ml夹套瓶a、b，分别加入30ml上述缓冲液。分别加入20mg磷酸吡哆醛，搅拌溶清。再向a瓶加入0.5g转氨酶1(具有seq id no:1的氨基酸序列)，向b中加入0.5g转氨酶2(具有seq id no:2的氨基酸序列)，分别搅拌溶解。然后分别取1.0g 4
‑
氰基苯乙酮溶解于2ml dmso中，转移至a和b中，45℃反应4h。反应结束后，取200μl反应液，溶于1ml甲醇。过滤后，进行液相色谱检测(转化率)和sfc检测(手性纯度)。结果显示，突变体转氨酶2转化率为100％(详见图3)，手性纯度100％(详见图4，异构体出峰位置：2.4min，氰基苯乙酮出峰位置：1.4min)，野性型转氨酶1转化率为75.5％(详见图1)，手性纯度100％(详见图2)。由此表明，本专利报道的转氨酶2明显优于文献报道的野生型转氨酶1。本技术中的高效液相色谱图和手性纯度图均以标准品为对照。
[0112]
实施例3
[0113]
比较转氨酶2(seq id no:2)与转氨酶3(seq id no:3)催化4
‑
氰基苯乙酮合成s
‑4‑
氰基苯基乙胺
[0114]
将磷酸二氢钾(2.55g)、三水合磷酸氢二钾(6.3g)，472ml异丙胺，210ml 85％磷酸溶于900ml去离子水中，配制备成含有氨基供体的缓冲液(ph 8.0)。取2个50ml夹套瓶a、b，分别加入30ml上述缓冲液。分别加入20mg磷酸吡哆醛，搅拌溶清。再向a瓶加入0.5g转氨酶2(具有seq id no:2的氨基酸序列)，向b中加入0.2g转氨酶3(具有seq id no:3的氨基酸序列)，分别搅拌溶解。然后分别取1.0g 4
‑
氰基苯乙酮溶解于2ml dmso中，转移至a和b中，45℃反应4h。反应结束后，取200μl反应液，溶于1ml甲醇。过滤后，进行液相色谱检测。结果显示，转氨酶2转化率为97.7％(详见图5)，转氨酶3转化率为96.7％(详见图6)。由此表明，本专利报道的转氨酶3和转氨酶2具有接近的酶催化效果，且优于野生型转氨酶1。
[0115]
实施例4
[0116]
转氨酶2(seq id no:2)催化4
‑
氰基苯乙酮合成s
‑4‑
氰基苯基乙胺工艺放大
[0117]
将磷酸二氢钾(2.55g)、三水合磷酸氢二钾(6.3g)，472ml异丙胺，210ml 85％磷酸溶于900ml去离子水中，配制备成含有氨基供体的缓冲液(ph 8.0)。将4
‑
氰基苯乙酮(50g)溶于二甲亚砜(100ml)后，与500mg的磷酸吡多醛，5g转氨酶2(具有seq id no:2的氨基酸序列)一起加入到上述配置的缓冲液中。将混合后的反应体系置于40℃的水浴中反应39.5h。反应结束后，取200μl反应液，溶于1ml甲醇。过滤后，进行液相色谱检测。底物转化率高效液相色谱测定方法如下：色谱柱chiralpak ig
‑
3(250*4.6mm,3μm)，结果显示，转氨酶催化步骤中4
‑
氰基苯乙酮转化率为96.1％，产品手性纯度100％。流动相a：0.05％三氟乙酸水溶液，流动相b：0.05％三氟乙酸乙腈溶液,检测波长230nm，测试结果见图7，s
‑4‑
氰基苯基乙胺的保留时间为1.868min。在反应液中加入150g氢氧化钾，将ph调制12～13。将搅拌均匀的反应液，静止1～2小时后，反应液分为两层。将下层水相与2
‑
甲基四氢呋喃(300ml)混匀后，用硅藻土过滤。过滤后的溶液也静止1～2小时，之后再用2
‑
甲基四氢呋喃(300ml)萃取一次。浓缩有机相，获得63g含20％dmso的s
‑4‑
氰基苯乙胺。
[0118]
实施例5：氰基水解酶(seq id no:4)催化s
‑4‑
氰基苯基乙胺合成s
‑4‑
(1
‑
氨基乙基)苯甲酸
[0119]
全人工合成seq id no:4氰基水解酶并将其用于以下实验。
[0120]
将磷酸二氢钠(2.54g)、磷酸氢二钠(57.6g)溶于2l去离子水中，配制备成ph8.0的缓冲液。将上一步获得的含20％dmso的s
‑4‑
氰基苯基乙胺(1.2g)溶于二甲亚砜(1ml)后，溶解于50ml缓冲液，用2m盐酸将溶液的ph调至8.0。然后加入0.1g氰基水解酶(具有seq id no:4的氨基酸序列)，将混合后的反应体系置于30℃的水浴中反应23h。反应结束后，取200μl反应液，溶于1ml甲醇。过滤后，进行液相色谱检测。结果显示，氰基水解酶催化步骤中s
‑4‑
氰基苯基乙胺转化率为98.3％(详见图8)，其质谱图详见图9，[m h]

＝165.8。底物转化率高效液相色谱测定方法如下：色谱柱xbridge@c18(150*4.6mm,3.5um)，流动相a：0.05％三氟乙酸水溶液，流动相b：0.05％三氟乙酸乙腈溶液，检测波长230nm，测试结果见图6，s
‑4‑
(1
‑
氨基乙基)苯甲酸的保留时间为2.226min。
