用于纯化包含目标物质的液体的设备
1.本发明涉及用于处理包含目标物质的液体、特别是包含生物分子例如重组多肽的液体的单元、流路组件和设备。
2.许多生物分子，尤其是重组多肽和核酸，如质粒(pdna)，已吸引了很多关注，特别是对于治疗应用。这样的生物分子通常通过培养已经改造以表达所需生物分子的重组宿主细胞来产生。然后通过通常包括许多单元操作的方法来从培养基回收生物分子。
3.用于处理包含目标物质的溶液的设备是本领域已知的。然而，用于此类化合物的商业制造中的设备非常庞大，并且需要大量的占地面积和基础设施。另外，虽然可对若干单元操作实现一定的设备通用性，但针对某些单元操作如病毒灭活和/或超滤的设备的设计与针对例如层析纯化的设备的设计差别很大。这意味着要么需要更多的空间来容纳两套或更多套设备，要么各级设备的互操作性和控制异常复杂。此外，操作员需要针对所采用的每种不同类型的设备接受培训。因此，简单化且广泛适用的设备将是合乎需要的。还期望识别出使得能够采用共同的流路进行多个处理步骤的设备。
4.根据本发明的第一方面，提供了用于将包含目标物质和杂质的液体原料转化为含有经纯化的目标物质的产物流和任选地一个或多个包含至少一些所述杂质的废物流的设备，该设备包含至少两个处理单元，所述处理单元串联布置使得第二和任何后续单元的进料流包含来自下游单元的产物流，其中每个处理单元包含以下部件(i)至(vi)：(i) 用于液体原料的入口(1)；(ii) 多入口流量控制器(4)，其包含两个或更多个可变流量入口阀(4a)，用于以所需比率提供至少两个液体；(iii) 混合措施(8)；(iv) 用于进行将至少一些所述杂质与所述目标物质分离的处理操作的装置(12)；(v) 用于使液体流动通过所述单元的措施(6)；和(vi) 可切换旁路组件(31)，用于使通行经过所述单元的液体流入到混合措施(8)中或绕过混合措施(8)。
5.本发明提供了一种设备，其可以制造规模执行，并提供了优于现有设备的许多优点，特别是在简单性、成本和易于操作性、较低操作员错误风险、更容易维护和较少备件库存的方面。
6.在本说明书中，短语“处理单元”常缩写为“单元”，两者可互换使用。
附图说明
7.在附图中：图1为可在本发明的设备中的一个处理单元的示意图。
8.图2示意性地示出了可在本发明的单元中的流路组件。
9.图1在下面的实施例部分中更详细地描述。
10.图2示意性地示出了可在一个或两个或更多个(优选至少一半，更优选全部)处理
单元中使用的流路组件。该流路组件包含通过管连接的标识部件，所述管例如为由可通过γ辐照灭菌的材料(例如，塑料材料)制成并优选可在每次使用后弃置或清洗并重新使用的管。该流路组件包含用于六种不同液体(例如，缓冲液、酸性溶液、碱性溶液、有机溶剂等)的六个入口(2a)至(2f)、和用于另一液体例如水的第七入口(2g)。六种液体通行经过相应的阀(3a，3b)、(3c，3d)和(3e，3f)而给出由六种液体按所需比例组成的三个液体流，这些液体流进给到多入口流量控制器(4)中。在此实施方案中，流路组件还包含第四管，该管装配有阀(3g)，用于(从入口(2g))向多入口流量控制器(4)中引入另外的液体(例如，水)。装配有阀(3)的入口(1)具有止回阀(3h)，该止回阀(3h)可用于向流路组件中引入包含目标物质(例如，单克隆抗体)和杂质的液体原料。在多入口流量控制器(4)的下游，液体流通行经过用于使液体流动的措施(6)(例如，可附接到位于流路外部的电机的叶轮叶片或泵头)、压力传感器块(7)并然后进入可切换旁路组件(31)中。可切换旁路组件(31)具有三个连接，一个引入装配有气泡捕集器的混合措施(8)，一个从混合措施(8)引出，而一个通向装置进料的入口(12a)。在流动通过用于实现处理操作的装置(12)(装置(12)在图2中未示出)后，经纯化的液体原料通行经过出口(12b)并经过组合的压力传感器、ph和uv传感器(32)。最后，经纯化的液体原料通行经过出口管线，该出口管线包含一系列阀(17)、(19)和(20)，这些阀使得能够控制进料离开出口(18)、废物流出口(21)及产物流出口(22)之间的流动。
11.包含如上文关于单元所定义的部件(i)至(iii)、(v)和(vi)的流路组件形成本发明的进一步的特征，包含部件(i)至(vi)的单元及包含流路组件和部件(iv)的单元也是如此。
12.每个单元通常进行一个处理操作。
13.处理单元的数量不受特别限制，并且在很大程度上取决于将液体原料转化为适合所需目的(例如配制成药物)的形式所需的纯化步骤。在一些实施方案中，设备包含两个单元(例如，用于进行两个处理操作)。在其他实施方案中，设备包含多于两个单元，例如(至少)三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或更多个单元，优选每个单元均具有上述特征(i)至(vi)。
14.尽管设备还可包含两个或更多个并联操作的单元，但优选所有的单元串联布置(例如，串联连接，如果需要，任选地在每个单元之间有隔断袋(break bag))。在许多高度优选的实施方案中，在每个单元中进行的过程操作不同于在所有其他单元中使用的过程操作。因此，虽然设备可例如含有多于一个用于进行层析的单元，但每个这样的层析单元(或使用其的方式)优选不同于用于进行层析的其他单元(一个或多个)。
15.在某些实施方案中，每个单元均包含流路组件，该流路组件与至少一半、更优选所有的其他单元中的流路组件实质上相同。
16.优选地，每个单元在设备操作期间制备该单元的混合生物处理液(原位)。这样将避免操作员使用错误的、外部制备的意图用于不同过程操作的生物处理液的风险。
17.在某些实施方案中，每个单元均包含与其他单元实质上相同的流路组件。
18.在一个实施方案中，来自每个单元的产物流被直接进给到下一个单元中(当有下一个单元时)。在其他实施方案中，将一个或多个单元的产物流进给到储存容器(例如，“隔断袋”)中并然后随后作为下一个单元(如果有的话)的原料使用通常是方便的。这样，人们可在产物流进入下一个单元之前对其进行测试、暂停过程等等。
19.第一单元的原料也可由储存容器供给，或如果需要，其可直接由细胞培养设备例如生物反应器供给。合适的储存容器的实例包括罐和袋。
20.用于液体原料的入口(1)通常包含管，管优选装配有阀(3)和任选地止回阀(3h)。止回阀(3h)可用于避免液体原料被流动通过多入口流量控制器(4)的液体(一个或多个)所污染。用于第二和任何后续处理单元的液体原料通常包含来自前一处理单元的产物。
21.多入口流量控制器(4)优选包含可变流量入口阀(4a)、更优选间歇流量入口阀，其调节至少两个液体(例如，2、3、4、5、6、7或8个液体)通过多入口流量控制器(4)的流量。多入口流量控制器(4)包含至少2个可变流量入口阀(4a)，并在许多情况下包含至多8个、如3、4、5、6或7个可变流量入口阀(4a)。可变流量入口阀(4a)可各自具有相同的尺寸，或者可变流量入口阀(4a)中的一个或多个可具有不同的尺寸。在某些优选的实施方案中，从每个可变流量入口阀(4a)到多入口流量控制器(4)的出口测量的体积对于每个可变流量入口阀是相同的，并且高度优选从每个可变流量入口阀(4a)到多入口流量控制器(4)的出口测量的体积和路径长度两者对于每个可变流量入口阀都是相同的。
22.本发明中采用的多入口流量控制器(4)还包含至少一个出口，并且虽然可存在两个或更多个出口，但优选采用单个出口。
23.可变流量阀(4a)可在其中液体保持能够流动的相对低的第一流速与较高的至少第二流速之间调节流量。在优选的实施方案中，可变流量入口阀(4a)为间歇可变流量入口阀，其防止在第一位置中的流动，但允许在至少第二位置中的流动。最优选地，所有的阀均为间歇流量阀。阀可包含本领域已知的致动器，如气动致动器，或优选地电磁致动器。
24.优选地，多入口流量控制器(4)的可变流量入口阀(4a)最优选由可编程控制单元控制，以调节这些阀的打开和关闭，从而实现所需的相对量的输入液体流动通过多入口流量控制器。这优选通过以预定的时间段或循环速率循环通过多入口流量控制器(4)中的可变流量入口阀(4a)、并根据生成所需组合物需要的循环时间的比例调节阀的打开或关闭来实现。循环速率可以是恒定的或变化的。最优选地，采用间歇流量入口阀，并控制为使得在操作中在任何给定的时间只有一个阀(4a)是打开的。在许多实施方案中，多入口流量控制器(4)的循环速率保持恒定，并且输入液体的所需相对量保持一致。
25.在许多实施方案中，采用多个循环。所采用的循环次数将取决于诸多因素如过程的持续时间、被处理的液体的体积、流速和设备的最大工作压力。在某些实施方案中，可采用至少10个循环，如至少50、100、500、750、1000、1500、2000、3000、5000、7500、10000或更多个循环。
26.应认识到可采用一系列循环频率。在许多情况下，频率小于100hz，通常小于50hz，一般小于10hz，并优选小于5hz。在某些优选的实施方案中，频率为2hz或更小，最优选1hz或更小，如0.05至0.5hz。
27.虽然至少两个液体的混合(例如，以制备生物处理液，或将液体与液体原料混合)可通过将通过多入口流量控制器(4)出口的液体流简单地合并、任选地与用于使液体流动通过该单元的措施(6)的作用相组合来实现，但该单元包含混合措施(8)，优选混合室，所述混合室优选包含静态混合器、最优选延时分流静态混合器。
28.所述至少两个液体中之一任选地为液体原料。
29.在许多实施方案中，混合措施(8)位于用于使液体流动通过该单元的措施(6)的下
游和用于进行处理操作的装置(12)的上游。在一些优选的实施方案中，混合措施(8)包含气泡捕集器。
30.混合措施(8)优选适于将液体原料与一个或多个液体合并以产生装置进料。混合措施(8)优选还适于将至少两个其他液体合并以制备生物处理液。
31.每个单元可进行的处理操作包括层析、病毒灭活、过滤(例如，病毒去除)、重折叠、超滤、渗滤、微滤、浓缩和/或进行缓冲液交换(缓冲液更换)、在线调节和重折叠。
