一种人胎膜组织单细胞快速解离试剂盒、解离方法及应用与流程

技术特征：
1.一种人胎膜组织单细胞快速解离试剂盒，其特征在于，包括如下组分：酶i、酶ii、组合酶、稀释缓冲液、中和缓冲液、洗涤缓冲液和3
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红细胞裂解缓冲液；其中：所述酶i为中性蛋白酶；所述酶ii为胰蛋白酶；所述组合酶包括iv型胶原蛋白水解酶、中性蛋白酶和脱氧核糖核酸酶i；所述稀释缓冲液为d-hbss平衡盐溶液，所述d-hbss平衡盐溶液包括nacl、kcl、na2hpo4、na2hpo4·
12h2o、d-glucose和无菌去离子水；所述中和缓冲液包括胎牛血清和d-hbss平衡盐溶液；所述洗涤缓冲液包括牛血清白蛋白和d-hbss平衡盐溶液；所述3
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红细胞裂解缓冲液包括nh4cl、khco3、na2edta和无菌去离子水。2.根据权利要求1所述人胎膜组织单细胞快速解离试剂盒，其特征在于，包括如下浓度的组分：所述中性蛋白酶的浓度为1.2~2.4 u/ml；所述胰蛋白酶的浓度为0.25~0.5wt.%；所述组合酶中，所述iv型胶原蛋白水解酶的浓度为1~3mg/ml、所述中性蛋白酶的浓度为2.4 u/ml、所述脱氧核糖核酸酶i的浓度为25μg/ml；所述nacl的浓度为0.4mg/ml、所述kcl的浓度为8mg/ml、所述na2hpo4的浓度为0.35mg/ml、所述na2hpo4·
12h2o的浓度为0.06mg/ml、所述d-glucose的浓度为1mg/ml；所述胎牛血清的浓度为10wt.%；所述牛血清白蛋的浓度为1~4wt.%；所述nh4cl的浓度为150mm、所述khco3的浓度为10mm、所述na2edta的浓度为0.1mm。3.一种解离方法，其特征在于，采用权利要求1中所述的人胎膜组织单细胞快速解离试剂盒对人胎膜组织进行解离，所述解离方法包括如下步骤：i预处理：将胎膜组织转移至培养皿中去除表面残留血块，并进一步将胎膜分离为羊膜与绒毛膜-蜕膜两部分；ii羊膜组织的单细胞解离：s1、将羊膜组织剪碎并转移至装有酶i的ep管中，密封后将ep管转移至水浴中静置进行第一次消化；s2、将预消化后的羊膜取出并转移至装有酶ⅱ的离心管中，在水浴中静置进行第二次消化，完成后将剩余羊膜组织取出待用，并得到消化液；s3、向所述消化液中加入中和缓冲液，混匀后过滤以除去残留的微组织块，得到细胞悬液；s4、对所述细胞悬液离心除去上清液，得到细胞沉淀；向所述细胞沉淀中加入洗涤缓冲液，离心后再次收集细胞沉淀并采用洗涤缓冲液重悬，完成后待用；s5、将步骤s2取出的剩余羊膜组织转移至离心管中，并加入组合酶进行第三次消化，待消化完全后加入中和缓冲液依次进行混匀、过滤、离心，收集细胞沉淀；s6、向步骤s5收集的细胞沉淀中加入洗涤缓冲液，混匀后离心除去上清液，再次收集细胞沉淀后采用洗涤缓冲液重悬，完成后待用；
iii绒毛膜-蜕膜组织的单细胞解离：ss1、将绒毛膜-蜕膜组织剪碎并转移至装有酶ⅰ的离心管中，并将离心管放置在水浴中孵育，完成后去除上清液再加入组合酶；ss2、将离心管再次放入至水浴中静置孵育，完成后加入酶ii混匀后继续水浴；ss3、消化完全后向离心管中加入中和缓冲液，混匀后依次过滤、离心，收集细胞沉淀；ss4、使用洗涤缓冲液重悬细胞沉淀，离心后再次收集细胞沉淀并使用洗涤缓冲液重悬，完成后待用；iv红细胞裂解：sss1、将步骤s4、步骤s6和步骤ss4得到的细胞悬液混合，离心后得到细胞沉淀；sss2、采用洗涤缓冲液对细胞沉淀重悬，并加入3
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红细胞裂解缓冲液；sss3、裂红结束后离心收集细胞沉淀，并采用洗涤缓冲液将细胞沉淀进行清洗，去除上清液后，再次使用洗涤缓冲液重悬细胞，经过滤即得到胎膜单细胞悬液。4.根据权利要求3所述解离方法，其特征在于，步骤s2中，所述第一次消化的方式为：在37℃下静置消化5~15 min，期间每5~10 min从水浴中取出并摇晃混匀。5.根据权利要求3所述解离方法，其特征在于，步骤s2中，所述第二次消化的方式为：在37℃下静置消化15~25 min，期间每5~10 min从水浴中取出并摇晃混匀。6.根据权利要求3所述解离方法，其特征在于，步骤s5中，所述第三次消化的方式为：在37℃下静置消化20~30min，期间每5~10 min从水浴中取出并摇晃混匀。7.权利要求3~6中任一项所述解离方法得到的单细胞悬液。8.权利要求7所述的单细胞悬液在单细胞测序、流式/磁性细胞分选中的应用。

技术总结
本发明涉及一种人胎膜组织单细胞快速解离试剂盒、解离方法及应用。所述人胎膜组织单细胞快速解离试剂盒包括如下组分：酶I、酶II、组合酶、稀释缓冲液、中和缓冲液、洗涤缓冲液和3


技术研发人员：曹家松 林启妹 常颖 王舒琪 王奕欣 申永梅 刘春柳 幺世悍
受保护的技术使用者：优智嘉(天津)生物科技有限公司
技术研发日：2022.10.20
技术公布日：2022/11/18