多谱系肝类器官模型及基于该模型的药物肝毒评价方法与流程

1.本发明涉及干细胞生物学及再生医学领域，尤其是涉及一种多谱系肝类器官模型及基于该模型的药物肝毒评价方法。


背景技术：

2.药物性肝损伤（drug induced liver injury，dili）是临床试验失败和药物上架后被召回的重要原因，而在临床前研究中对候选药做出准确的安全性评价是降低该风险的关键。针对dili的评估，目前使用的工具包括2d/3d细胞模型与动物模型。其中，尽管基于人原代肝细胞的2d/3d模型仍作为体外药毒评价的“金标准”，但其不仅存在来源稀缺、体外存活时间短等问题，更重要的是，其仅能体现肝细胞自身的药毒反应，而非全肝。另一方面，虽然动物模型具备了完整的肝脏与循环系统，但由于物种差异，由其产生的数据往往与临床结果差异较大，难以反映人体的真实情况。倘若存在一个人源化的体外模型能够精准地识别dili，将填补当下2d/3d细胞模型与动物模型之间的沟壑，提升临床试验的成功率。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明旨在提出一种多谱系肝类器官模型及基于该模型的药物肝毒评价方法，基于该模型，其在肝毒药物处理后，可有效检出ast、alt等肝损指标，且比原代肝细胞具备更高的预测灵敏度，能够准确区分结构类似药物的肝脏毒性，以及准确地识别出譬如胆汁淤积毒性、线粒体毒性等特异质肝毒，降低未知风险，提高药物开发的成功率。
4.为达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种多谱系肝类器官模型，该模型由如下方法构建而成：s1、使用含有gdf8的培养基诱导hpsc分化形成定形内胚层；s2、使用含有nog、fgf4的培养基诱导定形内胚层分化为前肠管衍生物；s3、肝脏相关的多谱系特化阶段一：使用含有前期分化组合物的培养基培养前肠管衍生物；s4、肝脏相关的多谱系特化阶段二：使用含有后期分化组合物的培养基继续培养，得到匀质且尺寸均一的多谱系肝类器官；s5、肝类器官成熟：使用含有egm-2的培养基实现多谱系肝类器官模型的成熟化。
5.进一步，gdf8的使用浓度为50-200ng/ml，nog的使用浓度为50-200ng/ml，fgf4的使用浓度为250-1000ng/ml。
6.进一步，前期分化组合物包括1-5μm的repsox、10-50mm的nic、20-100ng/ml的vegf、20-100ng/ml的fgf2、50-200ng/ml的wnt3a、20-100ng/ml的egf；后期分化组合物包括2-10μm的atra、10-50mm的nic、10-50μm的lca。
7.进一步，s5阶段中，培养基中还添加0.1-0.4μm的dihexa、10-50μm的mk4、2-10μm的tgfβ抑制剂、0.1-0.5mm的pka激活剂、0.1-0.5μm的mk125，培养基中包括体积比为10%-25%的egm-2培养基。
8.本发明还提出了基于上述所述的多谱系肝类器官模型的药物肝毒评价方法，该方法包括如下步骤：1）对类器官进行质检；2）选取临床药物，用选择的药物对多谱系肝类器官模型进行处理并定义为药物处理组，同时设置对照组进行对照；3）选择评价指标，获取药物处理组和对照组的各评价指标的结果，并对结果进行分析评价；其中，评价指标包括：细胞活力、肝损伤、胆汁淤积毒性、线粒体毒性。
9.进一步，细胞活力通过检测cyp3a4酶活性值来判断，肝损伤通过检测ast与alt活性值来判断，胆汁淤积毒性通过clf染色判断，线粒体毒性通过tmrm染色和耗氧率判断。
10.进一步，对肝类器官进行肝损伤判断标准为：当对照/药物组ast与alt活性值的统计学差异p≥0.05、p＜0.05、p＜0.01、以及p＜0.001时，分别判定为无肝损伤、轻度肝损伤、中度肝损伤以及重度肝损伤。
11.进一步，对胆汁淤积毒性评价标准为：当对照/药物组荧光强度值的统计学差异p≥0.05、p＜0.05、p＜0.01以及p＜0.001时，分别判定为无胆汁淤积毒性、轻度胆汁淤积毒性、中度胆汁淤积毒性以及重度胆汁淤积毒性。
12.进一步，对线粒体毒性评价标准为：当对照/药物组荧光强度值的统计学差异p≥0.05、p＜0.05、p＜0.01以及p＜0.001时，分别判定为无线粒体毒性、轻度线粒体毒性、中度线粒体毒性以及重度线粒体毒性。
13.进一步，对线粒体毒性评价标准为：当对照/药物组耗氧率的统计学差异p≥0.05、p＜0.05、p＜0.01以及p＜0.001时，分别判定为无线粒体毒性、轻度线粒体毒性、中度线粒体毒性以及重度线粒体毒性。
14.进一步，类器官质检包括类器官谱系构成检测、cyp3a4酶活性与可诱导性检测、药物肝毒识别能力检测以及胆汁分泌能力检测。
15.进一步，类器官谱系构成检测分别使用各谱系特异性标志物一抗以及荧光二抗标记，并在荧光显微镜下检定类器官谱系构成；cyp3a4酶活性与可诱导性检测为分别检测使用诱导剂利福平诱导前后原代肝细胞和肝类器官的cyp3a4酶活性；药物肝毒识别能力检测选取结构类似、但肝毒性不同的药物，分别稀释至不同的浓度并对上述模型进行处理，检测药物处理组和对照组的细胞活力；胆汁分泌能力检测使用总胆汁酸tba分析试剂盒，按照操作说明书检测胆汁分泌能力。
16.进一步，类器官质检的标准为：1）类器官谱系构成检测：各标志物表达模式正确的前提下，证实其至少包含alb