32.在一些实施方案中，设备包含至少两个用于进行目标物质的层析纯化的单元，在许多情况下甚至包含至少三个用于进行目标物质的层析纯化的单元。用于进行目标物质的层析纯化的第一单元优选包含亲和层析柱，例如，蛋白质a亲和柱。用于进行目标物质的层析纯化的第二单元优选包含阴离子交换层析柱。用于进行目标物质的层析纯化的第三单元，当存在时，优选包含阳离子交换层析柱。
33.因此，在一个优选的实施方案中，设备包含串联布置的以下单元(优选以所列的顺序)，每个单元包含部件(i)至(vi)，并且每个单元的产物进料(除了最后一个单元外)用作下一个单元的原料：a. 用于进行目标物质的层析纯化的单元，优选通过亲和层析；和b. 用于灭活液体原料中可能存在的任何病毒的单元。
34.在另一个优选的实施方案中，设备包含串联布置的以下单元(优选以所列的顺序)，每个单元包含部件(i)至(vi)，并且每个单元的产物进料(除了最后一个单元外)用作下一个单元的原料：a. 用于进行目标物质的层析纯化的单元，优选通过亲和层析；b. 用于灭活液体原料中可能存在的任何病毒的单元；和c. 用于通过阳离子交换层析进行目标物质的层析纯化的单元。
35.在另一个优选的实施方案中，设备包含串联布置的以下单元(优选以所列的顺序)，每个单元包含部件(i)至(vi)，并且每个单元的产物进料(除了最后一个单元外)用作下一个单元的原料：a. 用于进行目标物质的层析纯化的单元，优选通过亲和层析；b. 用于灭活液体原料中可能存在的任何病毒的单元；c. 用于通过阳离子交换层析进行目标物质的层析纯化的单元；和d. 用于通过阴离子交换层析进行目标物质的层析纯化的单元。
36.在另一个优选的实施方案中，设备包含串联布置的以下单元(优选以所列的顺序)，每个单元包含部件(i)至(vi)，并且每个单元的产物进料(除了最后一个单元外)用作下一个单元的原料：a. 用于进行目标物质的层析纯化的单元，优选通过亲和层析；b. 用于灭活液体原料中可能存在的任何病毒的单元；c. 用于通过阳离子交换层析进行目标物质的层析纯化的单元；d. 用于通过阴离子交换层析进行目标物质的层析纯化的单元；和e. 用于去除任何灭活病毒的单元。
37.在另一个优选的实施方案中，设备包含串联布置的以下单元(优选以所列的顺序)，每个单元包含部件(i)至(vi)，并且每个单元的产物进料(除了最后一个单元外)用作
下一个单元的原料：a. 用于进行目标物质的层析纯化的单元，优选通过亲和层析；b. 用于灭活液体原料中可能存在的任何病毒的单元；c. 用于通过阳离子交换层析进行目标物质的层析纯化的单元；d. 用于通过阴离子交换层析进行目标物质的层析纯化的单元；e. 用于去除任何灭活病毒的单元；和f. 用于浓缩来自前一单元的产物流和/或进行来自前一单元的产物流的缓冲液交换的单元。
38.优选地，所述单元以本文列出的顺序串联布置，例如，在包含单元a.至g.的设备中，优选地，单元以a.、b.、c.、d.、e.然后f.的顺序串联布置。
39.优选地，这些单元中的至少一个(优选至少一半的单元、更优选所有单元)还包含位于部件(iv)上游的压力传感器。
40.优选地，这些单元中的至少一个(优选至少一半的单元、更优选所有单元)还包含位于部件(iv)下游的压力传感器。
41.优选地，这些单元中的至少一个(优选至少一半的单元、更优选所有单元)还包含位于部件(iv)下游的uv传感器。
42.优选地，这些单元中的至少一个(优选至少一半的单元、更优选所有单元)还包含位于部件(iv)下游的ph传感器。
43.优选地，这些单元中的至少一个(优选至少一半的单元、更优选所有单元)还包含位于部件(iv)下游的电导率传感器。
44.在一个优选的实施方案中，除了部件(iv)外，每个单元的至少75%的组成部分与设备的至少80%的其他单元中使用的组成部分相同。优选地，除了部件(iv)外，每个单元的至少85%的组成部分与设备的至少80%的其他单元中使用的组成部分相同。尤其优选地，除了部件(iv)外，每个单元的至少95%的组成部分与设备的至少80%、更优选至少90%的其他单元中使用的组成部分相同。在一个特别优选的实施方案中，除了部件(iv)外，每个单元的所有组成部分与设备的所有其他单元中使用的所有组成部分相同。为避免疑义，流动通过设备的液体不为设备的组成部分。这些实施方案是有利的，因为每个单元中的组成部分之间的高度共性意味着需要较少的备件库存。还此外，因为这些单元如此相似，故设备的日常维护得到简化，并且因为每个单元与设备的其他单元如此相似，故设备更易于操作(非常昂贵的目标物质被破坏的风险较低)。与使用来自多个制造商的非常不同的处理单元的现有技术大不相同，工程师避免了学习如何维护众多非常不同的处理单元的需要。每个单元中的部件(iv)通常不同于其他单元中的部件(iv)(使得每个单元可进行分立的处理操作)，因此有话语“除了部件(iv)外”。
45.在一个优选的实施方案中，除了装置(12)外，设备的所有单元实质上相同。在此实施方案中，装置(12)可在两个或更多个单元中相同，但更典型地，装置(12)从一个单元到下一个单元是不同的，例如如图1中所示意，使得每个单元可进行分立的处理操作。
46.用于装置进料的入口也可用于例如从多入口流量控制器(4)或从混合措施(8)接收生物处理液(一种或多种)。生物处理液可用于从液体原料去除杂质，例如作为层析中的调节剂或洗脱剂，作为灭活病毒的措施，作为通过过滤器洗涤目标物质的措施，等。
47.设备任选地还包含用于进行一种或多种以下处理操作的处理单元：层析、病毒灭活、过滤(例如，超滤、微滤、死端过滤和/或渗滤)、病毒去除、重折叠、浓缩和/或进行缓冲液交换、絮凝和在线调节。
48.可使用装置(12)进行的层析生物处理操作包括亲和层析(例如，蛋白质a亲和层析)、离子交换(阴离子交换和阳离子交换中任一或两者)层析、疏水相互作用层析(hic)、反相层析、膨胀床层析、混合模式层析、膜层析和尺寸排阻层析(sec)。在许多实施方案中，至少一个单元进行蛋白质a亲和层析的处理操作。用于进行层析操作的装置包括适宜的层析设备，如膜、纤维整料(fibre monolith)或树脂。进行层析的单元的数量和顺序将根据目标物质的性质来选择。
49.优选地，设备包含至少两个、更优选三个包含部件(i)至(vi)的用于进行目标物质的层析纯化的单元。在这种情况下，相对于在所有其他单元中使用的那些，在每个单元中进行的层析纯化优选使用不同的条件和/或向层析柱填充了不同材料(例如，不同的树脂、膜或整料)的层析柱。在一个特别优选的实施方案中，至少一个单元进行亲和层析，至少一个单元进行阳离子交换层析并且至少一个单元进行阴离子交换层析。
50.用于进行病毒灭活的处理操作的装置(12)通常包含储存容器，其中可在灭活任何存在的病毒的条件下储存包含目标物质的液体。在某些实施方案中，病毒灭活装置(12)的出口和入口可流体连接以产生再循环回路。在一个这样的实施方案中，设备装配有在“装置”入口与“装置”出口之间流体连接的容器或袋，并且设备出口中之一与多入口流量控制器(4)入口中之一流体连接。与液体原料入口(1)流体连接的装置(12)“入口”和“出口”之间的容器或袋由赋予流动的措施(6)(通常为泵)填充，或用通过其他多入口流量控制器(4)入口中的至少之一的至少一个其他液体调节。在某些实施方案中，所述容器或袋为混合容器或袋。生物处理液通过多入口流量控制器(4)的入口再循环到容器或袋，并返回到多入口流量控制器(4)的入口，因为包含目标物质的溶液由流体连接到多入口流量控制器(4)上的至少一个其他入口的至少一个另外的液体调节。
51.可使用本领域已知的条件通过多种技术进行病毒灭活。例如，使用层析柱、层析膜或能够在小于约4.0的ph、例如约3.0至约4.0的ph、优选约3.2至约3.9的ph、尤其是约3.4至约3.8的ph、更尤其是约3.45至约3.7的ph下孵育包含液体原料的流体的贮槽。优选地，液体原料在前述ph下保持至少25分钟的时间，例如约30分钟至1.5小时的时间、优选约30分钟至1.25小时的时间、更优选约0.75小时至1.25小时的时间、尤其是约1小时的时间。在每种情况下，选择的条件都使得目标物质不被损坏或破坏。
52.灭活病毒可通过过滤去除，例如使用正向流过滤器(nff)或切向流过滤(tff)过滤器，如美国专利号6,365,395中所述。在tff模式或nff模式中，去除灭活病毒的过滤在保留灭活病毒的条件下进行，通常使用平均孔隙直径为20至100纳米(nm)的膜。这样的膜将灭活病毒保留在膜表面上，同时允许目标物质通行经过膜。
53.用于去除灭活病毒的单元也可去除在病毒灭活步骤中存活下来的任何病毒。
54.可用于去除灭活病毒(连同任何保持活性的病毒)的代表性的合适的超滤膜包括由再生纤维素、聚醚砜、聚芳砜、聚砜、聚酰亚胺、聚酰胺、聚偏二氟乙烯(pvdf)等形成的膜，并称为viresolve.rtm.膜和retropore
tm
膜，可得自emd millipore (马萨诸塞州比尔里卡)。它们可以筒(nff)形式供给，如viresolve tm nfp病毒过滤器，或作为盒(对于tff)，如
pellicon
tm
盒，可得自emd millipore (马萨诸塞州比尔里卡)。
55.可使用装置(12)进行的过滤操作包括病毒、深层和绝对过滤，超滤，渗滤和微滤。在许多实施方案中，过滤装置(12)在装置入口和装置出口之间包含过滤器模块。过滤器模块可用附接到多入口流量控制器入口(4)的至少两个液体进料来冲洗和驱赶，并且包含目标物质的液体原料可流体连接到原料入口(1)。液体原料通过过滤装置(12)的处理通过用于赋予流动的措施(6)实现，该措施(6)流体连接到并位于多入口流量控制器出口(4)和原料入口(1)的下游及过滤装置(12)的上游。过滤器通常呈模块化形式并可采用纯化生物分子领域中已知的配置。
56.病毒过滤、深层过滤和绝对过滤过程操作是本领域已知的，并可使用市售的过滤装置进行。在许多实施方案中，一个或多个过滤装置被放置在装置(12)入口与出口之间，以进行过滤作为处理操作。在另一个实施方案中，在设备出口的下游布置另外的过滤装置，在某些实施方案中，这允许设备进行大多数的纯化步骤，如层析、病毒灭活、切向流过滤、病毒过滤或深层过滤，然后是设备外部的二次过滤操作。
