一种从Raffaelealauricola中提取藿烷型三萜类化合物的方法

一种从raffaelea lauricola中提取藿烷型三萜类化合物的方法
技术领域
1.本发明涉及一种从raffaelea lauricola中提取藿烷型三萜类化合物的方法。


背景技术：

2.raffaelea lauricola是食菌小蠹（ambrosia beetle）所携带的高致病性伴生真菌，该病原真菌可致使树木枯萎，各国学者长期致力于其致病机理的研究，随着研究的不断深入，在该属其他物种中已分离获得一些抑制植物生长、抗菌等活性物质，这彰显出该菌在生物农药或医药上有极大应用前景。
3.a'-neogammacerane-15α,22-diol是藿烷型三萜类物质，而藿烷型三萜类物质大多有抗肿瘤、抗炎和抗菌等活性。可借助修饰a'-neogammacerane-15α,22-diol的结构进而获得多种新的活性物质。目前，尚未见在raffaelea lauricola中分离出a'-neogammacerane-15α,22-diol的报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是公开一种从raffaelea lauricola中提取藿烷型三萜类化合物的方法，以促进其进一步在医药领域的研究和开发，为人类造福。
5.本发明采取的技术方案如下：一种从raffaelea lauricola中提取藿烷型三萜类化合物的方法，包括以下步骤：1）将raffaelea lauricola活化后，取菌块接种到pdb 培养基中，在160～180r/min、20~28℃条件下连续培养5~10天，按15wt%~20wt%接种量转接到改良的大米培养基中，继续在20～28℃条件下静置培养28～40天，得到菌丝体；2）将步骤1）得到的菌丝体在35~40℃下干燥后研磨成粉状，用1~2倍体积的乙酸乙酯浸泡12~24小时，超声40~60分钟，收集萃取液，残渣中再加入菌丝体1~2倍体积的乙酸乙酯，超声40~60分钟，收集萃取液，重复以上步骤，共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏；3）将浸膏用氯仿或二氯甲烷溶解，然后用反相硅胶c
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进行拌样，干法装柱，以甲醇：水自体积比1:9
→
9:1梯度洗脱，收集甲醇：水体积比为9:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得组分a；4）用1倍体积的氯仿溶解组分a，过200-300目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比为30:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得浸膏，再过200-300目硅胶柱，以石油醚：氯仿体积比为8:1开始梯度洗脱，收集石油醚:氯仿体积比为4:1部分洗脱液，再过200-300目硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯体积比为20:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为6:1部分洗脱液，旋蒸得到白色粉末状藿烷型三萜类化合物a'-neogammacerane-15α,22-diol，结构如下所示：
。
6.进一步地，所述步骤1）中改良的大米培养基：大米100g，木屑10g，加入纯水120 ml，121℃高压灭菌20min备用。
7.进一步地，所述步骤1）中接种菌块的大小为0.5
×
0.5cm，接种量为4 块。
8.进一步地，所述步骤2）中超声的功率为400 w，频率为35 khz。
9.进一步地，所述步骤3）中使用的反相硅胶c
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粒径40-60μm，孔径120
å
。
10.进一步地，所述步骤3）中梯度洗脱比例为甲醇：水体积比1:9, 2:8,3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2,9:1。
11.进一步地，所述步骤4）中梯度洗脱比例为石油醚：乙酸乙酯体积比30:1,20:1,10:1,8:1,6:1，石油醚：氯仿体积比8:1,6:1,4:1。
12.本发明的显著优点：（1）分离纯化简单，成本低；（2）过程简便，易操作；（3）制得的化合物纯度高，且重复性好。
附图说明
13.图1为a'-neogammacerane-15α,22-diol化合物的1h nmr谱（cdcl3）；图2为a'-neogammacerane-15α,22-diol化合物的
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c nmr谱（cdcl3）；图3为a'-neogammacerane-15α,22-diol化合物的dept135谱（cdcl3）；图4为a'-neogammacerane-15α,22-diol化合物的cosy谱（cdcl3）；图5为a'-neogammacerane-15α,22-diol化合物的hmbc谱（cdcl3）；图6为a'-neogammacerane-15α,22-diol化合物的hsqc谱（cdcl3）。
具体实施方式
14.为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，作详细说明。本发明的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。
15.本发明所使用的raffaelea lauricola菌株编号为hulcr7161。
16.实施例11)取raffaelea lauricola为材料，无菌条件下挑取大小为0.5
×
0.5cm的菌块4块接种到pdb培养基（马铃薯葡萄糖粉3.9g,纯水100 ml，装入250ml锥形瓶，在121℃高压下灭菌20min）中，在160r/min、25℃条件下连续培养7天即初级培养，按10wt%接种量转接到改良的大米培养基（大米100g,木屑10g,加入纯水120 ml，121℃高压灭菌20min）中，继续在25℃条件下静置培养35天即次级培养。
17.2)收集培养35天后得到的菌丝体在室温下干燥之后研磨粉碎，加1倍体积的乙酸
乙酯浸泡12小时，超声40分钟，过滤得萃取液，残渣中再加入菌丝体1倍体积的乙酸乙酯，超声40分钟，收集萃取液，再次重复上述步骤，共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏。
18.3)将浸膏溶解于氯仿，使用40-60μm粒径反相c