肝细胞、sox9

胆管细胞、cd68

肝巨噬细胞、vim

肝星状细胞以及lyve1

肝血窦内皮细胞；2）cyp3a4酶活性与可诱导性检测：诱导前后cyp3a4活性值的统计学差异p＜0.05，证明可被显著诱导；在此基础上，诱导倍数不低于原代肝细胞的1/3，则视为过检；
3）药物肝毒识别能力检测任何药物浓度下，存在组间统计学差异p＜0.05，证明在该药物浓度下类器官可区分肝毒性不同的结构类似物；在此基础上，随药物浓度增加，组间细胞活力差值呈现增加趋势，则视为过检；4）胆汁分泌能力检测类器官的胆汁分泌量不低于原代肝细胞的1/3，即6.5μm/ml/106细胞/24h，视为过检。
17.相对于现有技术，本发明所述的基于多谱系肝类器官的药物肝毒评价方法具有以下优势：1）人源化，较动物模型可规避由物种差异引发的预测偏差；2）高敏感度，可有效检出ast、alt等肝损指标，且比原代肝细胞具备更高的预测灵敏度；3）可区分结构类似的肝毒/非肝毒药物；4）可精确识别特异质肝毒，如胆汁淤积毒性与线粒体毒性。
附图说明
18.构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：图1为day18肝类器官形态学鉴定结果；图2为免疫荧光下的谱系鉴定结果；（a）为alb