57.可使用本发明的设备进行的切向流过滤(“tff”)单元操作包括常规的再循环tff和单程tff。在某些实施方案中，设备的出口和入口可流体连接以产生再循环回路，例如再循环的切向流过滤。在一个实施方案中，如本领域已知的，设备装配有tff模块，该模块在装置入口与装置出口之间包含平板、中空纤维或螺旋缠绕膜，并且来自tff模块的滞留物从设备出口中之一引导至含至少一个入口和一个出口的容器或袋上的流体连接的入口。容器或袋的出口与液体原料入口流体连接。容器或袋使用通过与容器或袋上的第二入口流体连接来向容器或袋中供给原料或液体的辅助措施而保持在恒定的液位。在另一个实施方案中，设备装配有tff模块，该模块在装置入口与装置出口之间包含平板、中空纤维或螺旋缠绕膜，并且来自tff模块的滞留物从设备出口中之一流体连接回到多入口流量控制器阀的入口中之一。在某些实施方案中，从设备出口到其入口的再循环回路含有隔断(break)容器或袋。包含目标物质的溶液或液体由用于赋予流动的措施(通常为泵)通过液体原料入口吸入到再循环回路中。滞留物再循环通过tff模块，优选通过多入口流量控制器入口中之一。可采用多入口流量控制器来将滞留物与至少一个其他液体混合。再循环tff的操作是本领域公知的，并通过设置错流速率和跨膜压力来控制。
58.在某些实施方案中，单程tff可配置有tff模块，该tff模块在装置入口与装置出口之间包含平板、中空纤维或螺旋缠绕膜，例如，如在wo2017/118835中描述的单程tff的情况。
59.在一些实施方案中，可采用单程和再循环tff的混合，其中在tff模块下游使用可变流量阀产生的滞留物被返回到进料容器。
60.根据本发明的设备任选还包含以下中的一种或多种：气泡捕集器、压力传感器、温度传感器、ph传感器、流速传感器、电导率传感器、空气传感器和uv传感器如紫外/可见多波长传感器。
61.用于使液体流动的措施(6)是本领域公知的，并包括对液体施加气压，尤其是惰性气体，如氮气或氦气。优选地，用于使液体流动通过单元的措施包括一个或多个泵。可采用的泵包括蠕动泵、隔膜泵、凸轮泵和离心泵。既可采用一次性的泵设计，也可采用可重复使用的泵设计。在许多优选的实施方案中，对进行单元操作的每个措施采用单个泵，其位于原
料与流量控制器(4)的出口之间的流体连接的下游。最优选地，泵位于装置(12)的上游。选择的泵的类型和尺寸通常取决于对设备的规模和设计参数适合的流量容量和压力分布。在某些高度优选的实施方案中，泵为四元隔膜泵。
62.流路组件中存在的措施(6)通常包含一个或多个叶轮，例如隔膜叶轮。它们可连接到用于驱动叶轮的措施例如位于流路组件外部的电机，并由该措施驱动，。
63.当有需要时，可切换旁路组件(31)可用于提供不让液体原料进入混合措施(8)的选择。这提供了该装置也可用于纯化在混合措施(8)中合并液体原料与生物处理液可能或将会损伤或降解目标物质的脆弱目标物质的优点。
64.可切换旁路组件(31)也可用于混合两个或更多个液体以制备生物处理液，然后可将其进给到装置(12)中以进行处理操作。
65.当装置(12)包含层析柱时，可切换旁路组件(31)将特别有用。可使用可切换旁路组件(31)来向层析柱(12)上装入含有目标物质和杂质的液体原料而不通行经过混合措施(8)，然后可使用混合措施(8)来制备生物处理液(其组成可使用多入口流量控制器(4)按需改变)，其充当加载在柱(12)上的目标物质的洗脱液。此外，当装置(12)进行超滤和/或渗滤的过程步骤时，绕过混合措施(8)有时可能是有用的，否则这些过程步骤中滞留体积和产物稳定性可能成问题。
66.可切换旁路组件(31)优选包含管和两个或三个阀，它们将液体原料和生物处理液的流动引导到混合措施(8)中，或引导向装置(12)而不通行经过混合措施(8)。
67.在本发明的一个特别的实施方案中，每个单元均包含流路组件，所述流路组件包含以下部件(i)至(vi)：(i) 用于液体原料的入口(1)；(ii) 多入口流量控制器(4)，其包含两个或更多个可变流量入口阀(4a)，用于以所需比率提供至少两个液体；(iii) 混合措施(8)；(iv) 用于向装置(12)进给液体以进行处理操作的出口和用于从装置(12)接收液体的入口；(v) 用于使液体流动通过流路组件的措施(6)；和(vi) 用于使液体流入到混合措施(8)中或绕过混合措施(8)的可切换旁路组件(31)。
68.该流路组件形成本发明的一个特征。
69.在流路组件上：优选部件(v)在部件(iii)的上游和部件(ii)的下游；优选部件(iii)在部件(ii)的下游；优选流路组件由塑料材料构造；优选流路组件由允许通过γ辐射对组件灭菌的材料构造，例如有机硅，尤其是编织有机硅、聚乙烯或聚丙烯；在另一个实施方案中，流路组件由不锈钢构造。优选地，流路组件是无菌的。
70.优选地，流路组件相应还包含一个或多个用于接收电导计、ph传感器和/或压力传感器的块。优选地，所述一个或多个块中的至少一个位于措施(6)的下游和混合措施(8)的上游。此外，优选所述一个或多个块中的至少一个位于装置(12)的下游。在一个尤其优选的实施方案中，所述一个或多个块中的至少一个位于装置(12)的下游并适于接收电导计、ph计和压力传感器。
71.包含前述流路组件和优选地用于进行将至少一些杂质与目标物质分离的处理操作的装置(12)的单元形成本发明的又一个方面。
72.根据本发明的设备优选还包含用于向流动通过装置(12)的液体施加另外的压力(即，除了由用于赋予流动的措施(6)提供的压力外)的措施，所述措施位于装置(12)的下游。用于施加另外的压力的措施是本领域已知的，并包括夹管阀、隔膜阀，且可变位置隔膜阀尤其优选。
73.在一个优选的实施方案中：(a) 每个单元均包含流路组件；和(b) 在至少一半的单元(优选所有单元)中使用的流路组件具有实质上相同的配置。
74.用于制造流路组件的可更换管优选由塑料材料构造，例如有机硅，尤其是编织有机硅。
75.优选地，通过每个单元的流路组件与通过所有其他单元的流路组件实质上相同。
76.在某些实施方案中，一个或多个单元(优选所有单元)包含由在需要更换之前允许大量次数重复使用的材料(例如不锈钢)构造的多次使用流路组件。
77.在某些实施方案中，一个或多个单元(优选所有单元)包含一次性使用的流路组件，其优选由设计具有有限寿命并用作一次性消耗品的材料例如塑料材料构造，例如有机硅(尤其是编织有机硅)、聚乙烯或聚丙烯。
78.在许多实施方案中，每个处理操作在可编程控制单元、优选计算机的控制下进行。在一些实施方案中，单个控制单元控制两个或更多个处理操作。在其他实施方案中，每个处理操作都在单独的控制单元的控制之下。在这些其他实施方案中，优选控制单元采用通用的编程语言，这使得能够简化控制单元之间的通信。
79.在一个优选的实施方案中，通过合并至少三个液体来提供生物处理液，所述至少三个液体中的至少两个(优选全部)各自通过合并至少两个其他的液体(例如使用阀(3a)和(3b)或(3c)和(3d))来提供。此合并优选在混合措施(8)中进行。所述至少三个液体可分别通过合并液体(2a)和(2b)、(2c)和(2d)及(2e)和(2f)来制备。
80.一个单元中使用的生物处理液的组成可在整个过程中保持相同，或组成可在过程中改变。例如，生物处理液的组成可在过程中逐渐或逐步改变，特别是当单元包含层析柱并且生物处理液充当洗脱液时。
81.可用于制备生物处理液的液体(例如，所述至少两个液体)包括本领域已知的用于进行适宜的处理操作的那些。这样的液体的实例包括酸性、中性和碱性溶液，例如具有2.5至14范围内的ph的那些，以及各种浓度下的各种盐的溶液。实例包括包含以下中的一种或多种的水溶液：氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵、磷酸、硫酸、盐酸或乙酸；盐类，例如盐浓度高达约3m的水溶液，包括钠盐、钙盐、钾盐和铵盐，例如磷酸盐、氯化物、乙酸盐、柠檬酸盐和硫酸盐；缓冲剂，其实例是本领域公知的；还原剂(例如，dtt (dl-二硫苏糖醇)和tcep ((三(2-羧乙基)膦))；氨基酸(例如，组氨酸、精氨酸和甘氨酸)；洗涤剂(例如，tween
tm 20和triton
tm-x100)；水混溶性有机溶剂，例如多元醇，例如甘油和聚乙二醇；以及包含前述中两种或更多种的混合物。
82.可使用本发明的单元、设备和流路组件处理的目标物质包括生物分子，例如pdna；
细胞治疗、疫苗例如病毒疫苗、基因治疗产品、糖、包涵体，特别是包含多肽的包涵体；和尤其是重组多肽。
83.pdna可为多种形式中的一种或多种，如超螺旋、线型和开环(即，缺口或松弛)同种型。超螺旋pdna同种型具有共价闭合环状形式，并且pdna在宿主细胞中因宿主酶系统的作用而呈负超螺旋。在开环同种型中，pdna双链的一条链在一处或多处断裂。
84.产生pdna的方法是本领域公知的。pdna可以是天然的或人造的，例如，带有外源dna插入片段的克隆载体。在许多实施方案中，pdna在1千碱基至50千碱基的大小范围内。例如，编码表达的干扰rna的pdna通常在3千碱基至4千碱基的大小范围内。
85.多肽，尤其是重组多肽，包括治疗性蛋白质和肽，包括细胞因子、生长因子、抗体、抗体片段、免疫球蛋白样多肽、酶、疫苗、肽激素、趋化因子、受体、受体片段、激酶、磷酸酶、异构酶、水解酶、转录因子和融合多肽。
86.抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体和具有生物活性的抗体片段，包括任何前述的多价和/或多特异性形式。
87.天然存在的抗体通常包含四个多肽链：通过二硫键相互连接的两个相同的重(h)链和两个相同的轻(l)链。每条重链包含可变区(vh)和恒定区(ch)，ch区以其天然形式包含三个结构域：ch1、ch2和ch3。每条轻链包含可变区(v
l
)和包含一个结构域c
l
的恒定区。
[0088]vh
和v
l
区可进一步细分成高变区，称为互补决定区(cdr)，中间散布有更保守的区域，称为框架区(fr)。每个vh和v
l
由三个cdr和四个fr组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。
