三角梅表型花色关联转录组调控基因筛选和定位分析方法

1.本发明涉及农业生产技术领域，尤其涉及三角梅表型花色关联转录组调控基因筛选和定位分析方法。


背景技术：

2.三角梅(bougainvillea spp.)，又名叶子花、勒杜鹃、九重葛等，紫茉莉科 (nyctaginacea)三角梅属(bougainvillea)半攀援木本植物，原产于南美洲地区，一般指三角梅属中较具观赏价值的毛叶三角梅(b.spectabilis)、光叶三角梅(b.glabra)和秘鲁三角梅(b.peruviana)及其之间的杂交种、园艺种。三角梅在热带、亚热带地区生长旺盛，耐干旱、贫瘠，喜温暖、透气，对栽培环境的要求较低，是市政、道路绿化，庭院、公园美化的常用树种；又因枝条生长快速、具有一定的柔韧度，三角梅常用于构造盆景、桩景、植物造型、植物廊架、拱门等。近年来随着家庭园艺的不断兴起，三角梅盆栽备受花卉市场和消费者的喜爱，是近年来花卉市场的热销种类之一。三角梅在花色、叶色等方面具有较高的遗传多样性，涵盖白色、粉色、紫色、红色、黄色等多个花色；具有银边叶、金边叶、金心叶、斑叶、洒金叶等多种叶艺。三角梅具有较高的观赏性，由于花色丰富多样、花期较长、一年四季皆可开花，三角梅在热带和亚热带地区广受欢迎。
3.但是在三角梅的实际应用中经常出现只长叶不开花、株型散乱、花期不一致等现象，影响观赏。鉴于目前社会对景观用三角梅苗木的需求越来越大，对花色种类的要求越来越高，但是目前尚未有较为高效的三角梅的育种、杂交、花色调控方法，因此，本发明旨在解决这一技术问题。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提出一种实施可靠、操作便利且辅助筛选效率高的三角梅表型花色关联转录组调控基因筛选和定位分析方法。
5.为了实现上述的技术目的，本发明所采用的技术方案为：
6.一种三角梅表型花色关联转录组调控基因筛选和定位分析方法，其包括：
7.s1、数据测定：利用微光纤光谱仪对花色差异达到预设条件的三角梅苞片进行定量测量作为花色表型连续数据并进行数据清洗；
8.s2、测定不同基因的差异表达量：取状态临近的苞片样本进行第二代illumina技术高通量转录组测序，获得差异表达量数据；
9.s3、wgcna分析：利用花色表型连续数据与差异表达量数据进行wgcna 分析，筛选与花色变化相关的基因集模块；
10.s4、定位基因：对相关度达到预设条件的模块基因进行功能注释，然后定位到与花色素相关合成通路，从而寻找关键调控基因；
11.s5、鉴定关键基因和功能：按预设条件对关键基因进行qpcr验证和后续的功能验证，以鉴定关键基因和功能。
12.作为一种可能的实施方式，进一步，本方案s1中对三角梅苞片进行定量测量的方法包括：
13.在暗室条件下，利用微光纤光谱仪在400～1000nm光谱范围下对花色差异达到预设条件的三角梅苞片进行定量测量，其中，每种花色观测并记录至少3 个采样光谱数据且取均值作为最终值。
14.作为一种可能的实施方式，进一步，本方案s2中取状态临近的苞片样本进行第二代illumina技术高通量转录组测序的方法包括：
15.采用分光色差仪对状态临近的苞片样本进行花色测定，且重复至少5次以上并记录数据。
16.作为一种可能的实施方式，进一步，本方案s3中进行wgcna分析的方法包括：
17.对于wgcna，利用r包对基因进行过滤，共筛选出29216个基因，其中，对fpkm值》0的基因进行进一步分析；
18.以7为软阈值幂的参数构建不同基因间的邻接矩阵，利用tom相似度算法将邻接矩阵转化为拓扑重叠矩阵以减少噪声和虚假相关性，然后，基于to 相似性对所有基因进行分层聚类，通过动态混合树切割进行分层聚类；此外，通过将其表示为第一主成分来总结每个模块的表达概况，并将每个模块的特征基因与每个类胡萝卜素含量的变化相关联，以找到与菊花中类胡萝卜素积累相关的关键模块。
19.作为一种可能的实施方式，进一步，本方案s4中定位到与花色素相关合成通路的方法包括：
20.对花色的形成过程进行推理分析，确定好候选基因，对候选基因进行标记，按标记好的基因型对对应个体进行分组，再次统计分析，根据性状表现鉴定个体的基因型并且对于拥有不同标记的等位基因的出现频率进行统计，缩小范围定位基因。