肝细胞，（b）为sox9

胆细胞，（c）为lyve1

肝内皮细胞，（d）为vim

肝星状细胞，（e）为cd68

库否细胞；图3为本方法和对比方法在不同分化阶段血管内皮细胞标志物pecam1的mrna表达情况；技术重复=2；生物学重复n=3；本方法指本专利采用的方法；对比方法指前期研究之方法；**，p＜0.01；**，p＜0.001；图4为本方法和对比方法在不同分化阶段肝血窦内皮标志物icam1的mrna表达情况；技术重复=2；生物学重复n=3；本方法指本专利采用的方法；对比方法指前期研究之方法；**，p＜0.01；**，p＜0.001；图5为s5阶段不同组合物下肝血窦内皮细胞标志物lyve1的mrna表达情况；技术重复=2；生物学重复n=3；p＜0.001；图6为s5阶段不同组合物下肝细胞标志物alb的mrna表达情况；技术重复=2；生物学重复n=3；p＜0.001；图7为s5阶段是否使用egm2培养基对lyve1的mrna表达水平的影响；技术重复=2；生物学重复n=3；p＜0.001；图8为原代肝细胞和肝类器官的cyp3a4酶活性检测结果；图9为原代肝细胞和肝类器官经诱导剂利福平处理后的可诱导性检测结果；dmso，二甲基亚砜；***，p＜0.001；技术重复=2；生物学重复n=4；图10为ppar兴奋剂罗格列酮和曲格列酮作用7天后，类器官的细胞活性检测结果；*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001；技术重复=2；生物学重复n=4；图11为喹诺酮类抗生素左氧氟沙星和曲伐沙星作用7天后，类器官的细胞活性检
测结果；*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001；技术重复=2；生物学重复n=4；图12为肝类器官和原代肝细胞经对乙酰氨基酚处理后的药物剂量反应曲线与tc50值；*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001；技术重复=2；生物学重复n=4；（a）为药物剂量反应曲线；（b）为tc50的对比图；图13为肝类器官和原代肝细胞经曲格列酮处理后的药物剂量反应曲线与tc50值；*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001；技术重复=2；生物学重复n=4；（a）为药物剂量反应曲线；（b）为tc50的对比图；图14为肝类器官和原代肝细胞经环孢菌素a处理后的药物剂量反应曲线与tc50值；*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001；技术重复=2；生物学重复n=4；（a）为药物剂量反应曲线；（b）为tc50的对比图；图15为肝类器官经对乙酰氨基酚与曲格列酮处理后的ast活性检测结果；ast，谷草转氨酶；dmso，二甲基亚砜；*，p＜0.05；**，p＜0.01；技术重复=2；生物学重复n=4；图16为肝类器官经对乙酰氨基酚与曲格列酮处理后的alt活性检测结果；alt，丙氨酸氨基转移酶；dmso，二甲基亚砜；*，p＜0.05；**，p＜0.01；技术重复=2；生物学重复n=4；图17为经对乙酰氨基酚处理96h后培养基中ast活性检测结果；ast，谷草转氨酶；dmso，二甲基亚砜；方法1，前专利方法；方法2，本专利方法；*，p＜0.05；**，p＜0.01；技术重复=2；生物学重复n=4；图18为用cdfda表征多谱系肝类器官中胆小管分布的免疫荧光图；图19为多谱系肝类器官中总胆汁酸的产生量；技术重复=2；生物学重复n=4；图20中（a）和（b）分别为曲格列酮和环孢菌素a作用72h后肝类器官的形态图；图21为曲格列酮和环孢菌素a作用72h后的细胞活力对比图；图22中（a）、（b）和（c）分别为对照组、曲格列酮组以及环孢菌素a组药物作用72h后的clf荧光图；图23为荧光强度定量统计图；**，p＜0.01；***，p＜0.001；技术重复=2；生物学重复n=4；图24中（a）、（b）和（c）分别为对照组、曲格列酮组以及环孢菌素a组药物作用72h后的tmrm荧光图；图25为荧光强度定量统计图；**，p＜0.01；***，p＜0.001；技术重复=2；生物学重复n=4；图26为对照组、曲格列酮组相应的耗氧率曲线图；***，p＜0.001；技术重复=2；生物学重复n=4；图27为对照组、环孢菌素a组相应的耗氧率曲线图；***，p＜0.001；技术重复=2；生物学重复n=4；图28为方法1和方法2 besp mrna表达水平比较，技术重复n=3；生物学重复n=3；方法1为前专利方法；方法2为本专利方法；图29为方法1和方法2胆汁酸转运泵ntcp mrna的表达水平比较；技术重复n=3；生物学重复n=3；方法1为前专利方法；方法2为本专利方法；图30为方法1和方法2的多谱系肝类器官中总胆汁酸的产生量；生物学重复n=4；方法1为前专利方法；方法2为本专利方法；