[0089]
可表达的抗体片段包含完整抗体的一部分，所述部分具有所需的生物活性。抗体片段通常包括至少一个抗原结合位点。抗体片段的实例包括：(i)具有v
l
、c
l
、vh和ch1结构域的fab片段；(ii) fab衍生物，如在ch1结构域的c-端具有一个或多个半胱氨酸残基的fab'片段，其可通过两个fab衍生物之间的二硫键桥接形成二价片段；(iii)具有vh和ch1结构域的fd片段；(iv) fd衍生物，如在ch1结构域的c-端具有一个或多个半胱氨酸残基的fd衍生物；(v)具有抗体单臂的v
l
和vh结构域的fv片段；(vi)单链抗体分子，如其中v
l
和vh结构域共价连接的单链fv (scfv)抗体；(vii)无恒定区结构域的vh或v
l
结构域多肽，其与有或无恒定区结构域的另一可变结构域(vh或v
l
结构域多肽)连接(例如，v
h-vh、v
h-v
l
或v
l-v
l
)；(viii)结构域抗体片段，如由vh结构域或v
l
结构域与vh或v
l
结构域的抗原结合片段组成的片段，如分离的cdr区；(ix)所谓的“双特异抗体”，其在同一多肽链中包含两个抗原结合位点，例如与轻链可变结构域(v
l
)连接的重链可变结构域(vh)；和(x)所谓的线性抗体，其包含一对串联的fd区段，该区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。
[0090]
包涵体包括在细菌细胞如大肠杆菌的细胞质中形成的不溶性聚集体，最常见包含多肽，尤其是重组多肽。
[0091]
处理目标物质例如重组多肽、最尤其是纯化或分离重组多肽的方法形成本发明的其他方面。
[0092]
参考图1描述根据本发明的设备的一个实施方案。用于进行生物处理操作的第一装置包含用于包含目标生物分子和杂质的液体原料的入口(1)和用于六种不同缓冲液的入口(2a)至(2f)及用于注入水的入口(2g)。每个入口都装有阀门，如直通隔膜阀(3)和(3a)至(3g)以使得流动能够打开或关闭。在所示实施方案中，通行经过入口(2a)和(2b)、(2c)和
(2d)以及(2e)和(2f)的缓冲液进料分别在阀(3a)至(3f)的下游合并，形成流体连接的三个缓冲液进料管线，除此之外，注入用水进料通过入口(2g)进入且流向多入口流量控制器(4)上的不同入口。多入口流量控制器(4)包含带有单个出口的四阀歧管，该出口具有快速作用的电磁致动器。通过这种配置，并通过适当地打开和关闭阀(3a)和(3b)、(3c)和(3d)以及(3e)和(3f)，允许在通过入口(2a)和(2b)、(2c)和(2d)或(2e)和(2f)进入的缓冲液之间进行选择，从而增加了设备的操作灵活性。多入口流量控制器(4)的出口与用于包含目标生物分子和杂质的液体原料的入口(1)在泵(6)的上游位置(5)处流体连接，这使得合并的进料流动通过装有气泡捕集器的静态混合器(8)并流向第一层析柱(12)的入口。将泵(6)的输出进给到层析柱(12)的管线装有压力传感器(7)、空气传感器(9)、流量计(10)如超声波流量计、及组合的温度和电导率传感器(11)。在一些实施方案中，泵(6)响应于来自流量计(10)的反馈信号(29)经由可编程控制单元来控制。在一些实施方案中，任选地，多入口流量控制器(4)响应于来自电导率和温度传感器(11)的反馈信号(28)经由可编程控制单元来控制。可编程控制单元也可控制可切换旁路组件(31)，可切换旁路组件(31)根据需要让液体原料进入混合措施(8)或绕过混合措施(8)。此外，可编程控制单元也可控制可切换旁路组件(31)使得在混合措施(8)中制备生物处理液，以向前发送至装置(12)。层析柱(12)的出口管线提供有压力传感器(13)、组合的温度和电导率传感器(14)、uv检测器如紫外/可见多波长检测器(15)、ph计(16)、和可用来调节压力并在需要时施加背压的可变位置阀(30)。优选地，泵(6)和可变位置阀(30)的操作及因此设备中压力的调节，响应于来自压力传感器(7)和(13)的反馈信号(26)和(27)经由可编程控制单元来控制。出口管线通行经过一系列阀(17)、(19)和(20)，这些阀使得能够控制进料离开出口(18)、废物流出口(21)或产物流出口(22)之间的流动，例如使得能够收集或采样。设备还装有阀(23a)和(23b)及另外的阀(24)和(25)，阀(23a)和(23b)在操作过程中如果需要的情况下使得流动能够被转向而绕过柱(12)，阀(24)和(25)使得经过柱的流动能够停止。然后可采用进料离开出口(18)作为进料管线，以向用于进行进一步的处理操作的第二装置提供来自一个单元的包含目标物质和任何剩余杂质的产物流，第二装置如图1中所示配置，但其中优选用不同的用于进行进一步的处理操作的装置(12)(如不同类型的层析柱或非层析装置(12))替换层析柱(12)，并且其中在用于进行进一步的处理操作的第二装置中，通过入口(1)进给的原料包含来自前一单元的来自产物流出口(18)的产物流。
[0093]
在一种操作方法中，阀(3)打开，而阀(3a)至(3g)关闭，包含目标物质的液体由泵(6)进给到柱(12)以将目标物质加载到柱上。例如，在目标物质为单克隆抗体的情况下，优选包含蛋白质a亲和树脂的柱，并且单克隆抗体选择性地与蛋白质a树脂结合。可切换旁路组件(31)允许将含有目标物质和杂质的液体原料加载到柱(12)上而不通行经过混合措施(8)。在完成所需加载后，关闭阀(3)，并打开阀(3a)至(3g)中的一个或多个，以使得一种或多种生物处理液能够通过入口(2a)至(2g)进入单元而被泵送通过柱(12)。在一些实施方案中，最初只打开阀(3a)，并操作多入口阀(4)以打开从入口(2a)供给了缓冲液(其可为洗涤缓冲液)的入口阀，使得用来自入口(2a)的缓冲液洗涤经加载的柱。在完成所需的洗涤阶段后，可打开阀(3b)至(3g)中的一个或多个，同时阀(3a)保持打开或关闭。打开多入口阀(4)上的入口阀(4a)以允许来自入口(2b)至(2g)的液体或其混合物被泵送通过柱(12)。通过控制多入口阀(4)上的阀(4a)(阀(4a)在图1中未示出，但可参见图2)和/或阀(3a)至(3g)的打
开和关闭，可根据需要改变和控制进给到柱的生物处理液的组成。例如，在阀(3b)、(3c)和(3e)打开的情况下，改变多入口流量控制器(4)中打开的入口阀(4a)并关闭其他阀，使得能够以逐步的方式改变生物处理液的组成。在另一个实例中，可以给定的频率打开和关闭多入口流量控制器(4)的两个或更多个入口阀(4a)并持续选定的时间段，以使得生物处理液的给定混合物能够被进给到柱(12)。此外，可切换旁路组件(31)允许来自入口(2a)至(2g)的液体在混合措施(8)中以任何组合或比率混合以产生生物处理液/洗脱液梯度，然后可将其进给到预先加载了目标物质和杂质的柱(12)。调节多入口阀(4)上的入口阀(4a)打开或关闭的时间和/或频率将允许改变进给到柱的液体的组成。在以逐步的方式改变时间和/或频率的情况下，组成也将以逐步的方式改变。在时间和/或频率在一段时间内逐渐改变的情况下，所得生物处理液的组成也将逐渐改变，使得能够向柱(12)施加梯度。通过无论哪个所需的方法，可将进给到柱(12)的生物处理液的组成改变至使得目标物质以与杂质不同的速率从柱中洗脱的组成，并可收集含有目标物质的产物流部分而可弃去任一侧含有杂质的废物流。在洗脱之前，从柱(12)离开的液体经由产物流出口(22)收集、或被送至废物(21)，并相应地设置阀(17)、(19)和(20)。为了从柱(12)洗脱目标物质，关闭阀(19)和(20)，并打开阀(17)，从而让目标物质通过出口(18)通行至第二处理单元。
[0094]
第二处理单元的操作可本质上为如上面关于第一单元所描述的。应认识到，通过与第一单元的产物流出口(18)等效的产物流出口(18)离开第二处理单元的目标物质可原样回收和使用，或者可经受一个或多个进一步的处理操作，例如在包含部件(i)至(vi)的其他单元中。这样的进一步的处理操作可采用常规的设备，或者根据图1中示意的配置的其他设备，或者根据本发明的其他设备。
[0095]
权利要求的全部主题在此通过引用结合到本说明书中。
[0096]
本发明通过以下实施例进行说明而不限制。
[0097]
在层析过程操作中，蛋白质与层析树脂结合，用不同盐浓度的缓冲液洗涤，然后使用高盐浓度缓冲液来去除(洗脱)。作为一个实例，重组乳铁蛋白可与2.3l poros-xs阳离子交换树脂柱结合，并使用具有0至1m的氯化钠浓度的ph 7.5磷酸钠缓冲液从该柱洗脱。这可在具有完全一次性流路组件的单个独立单元上进行，该流路组件含有图1中描述的特征，不同在于阀(23b)被替换为简单流体连接。将储备溶液按以下顺序附接至入口：将2m氯化钠附接至入口(2a)；将0.1m磷酸氢二钠附接至入口(2c)；将0.01m磷酸二氢钠附接至入口(2e)；将水附接至入口(2g)；和将蛋白质进料附接至入口(1)。通过按比例选择每种储备溶液以通过多入口流量控制器(4)、下游泵(6)和静态混合器(8)的作用产生所需的缓冲液组成，来生成缓冲液。在正确的缓冲液组成创建期间，使用可切换旁路组件(31)和阀(23a)，并且阀(24)和(25)关闭，来绕过混合措施(8)和柱(12)，不需要的缓冲液被引导至废物(21)。一旦缓冲液均匀，如由上游电导率传感器(11)的稳定读数所指示，则通过打开阀(24)和(25)并关闭阀(23a)处的旁路管线，来将缓冲液供给到层析柱(12)。使用柱(12)下游的电导率传感器(14)、uv传感器(15)和ph传感器(16)监测过程条件。在蛋白质与柱结合之前的柱调节和使用后的水冲洗期间，液体被引导至废物(21)。一旦经调节，层析树脂就加载蛋白质，所述蛋白质由泵(6)的作用通过液体原料入口(1)吸入，被推动通过静态混合器(8)，向前加载到柱(12)上。通过进料出口(22)收集来自柱的流经物，而通过产物流出口(18)收集第一低盐缓冲液洗涤液，并通过进料出口(21)收集第二中盐缓冲液洗涤液。最后，使用高盐洗脱缓冲
液从柱中回收目标蛋白质并通过产物流出口(18)收集。
