利用无血清培养基培养BHK21细胞的方法及其在制备疫苗中的用途与流程

利用无血清培养基培养bhk21细胞的方法及其在制备疫苗中的用途
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，更具体的，本技术涉及利用无血清培养基培养bhk21细胞的方法及其在制备疫苗中的用途。


背景技术：

2.bhk细胞原始的细胞株是成纤维细胞，需要贴壁依赖性生长，后来经传代驯化后bhk细胞可悬浮生长。由于悬浮培养相对于传统的转瓶培养在细胞培养过程中全程封闭减少了中间开放节点、可实现远程操控降低人工操作带来的污染风险、增加培养器容积、减小批间差异、提高均一性等。由于这些优点，通过悬浮培养bhk cell可广泛用于增殖各种病毒抗原、生产兽用疫苗。常用的细胞为bhk21，即bhk细胞系的亚克隆细胞系。
3.然而，目前针对bhk21细胞的培养手段，尤其是针对应用于疫苗领域的bhk21细胞的培养手段仍有待改进。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效地利用无血清培养基培养bhk21细胞的方法。
5.本技术是基于发明人的下列发现而完成的：bhk21细胞在应用于病毒的培养时，通常采用dmem/f12添加血清作为培养基。然而，发明人在细胞培养领域的长期研发过程中，发现在采用血清作为添加剂与dmem/f12培养基配合对bhk21细胞进行悬浮培养时，会存在一些不可克服的缺陷，例如细胞的48小时存活率偏低、细胞结团率偏高，同时在应用于动物时，血清中的成分会不可避免地引发不必要的免疫反应。为此本技术的发明人致力于开发出一种在无血清条件下培养bhk21细胞的方法，在应用于疫苗领域时，以避免引发不必要的免疫反应。为此目的，发明人结合之前在细胞培养领域积累的丰富经验，进行了大量的筛选和优化工作，意外地获得了一种利用无血清培养基培养bhk21细胞的方法，该方法能够有效地对bhk21细胞进行悬浮培养，同时能够在多项指标上获得比血清培养更优异的表现。
6.为此，在本发明的第一方面，本技术提出了一种利用无血清培养基培养bhk21细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将bhk21细胞接种在dmem/f12培养基中；和在适于bhk21细胞增殖的条件下，对所述bhk21细胞进行培养，其中，所述dmem/f12培养基中预先添加下列成分：0.000085重量份的硝酸银；0.05275重量份的氯化铝；0.0003重量份的偏钒酸铵；0.000002重量份的偏钒酸钠；0.001015重量份的氯化镉；0.001315重量份的六水氯化钴；0.00014重量份的六水氯化铬；0.014重量份的五水硫酸铜；0.00027重量份的二氧化锗；0.00007重量份的溴化钾；0.000085重量份的碘化钾；0.000000124重量份的四水氯化锰；79.5重量份的六水氯化镁；0.001875重量份的钼酸铵；0.1965重量份的九水偏硅酸钠；
0.011重量份的亚硒酸钠；0.0023重量份的氟化钠；0.000065重量份的硫酸镍；0.00067重量份的氯化铷；0.00005重量份的氯化亚锡；0.0018重量份的氧氯化锆；0.000125重量份的乙酸钡；0.001重量份的氯化锂；2重量份的重组人胰岛素；0.03重量份的氢化可的松；1600重量份的酵母水解物；2100重量份的大豆水解物；1000重量份的小麦水解物；3000重量份的hepes；1000重量份的f68。
7.根据本技术的实施例，本技术的发明人发现不同细胞系所适用的培养条件的通用性差，需要基于细胞自身的生长特性开发不同的培养方法，才能实现有效地细胞扩增或者培养。进而，发明人针对bhk21细胞特性进行了大量的优化和筛选实验，发现发酵培养基的组成会显著影响细胞扩增，且组成成分并无规律可以遵循，结果也是无法预测的，发明人意外发现，采用dmem/f12培养基作为基础培养基，通过添加微量元素、激素、非动物源蛋白水解物、缓冲剂和消泡剂可以实现细胞扩增。
8.进一步地，发明人对微量元素、激素、非动物源蛋白水解物、缓冲剂和消泡剂的具体类型进行优化和筛选，发现以硝酸银、氯化铝、偏钒酸铵、偏钒酸钠、氯化镉、六水氯化钴、六水氯化铬、五水硫酸铜、二氧化锗、溴化钾、碘化钾、四水氯化锰、六水氯化镁、钼酸铵、九水偏硅酸钠、亚硒酸钠、氟化钠、硫酸镍、氯化铷、氯化亚锡、氧氯化锆、乙酸钡、氯化锂作为微量元素，以重组人胰岛素和氢化可的松作为激素，以酵母水解物、大豆水解物和小麦水解物作为非动物源蛋白水解物，以hepes作为缓冲剂，以f68作为消泡剂，同时控制各成分的添加量，可以实现在无血清条件下有效地降低培养结团率、提高增殖倍数，在提高产能效率的同时降低血清等动物源性添加物的安全风险，本发明对于无血清细胞培养的工业化应用具有极强的现实意义。