图31为药物作用72h后，肝类器官经过clf染色后对照与药物作用组的荧光强度对比图；生物学重复n=4；**，p＜0.01；***，p＜0.001；方法1为前专利方法；方法2为本专利方法。
具体实施方式
19.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
20.定形内胚层：定型内胚层（definitive endoderm）指胚胎发育早期肝脏、小肠、大肠等内脏器官主要组成细胞的原始发育位点。
21.前肠管衍生物（或肠管前部衍生物）：肠管（gut tube）指胚胎发育早期由定形内胚层发育而来的条形组织。体内研究表明，其前端与后端由不同的祖细胞构成，分别可发育为不同的脏器；其中，肝脏发育自肠管靠近前端的祖细胞群，发育学上称为前肠管或肠管前部。本发明专利中前肠管衍生物（或肠管前部衍生物）指sox2阳性且具备肝系分化潜力的细胞群。
22.多谱系肝前体球：指具备多种细胞类型的、尚未成熟的球形肝类器官。相应地，成熟多谱系肝类器官指具备多谱系的、成熟的球形肝类器官。
23.对乙酰氨基酚：是一种广泛使用的非处方镇痛和解热药，用于治疗轻度至中度疼痛和发烧。对乙酰氨基酚低剂量无害，过量服用时具有直接的肝毒性潜力，可导致急性肝损伤和急性肝功能衰竭死亡。
24.环孢菌素a：是一种钙调神经磷酸酶抑制剂和有效的免疫抑制剂，主要用作实体器官移植后预防细胞排斥的手段。环孢素治疗可能与血清胆红素轻度升高和短暂血清酶升高有关，并且与临床上明显的胆汁淤积性肝损伤有关。
25.曲格列酮：是第一个获准在美国使用的噻唑烷二酮类药物，并于1997年获准用于2型糖尿病，但3年后因使用相关的肝损伤（包括急性肝功能衰竭）频率而被撤回。
26.罗格列酮：是一种胰岛素增敏剂和噻唑烷二酮，适用于治疗2型糖尿病。罗格列酮与罕见的急性肝损伤病例有关。
27.曲伐沙星：是一种广谱抗生素，可通过阻断dna 促旋酶和拓扑异构酶iv的活性来抑制各种细菌中超螺旋dna的展开，因存在肝毒性风险而退出市场。
28.左氧氟沙星：是第三代氟喹诺酮类药物，广泛用于治疗敏感菌引起的轻中度呼吸道和泌尿道感染。左氧氟沙星与罕见的临床明显肝损伤病例有关，其特点是潜伏期短和肝细胞酶升高模式，类似于环丙沙星所描述的情况。
29.clf：是一种荧光素标记的胆汁酸类似物，与胆酸衍生物的细胞结合和摄取特性非常相似，目前用作可视化肝组织内胆汁酸转运的工具。
30.cdfda：用于可视化极化肝细胞中胆汁小管的形成，标记胆小管结构。
31.多谱系肝类器官模型的构建包括如下步骤：s1、使用含有gdf8的培养基诱导hpsc分化形成定形内胚层；s2、使用含有nog、fgf4的培养基诱导定形内胚层分化为前肠管衍生物；s3、肝脏相关的多谱系特化阶段一：使用含有前期分化组合物的培养基培养前肠管衍生物；
s4、肝脏相关的多谱系特化阶段二：使用含有后期分化组合物的培养基继续培养，得到匀质且尺寸均一的多谱系肝类器官；s5、肝类器官成熟：使用含有egm-2的培养基实现多谱系肝类器官的成熟化。
32.具体来说，s1中的培养基包括培养基a和培养基b，培养基a和培养基b中均分化1天，培养基a和培养基b均包括基础培养基和添加组分；培养基a中，基础培养基为含有体积比为2%的ksr的rpmi-1640，添加组分包括gdf8和bmp4，具体来说是rhgdf8和rhbmp4，且rhgdf8的含量可以为50-200ng/ml，优选地可以为100ng/ml；rhbmp4的含量可以为10-50ng/ml，优选地可以为10ng/ml。
33.培养基b中，基础培养基为含有体积比为2%的b27的rpmi-1640，添加组分包括gdf8，具体来说是rhgdf8，且rhgdf8的含量可以为50-200ng/ml，优选地可以为100ng/ml。
34.s2中的培养基为培养基c，包括基础培养基和添加组分，基础培养基包含有体积比2%的ksr、体积比0.5%的its、体积比75%的william's e和体积比22.5%的f12；添加组分包括nog、fgf4和chir99021，具体来说是rhnog、rhfgf4，且rhnog的含量可以为50-200ng/ml，优选地可以为200ng/ml；rhfgf4的含量可以为250-1000ng/ml，更优选地可以为500ng/ml；chir99021含量可以为1-5μm，优选地可以为3μm；且在培养基c中分化2天。
35.s3中的培养基包括培养基d，在培养基d中分化3天，培养基d包括基础培养基和添加组分；培养基d的基础培养基含有体积比2%的ksr、体积比0.5%的its、体积比75%的william's e和体积比22.5%的f12；培养基d中的添加组分为前期分化组合物，前期分化组合物包括1-5μm的repsox、10-50mm的nic、20-100ng/ml的vegf、20-100ng/ml的fgf2、50-200ng/ml的wnt3a、20-100ng/ml的egf；优选地，包括1μm的repsox、10mm的nic、20ng/ml的vegf、20ng/ml的fgf2、50ng/ml的wnt3a、20ng/ml的egf；具体来说，各因子为rhfgf2、rhvegf、rhegf、rhwnt3a；s4中的培养基包括培养基e，在培养基e中分化3天，培养基e包括基础培养基和添加组分；培养基e的基础培养基含有体积比2%的ksr、体积比0.5%的its、体积比75%的william's e和体积比22.5%的f12；培养基e中的添加组分为后期分化组合物，后期分化组合物包括2-10μm的atra、10-50mm的nic、10-50μm的lca；优选地，包括2μm的atra、10mm的nic、10μm的lca。