1.本发明涉及用于处理包含目标物质的液体、特别是包含生物分子例如重组多肽的液体的单元、流路组件和设备。
2.许多生物分子，尤其是重组多肽和核酸，如质粒(pdna)，已吸引了很多关注，特别是对于治疗应用。这样的生物分子通常通过培养已经改造以表达所需生物分子的重组宿主细胞来产生。然后通过通常包括许多单元操作的方法来从培养基回收生物分子。
3.用于处理包含目标物质的溶液的设备是本领域已知的。然而，用于此类化合物的商业制造中的设备非常庞大，并且需要大量的占地面积和基础设施。另外，虽然可对若干单元操作实现一定的设备通用性，但针对某些单元操作如病毒灭活和/或超滤的设备的设计与针对例如层析纯化的设备的设计差别很大。这意味着要么需要更多的空间来容纳两套或更多套设备，要么各级设备的互操作性和控制异常复杂。此外，操作员需要针对所采用的每种不同类型的设备接受培训。因此，简单化且广泛适用的设备将是合乎需要的。还期望识别出使得能够采用共同的流路进行多个处理步骤的设备。
4.根据本发明的第一方面，提供了用于将包含目标物质和杂质的液体原料转化为含有经纯化的目标物质的产物流和任选地一个或多个包含至少一些所述杂质的废物流的设备，该设备包含至少两个处理单元，所述处理单元串联布置使得第二和任何后续单元的进料流包含来自下游单元的产物流，其中每个处理单元包含以下部件(i)至(vi)：(i) 用于液体原料的入口(1)；(ii) 多入口流量控制器(4)，其包含两个或更多个可变流量入口阀(4a)，用于以所需比率提供至少两个液体；(iii) 混合措施(8)；(iv) 用于进行将至少一些所述杂质与所述目标物质分离的处理操作的装置(12)；(v) 用于使液体流动通过所述单元的措施(6)；和(vi) 可切换旁路组件(31)，用于使通行经过所述单元的液体流入到混合措施(8)中或绕过混合措施(8)。
5.本发明提供了一种设备，其可以制造规模执行，并提供了优于现有设备的许多优点，特别是在简单性、成本和易于操作性、较低操作员错误风险、更容易维护和较少备件库存的方面。
6.在本说明书中，短语“处理单元”常缩写为“单元”，两者可互换使用。
附图说明
7.在附图中：图1为可在本发明的设备中的一个处理单元的示意图。
8.图2示意性地示出了可在本发明的单元中的流路组件。
9.图1在下面的实施例部分中更详细地描述。
10.图2示意性地示出了可在一个或两个或更多个(优选至少一半，更优选全部)处理
单元中使用的流路组件。该流路组件包含通过管连接的标识部件，所述管例如为由可通过γ辐照灭菌的材料(例如，塑料材料)制成并优选可在每次使用后弃置或清洗并重新使用的管。该流路组件包含用于六种不同液体(例如，缓冲液、酸性溶液、碱性溶液、有机溶剂等)的六个入口(2a)至(2f)、和用于另一液体例如水的第七入口(2g)。六种液体通行经过相应的阀(3a，3b)、(3c，3d)和(3e，3f)而给出由六种液体按所需比例组成的三个液体流，这些液体流进给到多入口流量控制器(4)中。在此实施方案中，流路组件还包含第四管，该管装配有阀(3g)，用于(从入口(2g))向多入口流量控制器(4)中引入另外的液体(例如，水)。装配有阀(3)的入口(1)具有止回阀(3h)，该止回阀(3h)可用于向流路组件中引入包含目标物质(例如，单克隆抗体)和杂质的液体原料。在多入口流量控制器(4)的下游，液体流通行经过用于使液体流动的措施(6)(例如，可附接到位于流路外部的电机的叶轮叶片或泵头)、压力传感器块(7)并然后进入可切换旁路组件(31)中。可切换旁路组件(31)具有三个连接，一个引入装配有气泡捕集器的混合措施(8)，一个从混合措施(8)引出，而一个通向装置进料的入口(12a)。在流动通过用于实现处理操作的装置(12)(装置(12)在图2中未示出)后，经纯化的液体原料通行经过出口(12b)并经过组合的压力传感器、ph和uv传感器(32)。最后，经纯化的液体原料通行经过出口管线，该出口管线包含一系列阀(17)、(19)和(20)，这些阀使得能够控制进料离开出口(18)、废物流出口(21)及产物流出口(22)之间的流动。
11.包含如上文关于单元所定义的部件(i)至(iii)、(v)和(vi)的流路组件形成本发明的进一步的特征，包含部件(i)至(vi)的单元及包含流路组件和部件(iv)的单元也是如此。
12.每个单元通常进行一个处理操作。
13.处理单元的数量不受特别限制，并且在很大程度上取决于将液体原料转化为适合所需目的(例如配制成药物)的形式所需的纯化步骤。在一些实施方案中，设备包含两个单元(例如，用于进行两个处理操作)。在其他实施方案中，设备包含多于两个单元，例如(至少)三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或更多个单元，优选每个单元均具有上述特征(i)至(vi)。
14.尽管设备还可包含两个或更多个并联操作的单元，但优选所有的单元串联布置(例如，串联连接，如果需要，任选地在每个单元之间有隔断袋(break bag))。在许多高度优选的实施方案中，在每个单元中进行的过程操作不同于在所有其他单元中使用的过程操作。因此，虽然设备可例如含有多于一个用于进行层析的单元，但每个这样的层析单元(或使用其的方式)优选不同于用于进行层析的其他单元(一个或多个)。
15.在某些实施方案中，每个单元均包含流路组件，该流路组件与至少一半、更优选所有的其他单元中的流路组件实质上相同。
16.优选地，每个单元在设备操作期间制备该单元的混合生物处理液(原位)。这样将避免操作员使用错误的、外部制备的意图用于不同过程操作的生物处理液的风险。
17.在某些实施方案中，每个单元均包含与其他单元实质上相同的流路组件。
18.在一个实施方案中，来自每个单元的产物流被直接进给到下一个单元中(当有下一个单元时)。在其他实施方案中，将一个或多个单元的产物流进给到储存容器(例如，“隔断袋”)中并然后随后作为下一个单元(如果有的话)的原料使用通常是方便的。这样，人们可在产物流进入下一个单元之前对其进行测试、暂停过程等等。
19.第一单元的原料也可由储存容器供给，或如果需要，其可直接由细胞培养设备例如生物反应器供给。合适的储存容器的实例包括罐和袋。
20.用于液体原料的入口(1)通常包含管，管优选装配有阀(3)和任选地止回阀(3h)。止回阀(3h)可用于避免液体原料被流动通过多入口流量控制器(4)的液体(一个或多个)所污染。用于第二和任何后续处理单元的液体原料通常包含来自前一处理单元的产物。
21.多入口流量控制器(4)优选包含可变流量入口阀(4a)、更优选间歇流量入口阀，其调节至少两个液体(例如，2、3、4、5、6、7或8个液体)通过多入口流量控制器(4)的流量。多入口流量控制器(4)包含至少2个可变流量入口阀(4a)，并在许多情况下包含至多8个、如3、4、5、6或7个可变流量入口阀(4a)。可变流量入口阀(4a)可各自具有相同的尺寸，或者可变流量入口阀(4a)中的一个或多个可具有不同的尺寸。在某些优选的实施方案中，从每个可变流量入口阀(4a)到多入口流量控制器(4)的出口测量的体积对于每个可变流量入口阀是相同的，并且高度优选从每个可变流量入口阀(4a)到多入口流量控制器(4)的出口测量的体积和路径长度两者对于每个可变流量入口阀都是相同的。
22.本发明中采用的多入口流量控制器(4)还包含至少一个出口，并且虽然可存在两个或更多个出口，但优选采用单个出口。
23.可变流量阀(4a)可在其中液体保持能够流动的相对低的第一流速与较高的至少第二流速之间调节流量。在优选的实施方案中，可变流量入口阀(4a)为间歇可变流量入口阀，其防止在第一位置中的流动，但允许在至少第二位置中的流动。最优选地，所有的阀均为间歇流量阀。阀可包含本领域已知的致动器，如气动致动器，或优选地电磁致动器。
24.优选地，多入口流量控制器(4)的可变流量入口阀(4a)最优选由可编程控制单元控制，以调节这些阀的打开和关闭，从而实现所需的相对量的输入液体流动通过多入口流量控制器。这优选通过以预定的时间段或循环速率循环通过多入口流量控制器(4)中的可变流量入口阀(4a)、并根据生成所需组合物需要的循环时间的比例调节阀的打开或关闭来实现。循环速率可以是恒定的或变化的。最优选地，采用间歇流量入口阀，并控制为使得在操作中在任何给定的时间只有一个阀(4a)是打开的。在许多实施方案中，多入口流量控制器(4)的循环速率保持恒定，并且输入液体的所需相对量保持一致。
25.在许多实施方案中，采用多个循环。所采用的循环次数将取决于诸多因素如过程的持续时间、被处理的液体的体积、流速和设备的最大工作压力。在某些实施方案中，可采用至少10个循环，如至少50、100、500、750、1000、1500、2000、3000、5000、7500、10000或更多个循环。
26.应认识到可采用一系列循环频率。在许多情况下，频率小于100hz，通常小于50hz，一般小于10hz，并优选小于5hz。在某些优选的实施方案中，频率为2hz或更小，最优选1hz或更小，如0.05至0.5hz。
27.虽然至少两个液体的混合(例如，以制备生物处理液，或将液体与液体原料混合)可通过将通过多入口流量控制器(4)出口的液体流简单地合并、任选地与用于使液体流动通过该单元的措施(6)的作用相组合来实现，但该单元包含混合措施(8)，优选混合室，所述混合室优选包含静态混合器、最优选延时分流静态混合器。
28.所述至少两个液体中之一任选地为液体原料。
29.在许多实施方案中，混合措施(8)位于用于使液体流动通过该单元的措施(6)的下
游和用于进行处理操作的装置(12)的上游。在一些优选的实施方案中，混合措施(8)包含气泡捕集器。
30.混合措施(8)优选适于将液体原料与一个或多个液体合并以产生装置进料。混合措施(8)优选还适于将至少两个其他液体合并以制备生物处理液。
31.每个单元可进行的处理操作包括层析、病毒灭活、过滤(例如，病毒去除)、重折叠、超滤、渗滤、微滤、浓缩和/或进行缓冲液交换(缓冲液更换)、在线调节和重折叠。
