一种利用红花细胞生产绿原酸类物质的生物诱导子及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及植物细胞培养技术领域，具体涉及一种利用红花细胞生产绿原酸类物质的生物诱导子及其制备方法和应用。


背景技术：

2.绿原酸类物质普遍存在于植物当中，在金银花、杜仲、菊花、咖啡、栀子等植物中含量丰富，目前绿原酸主要从野生植物中提取。虽然植物是一种可再生资源，但植株生长速度慢、栽培困难、有效成分含量低且易受到地理、季节、环境变化等诸多因素的影响，从而使得从野生植物资源中提取有效成分收到限制，因此需要一种可代替的生产方式。
3.植物细胞悬浮培养，是指将植物组织或小的细胞聚集体接种于液体培养基中，并进行振荡培养的过程。其通常挑取植物生长迅速、疏松、状态优良的愈伤组织进行悬浮培养，并通过类似于微生物发酵的悬浮培养手段，在短时间内获得大量的生长状态良好的植物细胞，添加诱导子从而获得可观产量的有效次级代谢产物，比如绿原酸类。因其周期短、可控性强、受自然条件影响小、操作方便、重复性好、易于工业化生产等诸多优点，已被理想化应用于一些重要生物活性物质和自然产物的小规模生产。
4.诱导子可分为生物诱导子与非生物诱导子两种。生物诱导子包括来自真菌、细菌或草食动物诱导子、植物细胞壁碎片、植物被病原体或草食动物入侵时释放的化学物质等，其功能与受体偶联，通过激活或抑制某些酶或离子通道起作用。非生物诱导子是指本身并不是植物细胞中的天然成分，却可以通过化学或物理途径使植物产生防御反应，进而触发植物次生活性物质的合成。其种类主要包括植物生长调节剂、水杨酸、茉莉酸甲酯、重金属盐、稀土元素等。
5.本发明是采用新型诱导子脱氮假单胞菌与植物细胞悬浮培养技术相结合，从而找到一种高效生物合成绿原酸类物质的方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的是为了开发出一种新型诱导子，利用植物细胞培养技术生产绿原酸类物质的方法，解决传统植株生长周期长、原料资源短缺、受环境影响大、长期依靠茉莉酸甲酯(meja)、水杨酸等诱导次级代谢产物的问题。
7.本发明的技术方案为：
8.一种利用红花细胞生产绿原酸类物质的生物诱导子，为灭活的脱氮假单胞菌(pseudomonas denitrificans)。
9.其制备方法是：
10.(1)菌种活化
11.挑取保藏于-80℃低温低温冰箱中的菌株脱氮假单胞菌(pseudomonas denitrificans)菌丝体接种到经无菌处理的固体培养基斜面上，28℃培养3天进行菌种活
化；所述固体培养基的组成为：可溶性淀粉10g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁1g/l，氯化钠1g/l，硫酸铵2g/l，碳酸钙2g/l，硫酸亚铁0.001g/l。七水硫酸锌0.001g/l，酵母提取物0.5g/l，蛋白胨1g/l，琼脂20g/l，ph通过naoh控制在7.2，并预先在115℃条件下灭菌25min；
12.(2)诱导子脱氮假单胞菌摇瓶培养
13.从所述斜面上洗下菌丝体接入液体培养基中，260rpm，32℃培养28h；所述液体培养基的组成为：蔗糖40g/l，玉米浆20g/l，甜菜碱5g/l，硫酸铵1g/l，磷酸氢二铵2g/l，一水硫酸锰0.8g/l，六水氯化钴0.02g/l，氧化镁0.5g/l，dmbi 0.05g/l，七水硫酸锌0.08g/l，碳酸钙1g/l，ph通过naoh控制在7.2，并预先在115℃条件下灭菌25min；
14.(3)诱导子制备
15.取步骤(2)所得菌丝体进行研磨，所得菌体用磷酸缓冲液pbs溶液溶解，将得到混合液在121℃条件下灭菌25min。
16.上述方法制备得到的灭活的脱氮假单胞菌(pseudomonas denitrificans)可用于红花悬浮细胞生产绿原酸类物质，优选方法是：将红花悬浮细胞培养6天，在无菌条件下，将100mg/l的脱氮假单胞菌加入培养基中，26℃，115rpm转速下振荡培养3天。
17.本发明的技术原理：
18.本发明在红花悬浮细胞中添加新型诱导子—灭活的脱氮假单胞菌，从而作为诱导子，促进红花细胞中次级代谢产物—绿原酸类物质的合成积累。
19.红花悬浮细胞培养至对数生长期，将制备的不同浓度的新型诱导子—灭活的脱氮假单胞菌和不同浓度的普通的诱导子—茉莉酸甲酯、水杨酸和酵母提取物添加至红花细胞液体培养基中，诱导子的诱导时间分别设置1、2、3、4天，接下来利用高效液相色谱和液相色谱-质谱联用仪检测测定红花细胞内绿原酸类物质的含量，从而得出最佳诱导子和作用时间。通过诱导子的添加更高效地促进红花胞内绿原酸类物质的合成。