36.s5中的培养基为培养基f，包括基础培养基和添加组分，基础培养基包括体积比为10%-25%的egm-2培养基，具体的，基础培养基含有体积比2%的ksr、体积比25%的william's e、体积比23%的egm-2和体积比50%的hepatozyme；添加组分包括0.1-0.4μm的dihexa、10-50μm的mk4、2-10μm的tgfβ抑制剂、0.1-0.5mm的pka激活剂、0.1-0.5μm的mk125；优选地，dihexa为0.1μm，mk4为10μm，mk125为0.5μm；tgfβ抑制剂为sb431542，用量为2μm；pka激活剂为camp，用量为0.1mm。
37.下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
38.实施例中用到的相关试剂示于表1-表3，使用的相关抗体示于表4。
39.实施例1 多谱系肝类器官模型的构建以hpsc为种子细胞，当其生长汇合度达30-50%时，即依次使用以下分化培养基，诱导产生多谱系肝脏类器官：s1：诱导hpsc分化定形内胚层（day 1-2）
day 1:将hpsc在培养基a中培养1天，培养基a包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：100ng/ml的rhgdf8、10ng/ml的rhbmp4，基础培养基为含有体积比为2%的ksr的rpmi-1640；day2:之后将上述细胞转移至培养基b中继续培养1天，培养基b包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：100ng/ml的rhgdf8，基础培养基为含有体积比为2%的b27的rpmi-1640。
40.s2：诱导定形内胚层分化为前肠管衍生物（day 3-4）day3-4：将s1分化成功的细胞继续在培养基c中培养2天，培养基c包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：200ng/ml的rhnog、500ng/ml的rhfgf4、3μm的chir99021，基础培养基含有体积比2%的ksr、体积比0.5%的its、体积比75%的william's e和体积比22.5%的f12；期间每24h更换培养基。
41.至day4（第4天），收取上层悬浮球体，使用accutase分散酶消化3-5min使成为单细胞，并使用100% cultrex生长因子减少型基质胶包被后，继续分化。
42.s3：肝脏相关的多谱系特化阶段一（day 5-7）day5-7：将上述单细胞在培养基d中培养3天，培养基d包括基础培养基和添加组分；添加组分包括：10mm nic、1μm repsox、20ng/ml rhfgf2、20ng/ml rhvegf、20ng/ml rhegf、50ng/ml rhwnt3a，基础培养基含有体积比2%的ksr、体积比0.5%的its、体积比75%的william's e和体积比22.5%的f12；期间无需更换培养基。
43.s4：肝脏相关的多谱系特化阶段二（day 8-10）day8-10：继续在培养基e中培养3天，培养基e包括基础培养基及添加组分，添加组分包括：2μm atra、10mm nic、10μm lca，基础培养基含有体积比2%的ksr、体积比0.5%的its、体积比75%的william's e和体积比22.5%的f12；期间无需更换培养基。
44.s5：肝类器官成熟（day11-18）截至day11，将matrigel洗脱并将其中的球状体接种于悬浮培养板过后，继续分化。
45.day11-18：将上述细胞继续在培养基f中分化8天，培养基f包括基础培养基和添加组分，添加组分包括：0.1μm dihexa、10μm mk4、2μm sb431542、0.1 mm camp、0.5μm mk125，础培养基含有体积比2%的ksr、体积比25%的william's e、体积比23%的egm-2和体积比50%的hepatozyme。
46.期间每72h更换1次培养基。截至day18，可形成大量多谱系肝脏类器官。
47.实施例2 类器官质检（一）谱系构成检测取成熟肝类器官，于4%多聚甲醛固定、0.5%tritonx-100透化、5%驴血清封闭后，分别使用各谱系特异性标志物一抗以及荧光二抗标记，并在荧光显微镜下检定类器官谱系构成。
48.结果判读：各标志物表达模式正确的前提下，证实其至少包含alb