32.在一些实施方案中，设备包含至少两个用于进行目标物质的层析纯化的单元，在许多情况下甚至包含至少三个用于进行目标物质的层析纯化的单元。用于进行目标物质的层析纯化的第一单元优选包含亲和层析柱，例如，蛋白质a亲和柱。用于进行目标物质的层析纯化的第二单元优选包含阴离子交换层析柱。用于进行目标物质的层析纯化的第三单元，当存在时，优选包含阳离子交换层析柱。
33.因此，在一个优选的实施方案中，设备包含串联布置的以下单元(优选以所列的顺序)，每个单元包含部件(i)至(vi)，并且每个单元的产物进料(除了最后一个单元外)用作下一个单元的原料：a. 用于进行目标物质的层析纯化的单元，优选通过亲和层析；和b. 用于灭活液体原料中可能存在的任何病毒的单元。
34.在另一个优选的实施方案中，设备包含串联布置的以下单元(优选以所列的顺序)，每个单元包含部件(i)至(vi)，并且每个单元的产物进料(除了最后一个单元外)用作下一个单元的原料：a. 用于进行目标物质的层析纯化的单元，优选通过亲和层析；b. 用于灭活液体原料中可能存在的任何病毒的单元；和c. 用于通过阳离子交换层析进行目标物质的层析纯化的单元。
35.在另一个优选的实施方案中，设备包含串联布置的以下单元(优选以所列的顺序)，每个单元包含部件(i)至(vi)，并且每个单元的产物进料(除了最后一个单元外)用作下一个单元的原料：a. 用于进行目标物质的层析纯化的单元，优选通过亲和层析；b. 用于灭活液体原料中可能存在的任何病毒的单元；c. 用于通过阳离子交换层析进行目标物质的层析纯化的单元；和d. 用于通过阴离子交换层析进行目标物质的层析纯化的单元。
36.在另一个优选的实施方案中，设备包含串联布置的以下单元(优选以所列的顺序)，每个单元包含部件(i)至(vi)，并且每个单元的产物进料(除了最后一个单元外)用作下一个单元的原料：a. 用于进行目标物质的层析纯化的单元，优选通过亲和层析；b. 用于灭活液体原料中可能存在的任何病毒的单元；c. 用于通过阳离子交换层析进行目标物质的层析纯化的单元；d. 用于通过阴离子交换层析进行目标物质的层析纯化的单元；和e. 用于去除任何灭活病毒的单元。
37.在另一个优选的实施方案中，设备包含串联布置的以下单元(优选以所列的顺序)，每个单元包含部件(i)至(vi)，并且每个单元的产物进料(除了最后一个单元外)用作
下一个单元的原料：a. 用于进行目标物质的层析纯化的单元，优选通过亲和层析；b. 用于灭活液体原料中可能存在的任何病毒的单元；c. 用于通过阳离子交换层析进行目标物质的层析纯化的单元；d. 用于通过阴离子交换层析进行目标物质的层析纯化的单元；e. 用于去除任何灭活病毒的单元；和f. 用于浓缩来自前一单元的产物流和/或进行来自前一单元的产物流的缓冲液交换的单元。
38.优选地，所述单元以本文列出的顺序串联布置，例如，在包含单元a.至g.的设备中，优选地，单元以a.、b.、c.、d.、e.然后f.的顺序串联布置。
39.优选地，这些单元中的至少一个(优选至少一半的单元、更优选所有单元)还包含位于部件(iv)上游的压力传感器。
40.优选地，这些单元中的至少一个(优选至少一半的单元、更优选所有单元)还包含位于部件(iv)下游的压力传感器。
41.优选地，这些单元中的至少一个(优选至少一半的单元、更优选所有单元)还包含位于部件(iv)下游的uv传感器。
42.优选地，这些单元中的至少一个(优选至少一半的单元、更优选所有单元)还包含位于部件(iv)下游的ph传感器。
43.优选地，这些单元中的至少一个(优选至少一半的单元、更优选所有单元)还包含位于部件(iv)下游的电导率传感器。
44.在一个优选的实施方案中，除了部件(iv)外，每个单元的至少75%的组成部分与设备的至少80%的其他单元中使用的组成部分相同。优选地，除了部件(iv)外，每个单元的至少85%的组成部分与设备的至少80%的其他单元中使用的组成部分相同。尤其优选地，除了部件(iv)外，每个单元的至少95%的组成部分与设备的至少80%、更优选至少90%的其他单元中使用的组成部分相同。在一个特别优选的实施方案中，除了部件(iv)外，每个单元的所有组成部分与设备的所有其他单元中使用的所有组成部分相同。为避免疑义，流动通过设备的液体不为设备的组成部分。这些实施方案是有利的，因为每个单元中的组成部分之间的高度共性意味着需要较少的备件库存。还此外，因为这些单元如此相似，故设备的日常维护得到简化，并且因为每个单元与设备的其他单元如此相似，故设备更易于操作(非常昂贵的目标物质被破坏的风险较低)。与使用来自多个制造商的非常不同的处理单元的现有技术大不相同，工程师避免了学习如何维护众多非常不同的处理单元的需要。每个单元中的部件(iv)通常不同于其他单元中的部件(iv)(使得每个单元可进行分立的处理操作)，因此有话语“除了部件(iv)外”。
45.在一个优选的实施方案中，除了装置(12)外，设备的所有单元实质上相同。在此实施方案中，装置(12)可在两个或更多个单元中相同，但更典型地，装置(12)从一个单元到下一个单元是不同的，例如如图1中所示意，使得每个单元可进行分立的处理操作。
46.用于装置进料的入口也可用于例如从多入口流量控制器(4)或从混合措施(8)接收生物处理液(一种或多种)。生物处理液可用于从液体原料去除杂质，例如作为层析中的调节剂或洗脱剂，作为灭活病毒的措施，作为通过过滤器洗涤目标物质的措施，等。
47.设备任选地还包含用于进行一种或多种以下处理操作的处理单元：层析、病毒灭活、过滤(例如，超滤、微滤、死端过滤和/或渗滤)、病毒去除、重折叠、浓缩和/或进行缓冲液交换、絮凝和在线调节。
48.可使用装置(12)进行的层析生物处理操作包括亲和层析(例如，蛋白质a亲和层析)、离子交换(阴离子交换和阳离子交换中任一或两者)层析、疏水相互作用层析(hic)、反相层析、膨胀床层析、混合模式层析、膜层析和尺寸排阻层析(sec)。在许多实施方案中，至少一个单元进行蛋白质a亲和层析的处理操作。用于进行层析操作的装置包括适宜的层析设备，如膜、纤维整料(fibre monolith)或树脂。进行层析的单元的数量和顺序将根据目标物质的性质来选择。
49.优选地，设备包含至少两个、更优选三个包含部件(i)至(vi)的用于进行目标物质的层析纯化的单元。在这种情况下，相对于在所有其他单元中使用的那些，在每个单元中进行的层析纯化优选使用不同的条件和/或向层析柱填充了不同材料(例如，不同的树脂、膜或整料)的层析柱。在一个特别优选的实施方案中，至少一个单元进行亲和层析，至少一个单元进行阳离子交换层析并且至少一个单元进行阴离子交换层析。
50.用于进行病毒灭活的处理操作的装置(12)通常包含储存容器，其中可在灭活任何存在的病毒的条件下储存包含目标物质的液体。在某些实施方案中，病毒灭活装置(12)的出口和入口可流体连接以产生再循环回路。在一个这样的实施方案中，设备装配有在“装置”入口与“装置”出口之间流体连接的容器或袋，并且设备出口中之一与多入口流量控制器(4)入口中之一流体连接。与液体原料入口(1)流体连接的装置(12)“入口”和“出口”之间的容器或袋由赋予流动的措施(6)(通常为泵)填充，或用通过其他多入口流量控制器(4)入口中的至少之一的至少一个其他液体调节。在某些实施方案中，所述容器或袋为混合容器或袋。生物处理液通过多入口流量控制器(4)的入口再循环到容器或袋，并返回到多入口流量控制器(4)的入口，因为包含目标物质的溶液由流体连接到多入口流量控制器(4)上的至少一个其他入口的至少一个另外的液体调节。
51.可使用本领域已知的条件通过多种技术进行病毒灭活。例如，使用层析柱、层析膜或能够在小于约4.0的ph、例如约3.0至约4.0的ph、优选约3.2至约3.9的ph、尤其是约3.4至约3.8的ph、更尤其是约3.45至约3.7的ph下孵育包含液体原料的流体的贮槽。优选地，液体原料在前述ph下保持至少25分钟的时间，例如约30分钟至1.5小时的时间、优选约30分钟至1.25小时的时间、更优选约0.75小时至1.25小时的时间、尤其是约1小时的时间。在每种情况下，选择的条件都使得目标物质不被损坏或破坏。
52.灭活病毒可通过过滤去除，例如使用正向流过滤器(nff)或切向流过滤(tff)过滤器，如美国专利号6,365,395中所述。在tff模式或nff模式中，去除灭活病毒的过滤在保留灭活病毒的条件下进行，通常使用平均孔隙直径为20至100纳米(nm)的膜。这样的膜将灭活病毒保留在膜表面上，同时允许目标物质通行经过膜。
53.用于去除灭活病毒的单元也可去除在病毒灭活步骤中存活下来的任何病毒。
54.可用于去除灭活病毒(连同任何保持活性的病毒)的代表性的合适的超滤膜包括由再生纤维素、聚醚砜、聚芳砜、聚砜、聚酰亚胺、聚酰胺、聚偏二氟乙烯(pvdf)等形成的膜，并称为viresolve.rtm.膜和retropore
tm
膜，可得自emd millipore (马萨诸塞州比尔里卡)。它们可以筒(nff)形式供给，如viresolve tm nfp病毒过滤器，或作为盒(对于tff)，如
pellicon
tm
盒，可得自emd millipore (马萨诸塞州比尔里卡)。
55.可使用装置(12)进行的过滤操作包括病毒、深层和绝对过滤，超滤，渗滤和微滤。在许多实施方案中，过滤装置(12)在装置入口和装置出口之间包含过滤器模块。过滤器模块可用附接到多入口流量控制器入口(4)的至少两个液体进料来冲洗和驱赶，并且包含目标物质的液体原料可流体连接到原料入口(1)。液体原料通过过滤装置(12)的处理通过用于赋予流动的措施(6)实现，该措施(6)流体连接到并位于多入口流量控制器出口(4)和原料入口(1)的下游及过滤装置(12)的上游。过滤器通常呈模块化形式并可采用纯化生物分子领域中已知的配置。
56.病毒过滤、深层过滤和绝对过滤过程操作是本领域已知的，并可使用市售的过滤装置进行。在许多实施方案中，一个或多个过滤装置被放置在装置(12)入口与出口之间，以进行过滤作为处理操作。在另一个实施方案中，在设备出口的下游布置另外的过滤装置，在某些实施方案中，这允许设备进行大多数的纯化步骤，如层析、病毒灭活、切向流过滤、病毒过滤或深层过滤，然后是设备外部的二次过滤操作。