[0121]
本技术中seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3和seq id no:4的序列如下所示：
[0122]
seq id no:1(转氨酶1)
[0123]
mslatitnhmptaelqaldaahhlhpfsannalgeegtrvitrargvwlndsegeeildamaglwcvnigygrdelaevaarqmrelpyyntffktthvpaialaqklaelapgdlnhvffagggseandtnirmvrtywqnkgqpektviisrknayhgstvassalggmagmhaqsglipdvhhinqpnwwaeggdmdpeefglarareleeailelgenrvaafiaepvqgaggvivapdsywpeiqricdkydilliadevicgfgrtgnwfgtqtmgirphimtiakglssgyapiggsivcdevahvigkdefnhgytysghpvaaavalenlrileeenildhvrnvaapylkekwealtdhplvgeakivgmmasialtpnkasrakfasepgtigyicrercfannlimrhvgdrmiispplvitpaeidemfvrirksldeaqaeiekqglmkseghhhhhh
[0124]
seq id no:2(转氨酶2)
[0125]
mslatitnhmptaelqaldaahhlhpfsannalgeegtrvitrargvwlndsegeeildamaglfcvnigygrdelaevaarqmrelpyyntffktthvpaialaqklaelapgdlnhvffagggseandtnirmvrtywqnkgqpektviisrknayhgstvassalggmagmhaqsglipdvhhinqpnwwaeggdmdpeefglarareleeailelgenrvaafiaepvqgaggvivapdsywpeiqricdkydilliadevicgfgrtgnwfgtqtmgirphimtiakglssgyapiggsivcdevahvigkdefnhgytysghpvaaavalenlrileeenildhvrnvaapylkekwealtdhplvgeakivgmmasialtpnkasrakfasepgtigyicrercfannlimrhvgdrmiispplvitpaeidemfvrirksldeaqaeiekqglmkseghhhhhh
[0126]
seq id no:3(转氨酶3)
[0127]
mslatitnhmptaelqaldaahhlhpfsannalgeegtrvitrargvwlndsegeeildamaglmcvnigygrdelaevaarqmrelpyyntffktthvpaialaqklaelapgdlnhvffagggseandtnirmvrtywqnkgqpektviisrknayhgstvassalggmagmhaqsglipdvhhinqpnwwaeggdmdpeefglarareleeailelgenrvaafiaepvqgaggvivapdsywpeiqricdkydilliadevicgfgrtgnwfgtqtmgirphimtiakglssgyapiggsivcdevahvigkdefnhgytysghpvaaavalenlrileeenildhvrnvaapylkekwealtdhplvgeakivgmmasialtpnkasrakfasepgtigyicrercfannlimrhvgdrmiispplvitpaeidemfvrirksldeaqaeiekqglmkseghhhhhh
[0128]
seq id no:4(nit，氰基水解酶)
[0129]
msdqrviraaavqiapdferpggtldrvcaaideaaskgvqlivfpetfvpyypyfsfvrppvasgadhmrlyeqavvvpgpvthavserarrhamvvvlgvnerdhgslyntqlvfdidgcqvlkrrkitptfhermiwgqgdaaglkvartgiarvgalacwehynplaryalmtqheeihcsqfpgslvgpifaeqievtirhhalesgcfvvnstgwlsdaqiesvttdpklqkalrggcmtaivspegqhlaeplregegmvvadldmalitkrkrmmdsvghyarpellslaindrpampvvpmsmsferagadvapeiisggqdecqhepvag
[0130]
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。