肝细胞、sox9

胆管细胞、cd68

肝巨噬细胞、vim

肝星状细胞以及lyve1

肝血窦内皮细胞，则视为过检。
49.（二）关键药物代谢酶cyp3a4活性与可诱导性检测
取成熟的肝类器官，使用分散酶ii消化后去除matrigel，以培养基f重悬并按照200个类器官/孔的密度，使用matrigel接种于48孔培养板。待原代肝细胞汇合度达80-90%后，在类器官与原代肝细胞培养基中加入诱导剂（25μm利福平）与对照（0.5% dmso），37℃培养72h后，分别取各组上清，使用promega p450-glo
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cyp3a4 assay and screening system kit，按照说明书检测cyp3a4活性。
50.结果判读：诱导前后cyp3a4活性值的统计学差异p＜0.05，证明可被显著诱导；在此基础上，诱导倍数不低于原代肝细胞的1/3，则视为过检。
51.（三）药物肝毒识别能力检测按照20个类器官/孔的密度，将通过质检的类器官均匀接种于96孔超低吸附板中；使用结构类似，但肝毒性不同的药物处理类器官，考察组间的细胞活力差异。
52.以罗格列酮vs曲格列酮、左氧氟沙星vs曲伐沙星两组为例，其浓度设置均以临床最大血药浓度cmax为基数，梯度如下0.3x cmax，1x cmax，3x cmax，10x cmax，30x cmax；37℃培养7天后，使用promega celltiter-glo 3d cell viability assay kit，按照说明书，检测各组细胞活力。
53.结果判读：任何药物浓度下，存在组间统计学差异p＜0.05，证明在该药物浓度下类器官可区分肝毒性不同的结构类似物；在此基础上，随药物浓度增加，组间细胞活力差值呈现增加趋势，则视为过检。
54.（四）胆汁分泌能力检测取类器官培养上清（空培养基作为对照），使用总胆汁酸tba分析试剂盒total bile acids(tba) assay kit，按照操作说明书检测胆汁分泌能力。
55.结果判读：类器官的胆汁分泌量不低于原代肝细胞的1/3，即6.5μm/ml/106细胞/24h，视为过检。
56.实施例3 药物毒性评价1、类器官接种与药物处理按照20个类器官/孔的密度，将通过质检的类器官均匀接种于96孔超低吸附板中，待原代肝细胞汇合度达80-90%后，分别加入待测药物与对照（0.5% dmso）。
57.其中，待测药物可以乙酰氨基酚、曲格列酮以及环孢菌素a举例，其作用浓度设置为：对乙酰氨基酚：10000μm，2000μm，400μm，80μm和16μm；曲格列酮：200μm，40μm，8μm，1.6μm和0.32μm；环孢菌素a：100μm，20μm，4μm，0.8μm和0.016μm；空白对照组加入0.5%dmso。
58.各组于培养箱中培养1-4天。
59.2、tc50检测药物处理4天后，使用promega celltiter-glo 3d cell viability assay kit检测细胞活力并计算半数毒性浓度（tc50）。
60.3、ast与alt活性检测在上述tc50检测的基础上，选择对乙酰氨基酚、曲格列酮的tc50值（即2000μm和40μm）孵育类器官4天，使用ast activity assay kit 与alt activity assay kit检测alt和
ast活性。
61.结果判读：当对照/药物组统计学差异p≥0.05、p＜0.05、p＜0.01以及p＜0.001时，分别判定为无肝损伤、轻度肝损伤、中度肝损伤以及重度肝损伤。
62.实施例4 特异质肝毒分析1、类器官接种与药物处理按照20个类器官/孔的密度，将通过质检的类器官均匀接种于96孔超低吸附板中，待原代肝细胞汇合度达80-90%后，分别加入待测药物与对照（0.5% dmso）。
63.其中，待测药物以兼具胆汁淤积毒性与线粒体毒性的药物曲格列酮和环孢菌素a为例，浓度分别采用10μm与1μm（接近人体血药浓度cmax），并37℃培养箱培养72h。
64.2、胆汁淤积毒性检测1）使用promega celltiter-glo 3d cell viability assay kit检测各组细胞活力；2）使用10μm clf（cholyl-lys-fluluorescein）于细胞培养箱中孵育染色60min、经pbs充分漂洗后，在荧光显微镜下拍照并使用imagej软件进行荧光强度定量。
65.结果判读：对比对照/药物组荧光强度值的统计学差异，当p≥0.05、p＜0.05、p＜0.01以及p＜0.001时，分别判定为无胆汁淤积毒性、轻度胆汁淤积毒性、中度胆汁淤积毒性以及重度胆汁淤积毒性。
66.3、线粒体毒性检测1）使用250nm image-it
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tmrm于细胞培养箱中孵育30min、经pbs充分漂洗后，在荧光显微镜下拍照并使用imagej软件进行荧光强度定量；结果判读：对比对照/药物组荧光强度值的统计学差异，当p≥0.05、p＜0.05、p＜0.01以及p＜0.001时，分别判定为无线粒体毒性、轻度线粒体毒性、中度线粒体毒性以及重度线粒体毒性。
67.2）使用oxygen consumption rate assay kit检测各组耗氧率；结果判读：对比对照/药物组耗氧率的统计学差异，当p≥0.05、p＜0.05、p＜0.01以及p＜0.001时，分别判定为无线粒体毒性、轻度线粒体毒性、中度线粒体毒性以及重度线粒体毒性。
68.对比例：以申请号为2022101199375的专利中提出的方法作为对比，此专利也是本技术人所作的研究。
69.本发明专利产生肝类器官与前期专利2022101199375的方法效果主要有以下差异：类器官中新增了一种细胞类型：肝血窦内皮细胞；在此基础上，类器官的制备时间周期缩短了25%（18天 vs 24天）。
70.将前期专利2022101199375的方法所产生的类器官使用毒性药物对乙酰氨基酚处理96h后，检测培养基中ast活性。
71.结果分析：1、图1为day18肝类器官形态检定，表明这些类器官为匀质的、大小为200-300μm左右的球形结构。图2为免疫荧光下的谱系鉴定结果，表明其具备肝细胞（alb

）、胆细胞（sox9

）、肝血窦内皮细胞（lyve1

）、肝星状细胞（vim

）、以及库否细胞（cd68

），为多谱系肝脏类
器官。
72.2、图3和图4为不同分化阶段血管内皮细胞标志物pecam1与肝血窦内皮标志物icam1的mrna表达情况，表明本发明方法在分化过程中，尤其是最后阶段，其血管内皮细胞标志物pecam1与肝血窦内皮细胞标志物icam1表达量更高，尽管不及人原代肝脏。
73.造成该现象的主要原因在于最后阶段采用的组合物：在采用s5阶段基础培养基的前提下(2%ksr/25%william's e/23% egm-2/50% hepatozyme)，添加本方法的因子组合（dihexa sb431542 camp mk125 mx mk4）可实现肝血窦内皮标志物lyve1与肝细胞标志物alb的表达的最佳平衡，如图5和图6所示。
74.此外，在基础培养基中添加egm-2对lyve1