57.可使用本发明的设备进行的切向流过滤(“tff”)单元操作包括常规的再循环tff和单程tff。在某些实施方案中，设备的出口和入口可流体连接以产生再循环回路，例如再循环的切向流过滤。在一个实施方案中，如本领域已知的，设备装配有tff模块，该模块在装置入口与装置出口之间包含平板、中空纤维或螺旋缠绕膜，并且来自tff模块的滞留物从设备出口中之一引导至含至少一个入口和一个出口的容器或袋上的流体连接的入口。容器或袋的出口与液体原料入口流体连接。容器或袋使用通过与容器或袋上的第二入口流体连接来向容器或袋中供给原料或液体的辅助措施而保持在恒定的液位。在另一个实施方案中，设备装配有tff模块，该模块在装置入口与装置出口之间包含平板、中空纤维或螺旋缠绕膜，并且来自tff模块的滞留物从设备出口中之一流体连接回到多入口流量控制器阀的入口中之一。在某些实施方案中，从设备出口到其入口的再循环回路含有隔断(break)容器或袋。包含目标物质的溶液或液体由用于赋予流动的措施(通常为泵)通过液体原料入口吸入到再循环回路中。滞留物再循环通过tff模块，优选通过多入口流量控制器入口中之一。可采用多入口流量控制器来将滞留物与至少一个其他液体混合。再循环tff的操作是本领域公知的，并通过设置错流速率和跨膜压力来控制。
58.在某些实施方案中，单程tff可配置有tff模块，该tff模块在装置入口与装置出口之间包含平板、中空纤维或螺旋缠绕膜，例如，如在wo2017/118835中描述的单程tff的情况。
59.在一些实施方案中，可采用单程和再循环tff的混合，其中在tff模块下游使用可变流量阀产生的滞留物被返回到进料容器。
60.根据本发明的设备任选还包含以下中的一种或多种：气泡捕集器、压力传感器、温度传感器、ph传感器、流速传感器、电导率传感器、空气传感器和uv传感器如紫外/可见多波长传感器。
61.用于使液体流动的措施(6)是本领域公知的，并包括对液体施加气压，尤其是惰性气体，如氮气或氦气。优选地，用于使液体流动通过单元的措施包括一个或多个泵。可采用的泵包括蠕动泵、隔膜泵、凸轮泵和离心泵。既可采用一次性的泵设计，也可采用可重复使用的泵设计。在许多优选的实施方案中，对进行单元操作的每个措施采用单个泵，其位于原
料与流量控制器(4)的出口之间的流体连接的下游。最优选地，泵位于装置(12)的上游。选择的泵的类型和尺寸通常取决于对设备的规模和设计参数适合的流量容量和压力分布。在某些高度优选的实施方案中，泵为四元隔膜泵。
62.流路组件中存在的措施(6)通常包含一个或多个叶轮，例如隔膜叶轮。它们可连接到用于驱动叶轮的措施例如位于流路组件外部的电机，并由该措施驱动，。
63.当有需要时，可切换旁路组件(31)可用于提供不让液体原料进入混合措施(8)的选择。这提供了该装置也可用于纯化在混合措施(8)中合并液体原料与生物处理液可能或将会损伤或降解目标物质的脆弱目标物质的优点。
64.可切换旁路组件(31)也可用于混合两个或更多个液体以制备生物处理液，然后可将其进给到装置(12)中以进行处理操作。
65.当装置(12)包含层析柱时，可切换旁路组件(31)将特别有用。可使用可切换旁路组件(31)来向层析柱(12)上装入含有目标物质和杂质的液体原料而不通行经过混合措施(8)，然后可使用混合措施(8)来制备生物处理液(其组成可使用多入口流量控制器(4)按需改变)，其充当加载在柱(12)上的目标物质的洗脱液。此外，当装置(12)进行超滤和/或渗滤的过程步骤时，绕过混合措施(8)有时可能是有用的，否则这些过程步骤中滞留体积和产物稳定性可能成问题。
66.可切换旁路组件(31)优选包含管和两个或三个阀，它们将液体原料和生物处理液的流动引导到混合措施(8)中，或引导向装置(12)而不通行经过混合措施(8)。
67.在本发明的一个特别的实施方案中，每个单元均包含流路组件，所述流路组件包含以下部件(i)至(vi)：(i) 用于液体原料的入口(1)；(ii) 多入口流量控制器(4)，其包含两个或更多个可变流量入口阀(4a)，用于以所需比率提供至少两个液体；(iii) 混合措施(8)；(iv) 用于向装置(12)进给液体以进行处理操作的出口和用于从装置(12)接收液体的入口；(v) 用于使液体流动通过流路组件的措施(6)；和(vi) 用于使液体流入到混合措施(8)中或绕过混合措施(8)的可切换旁路组件(31)。
68.该流路组件形成本发明的一个特征。
69.在流路组件上：优选部件(v)在部件(iii)的上游和部件(ii)的下游；优选部件(iii)在部件(ii)的下游；优选流路组件由塑料材料构造；优选流路组件由允许通过γ辐射对组件灭菌的材料构造，例如有机硅，尤其是编织有机硅、聚乙烯或聚丙烯；在另一个实施方案中，流路组件由不锈钢构造。优选地，流路组件是无菌的。
70.优选地，流路组件相应还包含一个或多个用于接收电导计、ph传感器和/或压力传感器的块。优选地，所述一个或多个块中的至少一个位于措施(6)的下游和混合措施(8)的上游。此外，优选所述一个或多个块中的至少一个位于装置(12)的下游。在一个尤其优选的实施方案中，所述一个或多个块中的至少一个位于装置(12)的下游并适于接收电导计、ph计和压力传感器。
71.包含前述流路组件和优选地用于进行将至少一些杂质与目标物质分离的处理操作的装置(12)的单元形成本发明的又一个方面。
72.根据本发明的设备优选还包含用于向流动通过装置(12)的液体施加另外的压力(即，除了由用于赋予流动的措施(6)提供的压力外)的措施，所述措施位于装置(12)的下游。用于施加另外的压力的措施是本领域已知的，并包括夹管阀、隔膜阀，且可变位置隔膜阀尤其优选。
73.在一个优选的实施方案中：(a) 每个单元均包含流路组件；和(b) 在至少一半的单元(优选所有单元)中使用的流路组件具有实质上相同的配置。
74.用于制造流路组件的可更换管优选由塑料材料构造，例如有机硅，尤其是编织有机硅。
75.优选地，通过每个单元的流路组件与通过所有其他单元的流路组件实质上相同。
76.在某些实施方案中，一个或多个单元(优选所有单元)包含由在需要更换之前允许大量次数重复使用的材料(例如不锈钢)构造的多次使用流路组件。
77.在某些实施方案中，一个或多个单元(优选所有单元)包含一次性使用的流路组件，其优选由设计具有有限寿命并用作一次性消耗品的材料例如塑料材料构造，例如有机硅(尤其是编织有机硅)、聚乙烯或聚丙烯。
78.在许多实施方案中，每个处理操作在可编程控制单元、优选计算机的控制下进行。在一些实施方案中，单个控制单元控制两个或更多个处理操作。在其他实施方案中，每个处理操作都在单独的控制单元的控制之下。在这些其他实施方案中，优选控制单元采用通用的编程语言，这使得能够简化控制单元之间的通信。
79.在一个优选的实施方案中，通过合并至少三个液体来提供生物处理液，所述至少三个液体中的至少两个(优选全部)各自通过合并至少两个其他的液体(例如使用阀(3a)和(3b)或(3c)和(3d))来提供。此合并优选在混合措施(8)中进行。所述至少三个液体可分别通过合并液体(2a)和(2b)、(2c)和(2d)及(2e)和(2f)来制备。
80.一个单元中使用的生物处理液的组成可在整个过程中保持相同，或组成可在过程中改变。例如，生物处理液的组成可在过程中逐渐或逐步改变，特别是当单元包含层析柱并且生物处理液充当洗脱液时。
81.可用于制备生物处理液的液体(例如，所述至少两个液体)包括本领域已知的用于进行适宜的处理操作的那些。这样的液体的实例包括酸性、中性和碱性溶液，例如具有2.5至14范围内的ph的那些，以及各种浓度下的各种盐的溶液。实例包括包含以下中的一种或多种的水溶液：氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵、磷酸、硫酸、盐酸或乙酸；盐类，例如盐浓度高达约3m的水溶液，包括钠盐、钙盐、钾盐和铵盐，例如磷酸盐、氯化物、乙酸盐、柠檬酸盐和硫酸盐；缓冲剂，其实例是本领域公知的；还原剂(例如，dtt (dl-二硫苏糖醇)和tcep ((三(2-羧乙基)膦))；氨基酸(例如，组氨酸、精氨酸和甘氨酸)；洗涤剂(例如，tween
tm 20和triton
tm-x100)；水混溶性有机溶剂，例如多元醇，例如甘油和聚乙二醇；以及包含前述中两种或更多种的混合物。
82.可使用本发明的单元、设备和流路组件处理的目标物质包括生物分子，例如pdna；
细胞治疗、疫苗例如病毒疫苗、基因治疗产品、糖、包涵体，特别是包含多肽的包涵体；和尤其是重组多肽。
83.pdna可为多种形式中的一种或多种，如超螺旋、线型和开环(即，缺口或松弛)同种型。超螺旋pdna同种型具有共价闭合环状形式，并且pdna在宿主细胞中因宿主酶系统的作用而呈负超螺旋。在开环同种型中，pdna双链的一条链在一处或多处断裂。
84.产生pdna的方法是本领域公知的。pdna可以是天然的或人造的，例如，带有外源dna插入片段的克隆载体。在许多实施方案中，pdna在1千碱基至50千碱基的大小范围内。例如，编码表达的干扰rna的pdna通常在3千碱基至4千碱基的大小范围内。
85.多肽，尤其是重组多肽，包括治疗性蛋白质和肽，包括细胞因子、生长因子、抗体、抗体片段、免疫球蛋白样多肽、酶、疫苗、肽激素、趋化因子、受体、受体片段、激酶、磷酸酶、异构酶、水解酶、转录因子和融合多肽。
86.抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体和具有生物活性的抗体片段，包括任何前述的多价和/或多特异性形式。
87.天然存在的抗体通常包含四个多肽链：通过二硫键相互连接的两个相同的重(h)链和两个相同的轻(l)链。每条重链包含可变区(vh)和恒定区(ch)，ch区以其天然形式包含三个结构域：ch1、ch2和ch3。每条轻链包含可变区(v
l
)和包含一个结构域c
l
的恒定区。
[0088]vh
和v
l
区可进一步细分成高变区，称为互补决定区(cdr)，中间散布有更保守的区域，称为框架区(fr)。每个vh和v
l
由三个cdr和四个fr组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。
[0089]