9.根据本发明的实施例，所述dmem/f12培养基包含：原料名称重量份l-丙氨酸13.45l-盐酸精氨酸147.50l-门冬酰胺22.50l-天门冬氨酸19.65l-半胱氨酸盐酸盐一水17.50l-胱氨酸二盐酸盐31.30l-谷氨酸22.35l-谷氨酰胺365.06甘氨酸26.75l-盐酸组氨酸一水31.50l-异亮氨酸54.55l-亮氨酸59.00l-盐酸赖氨酸91.27l-甲硫氨酸17.29l-苯丙氨酸35.47l-脯氨酸117.25l-丝氨酸37.25
l-苏氨酸53.48l-色氨酸19.02l-酪氨酸二钠盐无水55.30l-缬氨酸52.94苯酚红8.10氯化钠6999.50一水磷酸二氢钠62.56二水氯化钙154.50五水硫酸铜0.001氯化钾311.80六水氯化镁59.20无水硫酸镁48.84无水磷酸氢二钠71.00七水硫酸锌0.43七水硫酸亚铁0.42d-无水葡萄糖3151.00d-生物素0.004氯化胆碱8.98d-泛酸钙2.24叶酸2.65次黄嘌呤1.95肌醇12.60亚油酸0.04硫辛酸0.11烟酰胺2.021，4-丁二胺二盐酸盐0.08维生素b60.03维生素b20.22丙酮酸钠55.00维生素b12.17胸苷0.37维生素b120.68盐酸吡哆醛2.00九水硝酸铁0.05在本发明的另一方面，本发明提出了一种扩增病毒的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：按照前面所述的方法，对bhk21细胞进行培养，得到培养液；和在所述培养液中接种病毒，以便对所述病毒进行扩增。由此，采用根据本发明实施例的利用无血清培养基培养bhk21细胞的方法培养所得bhk21细胞培养液有助于实现病毒增殖，提高病毒滴度，从而更好地应用于疫苗病毒的扩增生产。
10.根据本发明的实施例，所述病毒包括新城疫病毒、口蹄疫病毒和狂犬病病毒中的至少之一。
11.在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备疫苗的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：按照前面所述扩增病毒的方法扩增病毒。由此，利用根据本发明实施例的方法可以获得高病毒滴度且高产量的疫苗，并且制备方法操作简便，产能高，适于规模化生产应用。
12.根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将所述扩增病毒所得到的病毒液进行减毒或者灭活处理，以便获得所述疫苗。由此，可以避免病毒进入机体产生不良反应。
13.在本发明的又一方面，本发明提出了一种疫苗。根据本发明的实施例，所述疫苗是通过前面所述制备疫苗的方法获得的。由此，根据本发明实施例的疫苗安全、有效，接种后不良反应小，适于推广应用。
14.术语“疫苗”是指含有有效诱导受试者的抗特定病原体或疾病的治疗程度的免疫性的活性组分的试剂或组合物，在此是治疗性地针对感染病毒所引发的疾病，例如感染新城疫病毒、口蹄疫病毒或狂犬病病毒所引发的疾病，具体如鸡瘟、狂犬病、口蹄疫等。
15.本发明疫苗还可以包含药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂和/或佐剂。在本上下文中，术语“药学上可接受的”意指该稀释剂、载体、赋形剂或佐剂在所采用的剂量和浓度下不会在它们给予的受试者中引起任何不必要或不良的影响。佐剂用以进一步提高机体的免疫应答，例如可以为铝盐佐剂、il-12、脂多糖(lps)等。
16.术语“受试者”包括但不限于人、鼠、鸡、牛、羊、狗、猪等。
17.在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述疫苗在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或者与预防病毒相关疾病。
18.本发明的疫苗可用于处于病毒相关疾病或症状风险或患有这种疾病或症状的对象中治疗、减轻或预防这种疾病或症状，通过免疫治疗刺激所述对象的免疫应答而进行。免疫治疗可包括初始免疫及随后另外的如1、2、3或多次加强免疫。给药方式包括但不限于皮内、肌肉内等注射，或皮下、经皮或经黏膜投药，例如鼻内、经口及其类似途径。
19.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
20.下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