21.作为一种可能的实施方式，进一步，本方案s5中进行qpcr验证的方法包括：采用多糖多酚植物总rna提取试剂盒(tiangen，dp441)对叶子花的总rna 进行提取，用1.6％的琼脂凝胶电泳检测其条带清晰完整性。采用primescript
tm
rtreagent kit(takara，rr047a)进行反转录，并使用nanodrop(thermo fisher) 对cdna进行浓度检测。将cdna稀释至同一浓度作为模板，选择18s为内参基因，采用sybr qpcr master mix(vazyme，q711)和x960(力康)荧光定量pcr 仪进行qpcr扩增反应。基因表达量使用2
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ct
法计算。
22.上述方案可以被应用于三角梅杂交培育筛选、育种筛选和花色调控中。
23.采用上述的技术方案，本发明与现有技术相比，其具有的有益效果为：本方法可以有效辅助三角梅的育种，杂交，花色调控实验，建立起相关联的基因数据库，提高新品种的筛选效率，帮助解决三角梅只长叶不开花、株型散乱、花期不一致等问题。
具体实施方式
24.下面结合实施例，对本发明作进一步的详细描述。特别指出的是，以下实施例仅用于说明本发明，但不对本发明的范围进行限定。同样的，以下实施例仅为本发明的部分实施例而非全部实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
25.实施例1
26.本实施例一种三角梅表型花色关联转录组调控基因筛选和定位分析方法，其包括：
27.s1、数据测定：利用高精度微光纤光谱仪对有明显花色差异的三角梅苞片进行定量测量作为花色表型连续数据并进行数据清洗。定量测定应在暗室中进行，便于控制光线条件。光谱范围取400～1000nm，为保证结果具有一定的准确性，每种花色观测并记录至少3个采样光谱，并取均值作为最终值。
28.s2、测定不同基因的差异表达量：取状态临近的苞片样本进行第二代illumina技术高通量转录组测序，其具体采用分光色差仪(colorimeter)，利用色差仪进行花颜色测定时需重复5次以上。分光色差仪采用的是国际照明委员会(international commission on illumination,cie)表色系统,可用于花色的数字化测量。其中涉及到的指标有明度(l*值)、色相(a*值)、色相(b*值)、彩度(c*)值和色相角(h)。l*从0到100,表示明度由暗到明的变化；a*值由负值到正值,代表绿色逐渐减弱、红色逐渐增强,b*值的增加代表蓝色逐渐减弱、黄色逐渐增强。利用明度(l*)和两个色相成分(a*值和b*值)可以在三维色度坐标系(l*轴垂直于a*轴、b*轴组成的平面)中表示出一个颜色的点,进行花色值分析。按照公式c*＝(a*2 b*2)1/2,h＝tan
–
1(b*/a*)计算彩度和色相角。彩度c*值表示颜色的强度或饱和度,其变化表现在色相方向上距离l* 轴的垂直距离:数值越大、越向周边,颜色越鲜明；数值越小、越靠近纵轴,颜色越暗淡。色相角(h)是对红、橙、黄、绿、青、蓝、紫7种颜色色调的描述,其中h＝0,紫红色；h＝90,黄色；h＝180,绿色(mcguire,1992；wangetal., 2001)。
29.s3、wgcna分析：利用花色表型连续数据与差异表达量数据进行wgcna分析，筛选与花色变化相关的基因集模块。进行分析的具体方法为：对于wgcna，利用r包对基因进行过滤，共筛选出29216个基因，其中对fpkm值》0的基因进行进一步分析。以7为软阈值幂的参数构建不同基因间的邻接矩阵，利用tom 相似度算法将邻接矩阵转化为拓扑重叠矩阵以减少噪声和虚假相关性。然后，基于to相似性对所有基因进行分层聚类，通过动态混合树切割进行分层聚类。此外，通过将其表示为第一主成分来总结每个模块的表达概况，并将每个模块的特征基因与每个类胡萝卜素含量的变化相关联，以找到与菊花中类胡萝卜素积累相关的关键模块。
30.s4、定位基因：对有明显相关的模块基因进行功能注释，定位到与花色素相关合成通路从而寻找关键调控基因。对花色的形成过程进行推理分析，确定好候选基因，对候选基因进行标记，按标记好的基因型对对应个体进行分组，再次统计分析，根据性状表现鉴定个体的基因型并且对于拥有不同标记的等位基因的出现频率进行统计，缩小范围定位基因。