20.本发明的有益效果：
21.1、由于不采用传统的整株材料，而是以红花植物细胞培养来代替生产绿原酸类物质，能节约资源，对保护野生资源、维护生态平衡和促进产业发展有重要意义；
22.2、形成的悬浮细胞有生长速度快、细胞活力强、易于控制、实验周期短操作简单，原料制备高效、后处理污染少，实验重复性好；
23.3、利用脱氮假单胞菌作为新型诱导子，其诱导作用大于茉莉酸甲酯(meja)、水杨酸(sa)、酵母提取物(ye)，在诱导植物细胞诱导次级代谢产物方面未见报道；
24.4、本发明添加的脱氮假单胞菌新型诱导子，打破了使用常规诱导子(水杨酸、meja、重金属盐、稀土元素)的壁垒，节约了实验成本；
25.5、本发明加入新型诱导子脱氮假单胞菌，绿原酸类物质的产量提高了2.68倍，含量提高至11％(每克干重)，为之后绿源类物质应用到化妆品及药用产业奠定了基础。
附图说明
26.图1：实施例所得的红花胞内物质lc-ms/ms分析总离子流图：采用nist14质谱数据库质谱数据库检索进行定性，采用色谱峰面积归一法进行相对定量；从图中可以看出有5-o-咖啡酰奎宁酸，3-o-咖啡酰奎宁酸，4-o-咖啡酰奎宁酸，3，5-二咖啡酰奎宁酸，4，5-二咖啡酰奎宁酸，3，4-二咖啡酰奎宁酸，4-糖苷-二咖啡酰奎宁酸等绿原酸类特征物质；
27.图2：实施例所得的不同诱导子浓度对红花细胞内绿原酸含量的影响，通过比较，脱氮假单胞菌对红花胞内绿原酸的积累量影响最大，单位含量最高，可达109
±
1.02mg/g(每克干重含量)；
28.图3：实施例所得的不同诱导子浓度对红花细胞生物量(细胞干重)的影响，通过比较，脱氮假单胞菌对红花细胞生物量的影响最小，干重最高，可达0.41g；图中纵坐标为绿原酸物质含量(每克干重含量)；
29.图4：实施例所得的诱导子不同的作用时间对红花胞内绿原酸含量的影响，通过比较，脱氮假单胞菌对红花胞内绿原酸的积累量影响最大，单位含量最高，可达109
±
1.02mg/g(每克干重含量)。
具体实施方式
30.下面通过具体实施例并结合附图对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。
31.本发明的实施例中所用的：
32.菌株名称：脱氮假单胞菌(pseudomonas denitrificans)，atcc 13867，由华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室保存。
33.细胞名称：红花(carthamus tinctorius l.)细胞，由华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室保存。
34.本发明实施例中所用的hplc和uplc-ms/ms分析方法如下：
35.流动相：0.05％正磷酸水溶液(a)和乙腈(b)；流速：1.0ml
·
min-1
；洗脱条件：0-50min，5
–
43％a；50-52min，43
–
80％a；52-55min，80
–
5％a；55-58min，5-5％a；色谱柱：waters symmetry c18柱(5μm，4.6
×
250mm)；柱温：40℃；检测波长：327nm；进样量：10μl。uplc-ms/ms的hplc条件同上，ms/ms的参数设置如下：扫描模式：正负离子；荷质比m/z扫描范围：100-1000；扫描速度：13000da/s；干燥气体：氮气；干燥气流速：10l
·
min-1
；干燥气温度：365℃；雾化器压力：50psi；毛细管电压： 4500v；锥孔电压：40v。
36.本发明的所用的主要试剂的名称、规格、生产厂家信息如下：
[0037][0038]
本发明的所用的主要仪器名称、规格及生产厂家的信息如下表：
[0039][0040]
数据统计
[0041]
数据以平均值
±
标准误差表示使用student’s t-检验(graphpad software inc.，san diego，ca，usa)。使用graphpadprism 8执行图形和数据统计分析。p《0.05被认为具有统计学意义。
[0042]
实施例
[0043]
(1)新型诱导子制备
[0044]
挑取保藏于-80℃低温冰箱中的菌株脱氮假单胞菌少量菌丝体接种到经无菌的固体斜面上，28℃培养3天进行菌种活化；
[0045]
诱导子脱氮假单胞菌摇瓶培养
[0046]
从新鲜斜面上洗下菌体接入装液量100ml的500ml液体培养基中，260rpm，32℃培养28h。