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硅胶拌样，干法装柱，以甲醇：水自1:9体积比开始梯度洗脱（甲醇：水体积比为1:9, 2:8,3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2,9:1），收集甲醇：水体积比为9:1部分旋蒸得粗品。
19.4)用1倍体积的氯仿溶解粗品，上200-300目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比30:1开始梯度洗脱（梯度洗脱比例为30:1,20:1,10:1），收集石油醚：乙酸乙酯体积比10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得浸膏，再过200-300目硅胶柱，以石油醚：氯仿体积比为8:1开始梯度洗脱（梯度洗脱比例为8:1,6:1,4:1），收集石油醚:氯仿体积比4:1部分洗脱液，再过200-300目硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯体积比为20:1开始梯度洗脱（梯度洗脱比例为20:1,10:1,8:1,6:1），收集石油醚：乙酸乙酯体积比为6:1部分洗脱液，旋蒸得到白色粉末状藿烷型三萜类化合物。
20.经计算其提取率为1.320%（提取率%=重量/菌丝体浸膏总量
×
100%）。
21.本实施例中，步骤2）中超声的功率为400 w，频率为35 khz。
22.实施例21）取raffaelea lauricola（本实验室保存菌株）为材料，无菌条件下挑取大小为0.5
×
0.5cm的菌块4块接种到pdb培养基（马铃薯葡萄糖粉3.9g,纯水100 ml,装入250 ml锥形瓶，在121℃高压下灭菌20min）中，在140r/min、20℃条件下连续培养5天即初级培养，按20wt%接种量转接到改良的大米培养基（大米100g,木屑10g,加入纯水120 ml，121℃高压灭菌，20min）中，继续在20℃条件下静置培养25天即次级培养。
23.2) 收集培养25天菌丝体在室温下干燥之后研磨粉碎，加1倍体积的乙酸乙酯浸泡12小时，超声40分钟，过滤得萃取液，残渣中再加入菌丝体1倍体积的乙酸乙酯，超声40分钟，收集萃取液，再次重复上述步骤，共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏。
24.3) 将浸膏溶解于氯仿，使用40-60μm粒径反相c
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硅胶拌样，干法装柱，以甲醇：水自1:9体积比开始梯度洗脱（甲醇：水比例为1:9, 2:8,3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2,9:1），收集甲醇：水体积比为9:1部分旋蒸得粗品。
25.4) 用1倍体积的氯仿溶解粗品，上200-300目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比为30:1开始梯度洗脱（梯度洗脱比例为30:1,20:1,10:1），收集石油醚：乙酸乙酯体积比10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得浸膏，再过200-300目硅胶柱，以石油醚：氯仿体积比为8:1开始梯度洗脱（梯度洗脱比例为8:1,6:1,4:1），收集石油醚:氯仿体积比4:1部分洗脱液，再过200-300目硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯体积比为20:1开始梯度洗脱（梯度洗脱比例为20:1,10:1,8:1,6:1），收集石油醚：乙酸乙酯体积比为6:1部分洗脱液，旋蒸得到白色粉末状藿烷型三萜类化合物。
26.经计算其提取率为1.246%（提取率%=重量/菌丝体浸膏总量
×
100%）。
27.本实施例中，步骤2）中超声的功率为400 w，频率为35 khz。
28.实施例31）取raffaelea lauricola（本实验室保存菌株）为材料，无菌条件下挑取大小为0.5
×
0.5cm的菌块4块接种到pdb培养基（马铃薯葡萄糖粉3.9g,纯水100 ml,装入250 ml锥形瓶，在121℃高压下灭菌20min）中，在180r/min、28℃条件下连续培养10天即初级培养，按
25wt%接种量转接到改良的大米培养基（大米100g,木屑10g,加入纯水120 ml，121℃高压灭菌，20min）中，继续在28℃条件下静置培养40天即次级培养。
29.2) 收集培养40天菌丝体在室温下干燥之后研磨粉碎，加1倍体积的乙酸乙酯浸泡12小时，超声90分钟，过滤得萃取液，残渣中再加入菌丝体1倍体积的乙酸乙酯，超声90分钟，收集萃取液，再次重复上述步骤，共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏。
30.3) 将浸膏溶解于氯仿，使用40-60μm粒径反相c
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硅胶拌样，干法装柱，以甲醇：水自1:9体积比开始梯度洗脱（甲醇：水比例为1:9, 2:8,3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2,9:1），收集甲醇：水体积比为9:1部分旋蒸得粗品。
31.4) 用1倍体积的氯仿溶解粗品，上200-300目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比为30:1开始梯度洗脱（梯度洗脱比例为30:1,20:1,10:1），收集石油醚：乙酸乙酯体积比10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得浸膏，再过200-300目硅胶柱，以石油醚：氯仿体积比为8:1开始梯度洗脱（梯度洗脱比例为8:1,6:1,4:1），收集石油醚：氯仿体积比4:1部分洗脱液，再过200-300目硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯体积比为20:1开始梯度洗脱（梯度洗脱比例为20:1,10:1,8:1,6:1），收集石油醚：乙酸乙酯体积比为6:1部分洗脱液，旋蒸得到白色粉末状藿烷型三萜类化合物。
32.经计算其提取率为1.298%（提取率%=重量/菌丝体浸膏总量
×
100%）。
33.本实施例中，步骤2）中超声的功率为400 w，频率为35 khz。
34.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。