31.s5、鉴定关键基因和功能：对关键基因进行qpcr验证和后续的功能验证，以鉴定关键基因和功能。其中qpcr验证的具体方法为：采用多糖多酚植物总 rna提取试剂盒(tiangen，dp441)对叶子花的总rna进行提取，用1.6％的琼脂凝胶电泳检测其条带清晰完整性。采用primescript
tm rt reagent kit (takara，rr047a)进行反转录，并使用nanodrop(thermo fisher)对cdna进行浓度检测。将cdna稀释至同一浓度作为模板，选择18s为内参基因，采用sybr qpcr master mix(vazyme，q711)和x960(力康)荧光定量pcr仪进行qpcr扩增反应。基因表达量使用2
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法计算。
32.实施例2
33.本实施例一种三角梅表型花色关联转录组调控基因筛选和定位分析方法，其包
括：
34.s1、数据测定：利用高精度微光纤光谱仪对有明显花色差异的三角梅苞片进行定量测量作为花色表型连续数据并进行数据清洗。定量测定应在暗室中进行，便于控制光线条件。光谱范围取400～1000nm，为保证结果具有一定的准确性，每种花色观测并记录至少3个采样光谱，并取均值作为最终值。
35.s2、测定不同基因的差异表达量：取状态临近的苞片样本进行第二代illumina技术高通量转录组测序，其具体采用分光色差仪(colorimeter)，利用色差仪进行花颜色测定时需重复5次以上。分光色差仪采用的是国际照明委员会(international commission on illumination,cie)表色系统,可用于花色的数字化测量。其中涉及到的指标有明度(l*值)、色相(a*值)、色相(b*值)、彩度(c*)值和色相角(h)。l*从0到100,表示明度由暗到明的变化；a*值由负值到正值,代表绿色逐渐减弱、红色逐渐增强,b*值的增加代表蓝色逐渐减弱、黄色逐渐增强。利用明度(l*)和两个色相成分(a*值和b*值)可以在三维色度坐标系(l*轴垂直于a*轴、b*轴组成的平面)中表示出一个颜色的点,进行花色值分析。按照公式c*＝(a*2 b*2)1/2,h＝tan
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1(b*/a*)计算彩度和色相角。彩度c*值表示颜色的强度或饱和度,其变化表现在色相方向上距离l* 轴的垂直距离:数值越大、越向周边,颜色越鲜明；数值越小、越靠近纵轴,颜色越暗淡。色相角(h)是对红、橙、黄、绿、青、蓝、紫7种颜色色调的描述,其中h＝0,紫红色；h＝90,黄色；h＝180,绿色(mcguire,1992；wang et al., 2001)。
36.s3、wgcna分析：利用花色表型连续数据与差异表达量数据进行wgcna分析，筛选与花色变化相关的基因集模块。进行分析的具体方法为：对于wgcna，利用r包对基因进行过滤，共筛选出29216个基因，其中对fpkm值》0的基因进行进一步分析。以7为软阈值幂的参数构建不同基因间的邻接矩阵，利用tom 相似度算法将邻接矩阵转化为拓扑重叠矩阵以减少噪声和虚假相关性。然后，基于to相似性对所有基因进行分层聚类。通过动态混合树切割进行分层聚类。此外，通过将其表示为第一主成分来总结每个模块的表达概况，并将每个模块的特征基因与每个类胡萝卜素含量的变化相关联，以找到与菊花中类胡萝卜素积累相关的关键模块。
37.s4、定位基因：对有明显相关的模块基因进行功能注释，定位到与花色素相关合成通路从而寻找关键调控基因。对花色的形成过程进行推理分析，确定好候选基因，对候选基因进行标记，按标记好的基因型对对应个体进行分组，再次统计分析，根据性状表现鉴定个体的基因型并且对于拥有不同标记的等位基因的出现频率进行统计，缩小范围定位基因。
38.s5、鉴定关键基因和功能：对关键基因进行qpcr验证和后续的功能验证，以鉴定关键基因和功能。其中qpcr验证的具体方法为：采用多糖多酚植物总 rna提取试剂盒(tiangen，dp441)对叶子花的总rna进行提取，用1.6％的琼脂凝胶电泳检测其条带清晰完整性。采用primescript
tm rt reagent kit (takara，rr047a)进行反转录，并使用nanodrop(thermo fisher)对cdna进行浓度检测。将cdna稀释至同一浓度作为模板，选择18s为内参基因，采用sybr qpcr master mix(vazyme，q711)和x960(力康)荧光定量pcr仪进行qpcr扩增反应。基因表达量使用2