肝血窦内皮细胞的命运决定关键作用。如图7所示，撤去egm-2导致lyve1表达水平下降了约9倍。
75.以上结果表明，产生内皮细胞需有egm-2，但同时会降低肝细胞的成熟度（如alb等成熟标志物mrna的表达）。通过实验发现，采用本发明方法的因子组合，即dihexa sb431542 camp mk125 mx mk4，可实现二者的平衡。
76.3、图8为原代肝细胞和肝类器官的cyp3a4酶活性检测结果，肝脏主要药物代谢酶cyp3a4的活性值接近原代肝细胞。
77.图9为原代肝细胞和肝类器官使用诱导剂利福平后的可诱导性检测结果，使用诱导剂利福平诱导72h后，二者的可诱导倍数无差异（8.1倍vs 10.2倍；p＞0.05），诱导前后cyp3a4活性值的统计学差异p＜0.001，证明其可被显著诱导。
78.4、基于该类器官，使用结构相似的低肝毒/高肝毒药物测试药物肝毒的识别能力：罗格列酮和曲格列酮、左氧氟沙星和曲伐沙星孵育7天，细胞活性检测结果表明，前者在1x cmax及更高浓度下呈现组间统计学差异，后者在3x cmax及更高浓度下呈现组间统计学差异；在此基础上，随剂量的提升，组间细胞活力差值呈现增加趋势。这些结果表明肝类器官可区分这些结构类似药物的肝毒性（图10-图11），证明其具备肝毒评价的高精准度。其中，图10和图11中的虚线是指设置细胞活性80%为临界点。
79.5、以原代肝细胞为对照（10供体混合型，经诱导验证），平行使用肝毒性药物对乙酰氨基酚、曲格列酮以及环孢菌素a孵育4天后，计算各药物的半数毒性浓度(tc50)，其结果表明，在所有测试的肝毒药物中，肝类器官均在更低的药物剂量下达到tc50（图12-图14），证明其比原代肝细胞具备更好的肝毒敏感度。
80.6、在上述tc50检测的基础上，选择对乙酰氨基酚、曲格列酮的tc50值（即2000μm和40μm）孵育类器官4天，并检测临床肝损的血清标志物ast与alt的活性。
81.elisa检测结果表明，对照组（只添加溶剂，即dmso）处理前后无显著差异（p＜0.05），表明无肝损；对乙酰氨基酚处理前后ast与alt呈现显著差异（p＜0.05与p＜0.01），表明引发轻度至中度肝损伤；曲格列酮处理前后alt与ast呈现显著差异（p＜0.05与p＜0.01），表明轻度至中度肝损伤（图15和图16）。
82.7、通过图17可以看出，前期专利方法产生的类器官ast本底活性低，且无法对肝毒性药物产生显著响应，说明本发明所构建的类器官更适于进行药物肝毒评价。
83.8、如图18-图19所示，验证了肝类器官分泌胆汁酸的能力。图18中cdfda染色结果表明，该类器官具备功能性胆小管。图19总胆汁酸elisa检测结果表明：与对照组（培养基）相比，该类器官具备分泌胆汁酸的能力，产生量为9.3μm/106细胞/天，约为报道中原代肝细
胞球体分泌量的1/2。
84.9、基于以上类器官的表型与功能检定结果，以两种特异质肝毒药物为例：曲格列酮和环孢菌素a，这两种药物经广泛报道具有胆汁淤积毒性与线粒体毒性。
85.测试类器官对其毒性的识别能力：首先，经2种药物作用后，类器官呈现正常形态与生长状态，如图20（a）和图20（b），且细胞活力均与对照组无差异，均＞90%，如图21，符合特异质肝毒的特性，即从形态和细胞活力来看，与正常形态无异。
86.在此前提下，基于clf染色的胆汁淤积检测结果表明，如图22所示，（a）图对照组的clf可正常进入肝脏类器官内部，为绿色荧光显示；而药物组clf则无法进入类器官内部，如（b）图和（c）图，显示为弱或无绿色荧光，提示两种药物抑制了胆汁酸转运泵（bsep），图23荧光强度的定量结果则证实了该效应的显著性。
87.对比对照/药物组荧光强度值的统计学差异，曲格列酮处理后荧光值呈现显著差异（p＜0.01），表明引发中度胆汁淤积毒性；环孢菌素a处理后荧光值呈现显著差异（p＜0.001），表明引发重度胆汁淤积毒性。
88.基于tmrm染色的线粒体毒性检测结果表明：与对照组相比，药物组红色荧光明显减弱，如图24所示，表明曲格列酮和环孢菌素a导致了线粒体损伤；荧光强度定量结果则确认了该效应的显著性，如图25。
89.对比对照/药物组荧光强度值的统计学差异，曲格列酮处理后荧光值呈现显著差异（p＜0.01），表明引发中度线粒体毒性；环孢菌素a处理后荧光值呈现显著差异（p＜0.01），表明引发中度线粒体毒性。
90.此外，耗氧率（ocr，oxygen consumption rate）检测结果表明：药物处理后的探针荧光强度显著增强，即耗氧率显著减弱，如图26和27，进一步证实了药物的线粒体毒性。
91.对比对照/药物组耗氧率的统计学差异，曲格列酮处理后荧光值呈现显著差异（p＜0.001），表明引发重度线粒体毒性；环孢菌素a处理后荧光值呈现显著差异（p＜0.001），表明引发重度线粒体毒性。
92.综上，曲格列酮与环保霉素a引发中度至重度线粒体毒性。
93.10、研究表明，肝脏血窦内皮细胞对胆汁的产生、转运与外排均有重要作用。由于前专利方法产生的类器官不具备肝血窦内皮细胞，其胆汁酸转运泵ntcp与besp的表达水平远低于本方法，如图28-图29所示，致使胆汁酸分泌量也远不及本方法，如图30。
94.同样，如图31所示，经胆汁淤积毒性药物曲格列酮与环保霉素a处理后，其类器官内clf荧光强度与对照组无差异，表明其无法区分胆汁淤积毒性，说明本发明所构建的类器官更适于进行特异质肝毒评价。
95.综上，本发明专利提供的多谱系肝类器官模型及基于该模型的药物肝毒评价方法，其具有以下优势：1）药物代谢酶p450活性和可诱导性；2）能够识别肝毒性药物的肝脏毒性；3）能精确识别结构类似的低肝毒/高肝毒药物毒性，应用此新评价方法，将填补当下2d/3d细胞模型与动物模型之间的沟壑，大幅降低因dili导致的临床试验失败或药物下架。
96.表1 试剂列表