21.实施例11、配制培养基1.1 dmem/f12培养基原料名称mg/ll-丙氨酸13.45l-盐酸精氨酸147.50
l-门冬酰胺22.50l-天门冬氨酸19.65l-半胱氨酸盐酸盐一水17.50l-胱氨酸二盐酸盐31.30l-谷氨酸22.35l-谷氨酰胺365.06甘氨酸26.75l-盐酸组氨酸一水31.50l-异亮氨酸54.55l-亮氨酸59.00l-盐酸赖氨酸91.27l-甲硫氨酸17.29l-苯丙氨酸35.47l-脯氨酸117.25l-丝氨酸37.25l-苏氨酸53.48l-色氨酸19.02l-酪氨酸二钠盐无水55.30l-缬氨酸52.94苯酚红8.10氯化钠6999.50一水磷酸二氢钠62.56二水氯化钙154.50五水硫酸铜0.001氯化钾311.80六水氯化镁59.20无水硫酸镁48.84无水磷酸氢二钠71.00七水硫酸锌0.43七水硫酸亚铁0.42d-无水葡萄糖3151.00d-生物素0.004氯化胆碱8.98d-泛酸钙2.24叶酸2.65次黄嘌呤1.95肌醇12.60亚油酸0.04硫辛酸0.11
烟酰胺2.021，4-丁二胺二盐酸盐0.08维生素b60.03维生素b20.22丙酮酸钠55.00维生素b12.17胸苷0.37维生素b120.68盐酸吡哆醛2.00九水硝酸铁0.051.2 sfm1培养基在dmem/f12培养基中添加如下成分：原料名称mg/l硝酸银0.000085氯化铝0.05275偏钒酸铵0.0003偏钒酸钠0.000002氯化镉0.001015六水氯化钴0.001315六水氯化铬0.00014五水硫酸铜0.014二氧化锗0.00027溴化钾0.00007碘化钾0.000085四水氯化锰0.000000124六水氯化镁79.5钼酸铵0.001875九水偏硅酸钠0.1965亚硒酸钠0.011氟化钠0.0023硫酸镍0.000065氯化铷0.00067氯化亚锡0.00005氧氯化锆0.0018乙酸钡0.000125氯化锂0.001重组人胰岛素2氢化可的松0.03酵母提取物1600
大豆蛋白胨2100小麦蛋白胨1000hepes3000f6810001.3 sfm2培养基组成与sfm1培养基的区别在于：将酵母提取物、大豆蛋白胨、小麦蛋白胨分别替换为麦芽提取物、木瓜蛋白酶大豆蛋白胨、土豆蛋白胨。
22.1.4 血清培养基在dmem/f12培养基中添加10%血清。
23.1.5 市售商品培养基按使用说明配制两款市售商品培养基，商品培养基1：健顺bhk21 sfm无血清培养基，商品培养基2：沃美bhk21 sfm无血清培养基。
24.2、细胞培养和检测在前面得到sfm1、sfm2培养基、血清培养基和商品培养基后，按照下列方式对bhk21细胞进行悬浮摇瓶培养：将细胞接种在250ml摇瓶中，在37℃、5％co2和110rpm的摇床培养箱内进行悬浮培养作为f1代，培养48小时，按照0.5
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106cells/ml的密度进行传代，并继续培养直到f5代培养结束。其中，在每代培养的开始时和结束时采用countstar biotech自动细胞计数仪对细胞的相关参数进行检测，具体的，所检测的细胞参数包括：一、每代培养开始时检测初始细胞密度、初始细胞存活率，培养48h的细胞密度、细胞存活率、结团率和细胞直径，上述指标均可通过countstar biotech自动细胞计数仪读取。
25.二、结果和分析采用sfm1培养基、sfm2培养基、血清培养基和商品培养基进行培养的相关参数检测结果总结如下：表1 sfm1培养基的实验结果表2 sfm2培养基的实验结果
表3 血清培养基的实验结果表4 商品培养基1的实验结果表5 商品培养基2的实验结果通过比较表1~5中的数据可以看出，采用sfm1培养基，48小时细胞密度平均可达5.89
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106cells/ml，细胞增殖11.8倍，与血清培养基相比提高了126%，细胞结团率比血清培养基降低了19%；采用sfm2培养基，与血清培养基相比虽细胞密度平均提高了47%，细胞结团率平均降低了12%，但48h细胞密度仍然很低（平均值为3.73
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106cells/ml）。
26.sfm1的培养效果均优于两款商品培养基，与商品培养基1相比，48h细胞密度提高了19.38%，细胞结团率降低了5.96%；与商品培养基2相比，48h细胞密度提高了29.69%，细胞
结团率降低了8.84%。
27.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。