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ct
法计算。
39.实施例3
40.本实施例一种三角梅表型花色关联转录组调控基因筛选和定位分析方法，其包括：
41.s1、数据测定：利用高精度微光纤光谱仪对有明显花色差异的三角梅苞片进行定量测量作为花色表型连续数据并进行数据清洗。定量测定应在暗室中进行，便于控制光线条件。光谱范围取400～1000nm，为保证结果具有一定的准确性，每种花色观测并记录至少3个采样光谱，并取均值作为最终值。
42.s2、测定不同基因的差异表达量：取状态临近的苞片样本进行第二代illumina技术高通量转录组测序，其具体采用分光色差仪(colorimeter)，利用色差仪进行花颜色测定时需重复5次以上。分光色差仪采用的是国际照明委员会(international commission on illumination,cie)表色系统,可用于花色的数字化测量。其中涉及到的指标有明度(l*值)、色相(a*值)、色相(b*值)、彩度(c*)值和色相角(h)。l*从0到100,表示明度由暗到明的变化；a*值由负值到正值,代表绿色逐渐减弱、红色逐渐增强,b*值的增加代表蓝色逐渐减弱、黄色逐渐增强。利用明度(l*)和两个色相成分(a*值和b*值)可以在三维色度坐标系(l*轴垂直于a*轴、b*轴组成的平面)中表示出一个颜色的点,进行花色值分析。按照公式c*＝(a*2 b*2)1/2,h＝tan
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1(b*/a*)计算彩度和色相角。彩度c*值表示颜色的强度或饱和度,其变化表现在色相方向上距离l* 轴的垂直距离:数值越大、越向周边,颜色越鲜明；数值越小、越靠近纵轴,颜色越暗淡。色相角(h)是对红、橙、黄、绿、青、蓝、紫7种颜色色调的描述,其中h＝0,紫红色；h＝90,黄色；h＝180,绿色(mcguire,1992；wang et al., 2001)。
43.s3、wgcna分析：利用花色表型连续数据与差异表达量数据进行wgcna分析，筛选与花色变化相关的基因集模块。进行分析的具体方法为：对于wgcna，利用r包对基因进行过滤，共筛选出29216个基因，其中对fpkm值》0的基因进行进一步分析。以7为软阈值幂的参数构建不同基因间的邻接矩阵，利用tom 相似度算法将邻接矩阵转化为拓扑重叠矩阵以减少噪声和虚假相关性。然后，基于to相似性对所有基因进行分层聚类。通过动态混合树切割进行分层聚类。此外，通过将其表示为第一主成分来总结每个模块的表达概况，并将每个模块的特征基因与每个类胡萝卜素含量的变化相关联，以找到与菊花中类胡萝卜素积累相关的关键模块。
44.s4、定位基因：对有明显相关的模块基因进行功能注释，定位到与花色素相关合成通路从而寻找关键调控基因。对花色的形成过程进行推理分析，确定好候选基因，对候选基因进行标记，按标记好的基因型对对应个体进行分组，再次统计分析，根据性状表现鉴定个体的基因型并且对于拥有不同标记的等位基因的出现频率进行统计，缩小范围定位基因。
45.s5、鉴定关键基因和功能：对关键基因进行qpcr验证和后续的功能验证，以鉴定关键基因和功能。其中qpcr验证的具体方法为：采用多糖多酚植物总 rna提取试剂盒(tiangen，dp441)对叶子花的总rna进行提取，用1.6％的琼脂凝胶电泳检测其条带清晰完整性。采用primescript
tm rt reagent kit (takara，rr047a)进行反转录，并使用nanodrop(thermo fisher)对cdna进行浓度检测。将cdna稀释至同一浓度作为模板，选择18s为内参基因，采用sybrqpcr master mix(vazyme，q711)和x960(力康)荧光定量pcr仪进行qpcr扩增反应。基因表达量使用2
‑△△
ct
法计算。
46.以上所述仅为本发明的部分实施例，并非因此限制本发明的保护范围，凡是利用本发明说明书所作的等效装置或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。