试剂耗材名称公司（货号）mtesr1stemcell(85850)y-27632tocris(1254/1)
rpmi1640gibco(31870082)f12gibco(11765062)william’segibco(22551022)egm-2lonza(cc-3162)accutase-edtainnovativecelltechnologies(12605010)hepatozymegibco(17705021)ksrgibco(10828010)itsgibco(41400045)rhgdf8r&d(788-g8)rhbmp4r&d(314-bpe)rhfgf2r&d(233-fb)rhfgf4r&d(235-f4)rhnogr&d(6057-ng)rhegfr&d(236-eg)rhvegfr&d(dve00)rhosmr&d(295-om)cctocris(3093/10)chir99021tocris(4423/10)nictocris(4106/50)atratocris(0695/50)lcasigma(l6250)repsoxtocris(3742/10)8-br-camptocris(1140/10)dihexainvivochem(v15953)sb431542tocris(1614)mk4sigma(v9378)mk125tocris(0884/5)cultrexreducedgrowthfactorbasementmembraneextract,type2,pathclearr&d(3533-010-02)humanliverrnaclontech(636531)trizolsolutioninvitrogen(15596018)evom-mlvrtkitwithgdnacleanforqpcrag(ag11705)sybrgreenpremixprotaqhsqpcrkitag(ag11718)normaldonkeyserumjacksonlab(017-000-121)dapisigma(d9542) rifampicintocris(4121/50)acetaminophentocris(1706/100)cyclosporinatocris(1101/100)troglitazonetocris(3114/10)rosiglitazonetocris(5325/10)trovafloxacintocris(3863/10)levofloxacinsigma(1362103)dispaseiigibco(17105041)celltiter-glo
®
3dcellviabilityassaypromega(g9682)p450-glo
™
cyp3a4assayandscreeningsystemkitpromega(v9002)astactivityassaykitsigma(mak055)altactivityassaykitsigma(mak052)cultrexreducedgrowthfactorbasementmembraneextract,type2,pathclearr&d(3533-010-02)totalbileacids(tba)assaykit(colorimetric)biovision(ab239702）oxygenconsumptionrateassaykitcayman(600800)cdfdasigma(21884-100mg)clf（cholyl-lys-fluluorescein）aatbioquest(36701)
ꢀꢀꢀ
image-it
™
tmrm试剂invitrogen(i34361)
表2 试剂对应名称
rhnog重组人头蛋白；bmp抑制剂
rhgdf8肌肉抑制素8rhbmp4重组人骨形成蛋白4rhfgf2重组人成纤维细胞生长因子2rhfgf4重组人成纤维细胞生长因子4rhegf重组人上皮生长因子rhvegf 重组人血管内皮细胞生长因子ksr(knockoutserumreplacement)knockout血清替代物chir99021gsk-3抑制剂nic(nicotinamide)烟酰胺，sirt1抑制剂atra(all-trans-retinoicacid)全反式维甲酸，rar核受体的天然激动剂lca(lithocholicacid)石胆酸repsoxtgfβr-1/alk5抑制剂william’se一种使用于上皮细胞/上皮干细胞的基础培养基f12 ham营养混合物hepatozyme一种适用于维持肝系基因型维持的无血清培养基its(insulin-transferrin-selenium)胰岛素-转铁蛋白-硒混合液camppka激活剂mk4(menaquinone-4)甲萘醌4mx(methoxamine)甲氧胺，α1-肾上腺素能受体激动剂mk125(dexamethasone)地塞米松ph(primaryhepatocyte)人原代肝细胞sb-431542选择性的alk5/tgf-βtypeireceptor抑制剂dihexa可渗透血脑屏障的，血管紧张素iv类似物，对肝细胞生长因子(hgf)具有高亲和力tc5050%毒性浓度alt谷丙转氨酶ast天冬氨酸转氨酶rifampicin利福平acetaminophen对乙酰氨基酚cyclosporina环孢菌素atroglitazone曲格列酮rosiglitazone罗格列酮trovafloxacin曲伐沙星levofloxacin左氧氟沙星dispaseii分散酶iidmso二甲基亚砜cmax药物最大血浆浓度egm-2内皮细胞培养基cdfda5[6]-羧基-2',7'-二氯荧光素二乙酸酯ocr耗氧率tba总胆汁酸bsep胆汁酸转运泵
表3 药物浓度表4 抗体列表
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。