[0047]
固体培养基的组成为：可溶性淀粉10g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁1g/l，氯化钠1g/l，硫酸铵2g/l，碳酸钙2g/l，硫酸亚铁0.001g/l，七水硫酸锌0.001g/l，酵母提取物0.5g/l，蛋白胨1g/l，琼脂20g/l，ph通过naoh控制在7.2，并预先在115℃条件下灭菌25min后备用。
[0048]
液体培养基的组成为：蔗糖40g/l，玉米浆20g/l，甜菜碱5g/l，硫酸铵1g/l，磷酸氢二铵2g/l，一水硫酸锰0.8g/l，六水氯化钴0.02g/l，氧化镁0.5g/l，dmbi 0.05g/l，七水硫酸锌0.08g/l，碳酸钙1g/l，ph通过naoh控制在7.2，并预先在115℃条件下灭菌25min后备用。
[0049]
诱导子制备
[0050]
取发酵液于10ml离心管中，3000rpm离心10min，用去离子水洗涤2次，去上清，将沉淀放在研钵中研磨，研磨后的菌体用pbs溶液溶解，将得到混合液在121℃条件下灭菌25min后备用。
[0051]
(2)普通诱导子制备
[0052]
水杨酸诱导子(sa)制备：准确称取138.00mg水杨酸固体粉末，用适量蒸馏水溶解后，定容至10ml，配制成100mmol/l的母液。随后母液用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，备用；
[0053]
茉莉酸甲酯诱导子(meja)制备：准确吸取235.0μl茉莉酸甲酯，用无水乙醇定容至10ml，配制成100mmol/l的母液。随后母液用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，备用。
[0054]
(3)诱导子的添加
[0055]
将红花悬浮培养细胞培养至对数生长期，用于诱导子诱导实验，步骤如下：将已经培养6天的红花悬浮细胞，在无菌条件下，将加入不同浓度的诱导子加入培养基中，26℃，115rpm转速下振荡培养1、2、3、4天，测定不同浓度诱导子对红花悬浮培养细胞的生物量(干重)、悬浮细胞内绿原酸类物质含量的影响。各诱导子在培养液中的终浓度如下：sa：0、50、100、200、300、400μm；meja：0、50、100、200、300、400μm；ye：0、50、100、200、300、400mg/l；脱氮假单胞菌菌体浓度：0、50、100、200、300、400mg/l；每个处理组设置三个平行试验组。
[0056]
(4)产物的提取与鉴定
[0057]
将培养6、7、8、9天后的红花悬浮细胞置于60℃烘箱中热风干燥24h至恒重，准确称取100mg细胞粉末于10ml离心管中，加入2ml 70％甲醇溶液，水浴超声50min。随后4000r/min离心5min，取上清，上清经0.22μm有机系滤膜过滤后鉴定组分。检测鉴定仪器为安捷伦液相色谱-质谱联用仪。仪器参数:选取负离子扫描模式；质荷比m/z扫描范围：100-1000；扫描速度：13000da/s；干燥气体：氮气；干燥气流速：10l/min；干燥气温度：365℃；雾化器压力：50psi；毛细管电压： 4500v；锥孔电压：40v。
[0058]
(5)绿原酸类物质含量测定
[0059]
采用nist14质谱数据库质谱数据库检索进行定性，采用色谱峰面积归一法进行相对定量。
[0060]
从结果可以看出，在植物细胞培养水平上培养第6天添加100mg/l新型诱导子—灭活的脱氮假单胞菌，诱导3天后，红花细胞中绿原酸类物质的含量最高。与普通诱导子(meja、sa和ye)中绿原酸类物质含量的对比，新型诱导子添加后，绿原酸类物质含量提高了2.68倍(每克干重含量)，单位含量达到109
±
1.02mg/g(干重)。
[0061]
脱氮假单胞菌诱导子的加入会对细胞生物量造成抑制作用，并且脱氮假单胞菌浓度越高，对细胞生物量的抑制作用越强，但与其他诱导子相比，脱氮假单胞菌的抑制作用最低。本方法的创新点在于灭活的脱氮假单胞菌诱导子能够显著增加细胞中绿原酸类物质总含量，并且随着脱氮假单胞菌浓度的增加而呈现先增加后下降的趋势。在脱氮假单胞菌作用3天时，100mg/l灭活的脱氮假单胞菌作用下的细胞中绿原酸类物质的单位含量达到最大值109
±
1.02mg/g(干重)。是对照组的2.68倍(每克干重含量)。结果见图2、3、4。
[0062]
以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。