可表达的抗体片段包含完整抗体的一部分，所述部分具有所需的生物活性。抗体片段通常包括至少一个抗原结合位点。抗体片段的实例包括：(i)具有v
l
、c
l
、vh和ch1结构域的fab片段；(ii) fab衍生物，如在ch1结构域的c-端具有一个或多个半胱氨酸残基的fab'片段，其可通过两个fab衍生物之间的二硫键桥接形成二价片段；(iii)具有vh和ch1结构域的fd片段；(iv) fd衍生物，如在ch1结构域的c-端具有一个或多个半胱氨酸残基的fd衍生物；(v)具有抗体单臂的v
l
和vh结构域的fv片段；(vi)单链抗体分子，如其中v
l
和vh结构域共价连接的单链fv (scfv)抗体；(vii)无恒定区结构域的vh或v
l
结构域多肽，其与有或无恒定区结构域的另一可变结构域(vh或v
l
结构域多肽)连接(例如，v
h-vh、v
h-v
l
或v
l-v
l
)；(viii)结构域抗体片段，如由vh结构域或v
l
结构域与vh或v
l
结构域的抗原结合片段组成的片段，如分离的cdr区；(ix)所谓的“双特异抗体”，其在同一多肽链中包含两个抗原结合位点，例如与轻链可变结构域(v
l
)连接的重链可变结构域(vh)；和(x)所谓的线性抗体，其包含一对串联的fd区段，该区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。
[0090]
包涵体包括在细菌细胞如大肠杆菌的细胞质中形成的不溶性聚集体，最常见包含多肽，尤其是重组多肽。
[0091]
处理目标物质例如重组多肽、最尤其是纯化或分离重组多肽的方法形成本发明的其他方面。
[0092]
参考图1描述根据本发明的设备的一个实施方案。用于进行生物处理操作的第一装置包含用于包含目标生物分子和杂质的液体原料的入口(1)和用于六种不同缓冲液的入口(2a)至(2f)及用于注入水的入口(2g)。每个入口都装有阀门，如直通隔膜阀(3)和(3a)至(3g)以使得流动能够打开或关闭。在所示实施方案中，通行经过入口(2a)和(2b)、(2c)和
(2d)以及(2e)和(2f)的缓冲液进料分别在阀(3a)至(3f)的下游合并，形成流体连接的三个缓冲液进料管线，除此之外，注入用水进料通过入口(2g)进入且流向多入口流量控制器(4)上的不同入口。多入口流量控制器(4)包含带有单个出口的四阀歧管，该出口具有快速作用的电磁致动器。通过这种配置，并通过适当地打开和关闭阀(3a)和(3b)、(3c)和(3d)以及(3e)和(3f)，允许在通过入口(2a)和(2b)、(2c)和(2d)或(2e)和(2f)进入的缓冲液之间进行选择，从而增加了设备的操作灵活性。多入口流量控制器(4)的出口与用于包含目标生物分子和杂质的液体原料的入口(1)在泵(6)的上游位置(5)处流体连接，这使得合并的进料流动通过装有气泡捕集器的静态混合器(8)并流向第一层析柱(12)的入口。将泵(6)的输出进给到层析柱(12)的管线装有压力传感器(7)、空气传感器(9)、流量计(10)如超声波流量计、及组合的温度和电导率传感器(11)。在一些实施方案中，泵(6)响应于来自流量计(10)的反馈信号(29)经由可编程控制单元来控制。在一些实施方案中，任选地，多入口流量控制器(4)响应于来自电导率和温度传感器(11)的反馈信号(28)经由可编程控制单元来控制。可编程控制单元也可控制可切换旁路组件(31)，可切换旁路组件(31)根据需要让液体原料进入混合措施(8)或绕过混合措施(8)。此外，可编程控制单元也可控制可切换旁路组件(31)使得在混合措施(8)中制备生物处理液，以向前发送至装置(12)。层析柱(12)的出口管线提供有压力传感器(13)、组合的温度和电导率传感器(14)、uv检测器如紫外/可见多波长检测器(15)、ph计(16)、和可用来调节压力并在需要时施加背压的可变位置阀(30)。优选地，泵(6)和可变位置阀(30)的操作及因此设备中压力的调节，响应于来自压力传感器(7)和(13)的反馈信号(26)和(27)经由可编程控制单元来控制。出口管线通行经过一系列阀(17)、(19)和(20)，这些阀使得能够控制进料离开出口(18)、废物流出口(21)或产物流出口(22)之间的流动，例如使得能够收集或采样。设备还装有阀(23a)和(23b)及另外的阀(24)和(25)，阀(23a)和(23b)在操作过程中如果需要的情况下使得流动能够被转向而绕过柱(12)，阀(24)和(25)使得经过柱的流动能够停止。然后可采用进料离开出口(18)作为进料管线，以向用于进行进一步的处理操作的第二装置提供来自一个单元的包含目标物质和任何剩余杂质的产物流，第二装置如图1中所示配置，但其中优选用不同的用于进行进一步的处理操作的装置(12)(如不同类型的层析柱或非层析装置(12))替换层析柱(12)，并且其中在用于进行进一步的处理操作的第二装置中，通过入口(1)进给的原料包含来自前一单元的来自产物流出口(18)的产物流。
[0093]
在一种操作方法中，阀(3)打开，而阀(3a)至(3g)关闭，包含目标物质的液体由泵(6)进给到柱(12)以将目标物质加载到柱上。例如，在目标物质为单克隆抗体的情况下，优选包含蛋白质a亲和树脂的柱，并且单克隆抗体选择性地与蛋白质a树脂结合。可切换旁路组件(31)允许将含有目标物质和杂质的液体原料加载到柱(12)上而不通行经过混合措施(8)。在完成所需加载后，关闭阀(3)，并打开阀(3a)至(3g)中的一个或多个，以使得一种或多种生物处理液能够通过入口(2a)至(2g)进入单元而被泵送通过柱(12)。在一些实施方案中，最初只打开阀(3a)，并操作多入口阀(4)以打开从入口(2a)供给了缓冲液(其可为洗涤缓冲液)的入口阀，使得用来自入口(2a)的缓冲液洗涤经加载的柱。在完成所需的洗涤阶段后，可打开阀(3b)至(3g)中的一个或多个，同时阀(3a)保持打开或关闭。打开多入口阀(4)上的入口阀(4a)以允许来自入口(2b)至(2g)的液体或其混合物被泵送通过柱(12)。通过控制多入口阀(4)上的阀(4a)(阀(4a)在图1中未示出，但可参见图2)和/或阀(3a)至(3g)的打
开和关闭，可根据需要改变和控制进给到柱的生物处理液的组成。例如，在阀(3b)、(3c)和(3e)打开的情况下，改变多入口流量控制器(4)中打开的入口阀(4a)并关闭其他阀，使得能够以逐步的方式改变生物处理液的组成。在另一个实例中，可以给定的频率打开和关闭多入口流量控制器(4)的两个或更多个入口阀(4a)并持续选定的时间段，以使得生物处理液的给定混合物能够被进给到柱(12)。此外，可切换旁路组件(31)允许来自入口(2a)至(2g)的液体在混合措施(8)中以任何组合或比率混合以产生生物处理液/洗脱液梯度，然后可将其进给到预先加载了目标物质和杂质的柱(12)。调节多入口阀(4)上的入口阀(4a)打开或关闭的时间和/或频率将允许改变进给到柱的液体的组成。在以逐步的方式改变时间和/或频率的情况下，组成也将以逐步的方式改变。在时间和/或频率在一段时间内逐渐改变的情况下，所得生物处理液的组成也将逐渐改变，使得能够向柱(12)施加梯度。通过无论哪个所需的方法，可将进给到柱(12)的生物处理液的组成改变至使得目标物质以与杂质不同的速率从柱中洗脱的组成，并可收集含有目标物质的产物流部分而可弃去任一侧含有杂质的废物流。在洗脱之前，从柱(12)离开的液体经由产物流出口(22)收集、或被送至废物(21)，并相应地设置阀(17)、(19)和(20)。为了从柱(12)洗脱目标物质，关闭阀(19)和(20)，并打开阀(17)，从而让目标物质通过出口(18)通行至第二处理单元。
[0094]
第二处理单元的操作可本质上为如上面关于第一单元所描述的。应认识到，通过与第一单元的产物流出口(18)等效的产物流出口(18)离开第二处理单元的目标物质可原样回收和使用，或者可经受一个或多个进一步的处理操作，例如在包含部件(i)至(vi)的其他单元中。这样的进一步的处理操作可采用常规的设备，或者根据图1中示意的配置的其他设备，或者根据本发明的其他设备。
[0095]
权利要求的全部主题在此通过引用结合到本说明书中。
[0096]
本发明通过以下实施例进行说明而不限制。
[0097]
在层析过程操作中，蛋白质与层析树脂结合，用不同盐浓度的缓冲液洗涤，然后使用高盐浓度缓冲液来去除(洗脱)。作为一个实例，重组乳铁蛋白可与2.3l poros-xs阳离子交换树脂柱结合，并使用具有0至1m的氯化钠浓度的ph 7.5磷酸钠缓冲液从该柱洗脱。这可在具有完全一次性流路组件的单个独立单元上进行，该流路组件含有图1中描述的特征，不同在于阀(23b)被替换为简单流体连接。将储备溶液按以下顺序附接至入口：将2m氯化钠附接至入口(2a)；将0.1m磷酸氢二钠附接至入口(2c)；将0.01m磷酸二氢钠附接至入口(2e)；将水附接至入口(2g)；和将蛋白质进料附接至入口(1)。通过按比例选择每种储备溶液以通过多入口流量控制器(4)、下游泵(6)和静态混合器(8)的作用产生所需的缓冲液组成，来生成缓冲液。在正确的缓冲液组成创建期间，使用可切换旁路组件(31)和阀(23a)，并且阀(24)和(25)关闭，来绕过混合措施(8)和柱(12)，不需要的缓冲液被引导至废物(21)。一旦缓冲液均匀，如由上游电导率传感器(11)的稳定读数所指示，则通过打开阀(24)和(25)并关闭阀(23a)处的旁路管线，来将缓冲液供给到层析柱(12)。使用柱(12)下游的电导率传感器(14)、uv传感器(15)和ph传感器(16)监测过程条件。在蛋白质与柱结合之前的柱调节和使用后的水冲洗期间，液体被引导至废物(21)。一旦经调节，层析树脂就加载蛋白质，所述蛋白质由泵(6)的作用通过液体原料入口(1)吸入，被推动通过静态混合器(8)，向前加载到柱(12)上。通过进料出口(22)收集来自柱的流经物，而通过产物流出口(18)收集第一低盐缓冲液洗涤液，并通过进料出口(21)收集第二中盐缓冲液洗涤液。最后，使用高盐洗脱缓冲
液从柱中回收目标蛋白质并通过产物流出口(18)收集。
再多了解一些
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