色谱树脂以及其用途的制作方法

色谱树脂以及其用途
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年2月26日提交的美国临时专利申请序列号62/982,002和2020年2月11日提交的美国临时专利申请序列号62/975,141的优先权，两者均以全文引用的方式并入本文。
技术领域
3.本公开涉及生物技术领域，更具体地说，涉及抗原结合分子。


背景技术：

4.组织因子(tf)是263个氨基酸的整体膜糖蛋白，分子量约为46kda，是外在凝血路径的触发蛋白，是体内凝血的主要引发剂。通常不与循环血液接触的组织因子在暴露于循环凝血丝氨酸蛋白酶因子后引发凝血级联反应。血管损伤暴露了表达组织因子的内皮下细胞，从而引起与预先存在的血浆因子viia(fviia)形成钙依赖性高亲和力复合物。丝氨酸蛋白酶fviia结合到组织因子促进了fx快速裂解为fxa和fix快速裂解为fixa。所得fxa和活性膜表面的蛋白水解活性于是无法有效地将少量凝血酶原转化为凝血酶。fxa产生的凝血酶引发血小板活化，并且将微量的原辅因子：因子v(fv)和因子viii(fviii)活化成为活性辅因子：因子va(fva)和因子viiia(fviiia)。fixa与fviiia在血小板表面上复合，形成内在液化酶(tenase)复合物，从而引起fxa快速产生。fxa与fva复合，在活化的血小板表面上形成凝血酶原酶复合物，其引起凝血酶原快速裂解为凝血酶。
5.除了组织因子-fviia复合物外，最近的研究表明，组织因子-fviia-fxa复合物也能够活化fviii，从而在初始阶段提供额外水平的fviiia。外在路径首要之处在于通过有限量的凝血酶的活化来引发凝血，而内在路径通过显著扩增初始信号来维持凝血。
6.细胞表面表达的许多组织因子被“加密”，为了完全参与凝血，必须被“解密”。目前，细胞表面组织因子“解密”的机制尚不清楚，但是，阴离子磷脂的暴露在此过程中起着重要作用。健康细胞会主动将阴离子磷脂(例如磷脂酰丝氨酸(ps))隔离到质膜的内部小叶上。在细胞损伤、活化或胞质ca
2
水平增加之后，这种双层不对称性消失，导致外部小叶上ps暴露增加，从而增加了细胞表面组织因子-fviia复合物的比活性。已知ps暴露会降低组织因子-fviia复合物活化fix和fx的表观km，但其它机制可能包括组织因子或组织因子-fviia的构象重排以及随后的底物结合位点暴露。


技术实现要素：

7.本文提供包括附接到基础树脂的抗组织因子抗体或其抗原结合片段的亲和色谱树脂以及其使用方法。
8.本文提供亲和色谱树脂，其包括附接到基础树脂的抗组织因子抗体或其抗原结合片段，所述抗组织因子抗体或其抗原结合片段包含包含seq id no:1、2或9和3的cdr的重链可变结构域和包含seq id no:4、5和6的cdr的轻链可变结构域。
9.在本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的一些实施例中，重链可变结构域包含与seq id no:7至少90％相同的序列，并且轻链可变结构域包含与seq id no:8至少90％相同的序列。在本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的一些实施例中，重链可变结构域包含seq id no:7，并且轻链可变结构域包含seq id no:8。
10.在本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的一些实施例中，基础树脂为琼脂糖凝胶。在本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的一些实施例中，基础树脂为任何载体材料。在本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的一些实施例中，载体材料为琼脂糖或capto树脂。在本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的一些实施例中，抗组织因子抗体或其抗原结合片段非共价附接到基础树脂。在本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的一些实施例中，抗组织因子抗体或其抗原结合片段共价附接到基础树脂。
11.在本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的一些实施例中，抗组织因子抗体或其抗原结合片段通过在抗组织因子抗体或其抗原结合片段中的半胱氨酸和基础树脂上的化学基团之间形成二硫键而共价附接到基础树脂。在本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的一些实施例中，抗组织因子抗体或其抗原结合片段通过在抗组织因子抗体或抗原结合结构域的游离胺和基础树脂上的化学基团之间形成共价键而共价附接到基础树脂。
12.在本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的一些实施例中，基础树脂为cnbr活化的或n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化的固体载体材料。在本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的一些实施例中，共价键由下式i表示：
[0013][0014]
其中r表示抗组织因子抗体或其抗原结合片段。
[0015]
本文还提供包括本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的试剂盒。
[0016]
本文还提供纯化含有组织因子的蛋白质的方法，其包括使用本文描述的亲和色谱树脂中的任一种。本文描述的方法中的任一种的一些实施例另外包括：用包含含有组织因子的蛋白质的液体装载亲和色谱树脂；使用一种或多种洗涤缓冲液洗涤亲和色谱树脂；和使用洗脱缓冲液洗脱含有组织因子的蛋白质。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，包含含有组织因子的蛋白质的液体为澄清的液体培养基。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，包含含有组织因子的蛋白质的液体包含细胞裂解物。
[0017]
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，一种或多种洗涤缓冲液为：(i)包含磷酸盐缓冲盐水的第一洗涤缓冲液；和(ii)包含约0.01m至约0.2m柠檬酸盐并且ph为约4.5至约5.5的第二洗涤缓冲液。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，(i)第一洗涤缓冲液为磷酸盐缓冲盐水；和(ii)第二洗涤缓冲液为ph为5.0的0.1m柠檬酸盐。
[0018]
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，洗脱缓冲液包含0.01m至约0.2m乙酸盐并且ph为约2.5至约3.5。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，洗脱缓冲液包含0.1m乙酸盐并且ph为约2.9。
[0019]
本文还提供制造含有组织因子的蛋白质的方法，其包括：(i)使用包括使用本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的本文描述的方法中的任一种纯化含有组织因子的蛋白质；和(ii)对从步骤(i)获得的洗脱液执行一个或多个另外的单元操作。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，一个或多个另外的单元操作按顺序包含：执行低ph病毒灭活；执
行深层过滤；执行精制色谱；执行纳滤；和执行超滤和渗滤(uf/df)。
[0020]
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，含有组织因子的蛋白质为单链嵌合多肽。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，单链嵌合多肽包含：(i)第一靶标结合结构域；(ii)可溶性组织因子结构域；和(iii)第二靶标结合结构域。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和可溶性组织因子结构域彼此直接邻接。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，单链嵌合多肽另外包含介于第一靶标结合结构域与可溶性组织因子结构域之间的接头序列。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域彼此直接邻接。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，单链嵌合多肽另外包含介于可溶性组织因子结构域与第二靶标结合结构域之间的接头序列。
[0021]
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的抗原。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的表位。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域包含相同的氨基酸序列。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到不同的抗原。
[0022]
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个为抗原结合结构域。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个结合到选自以下的组的靶标：cd16a、cd28、cd3、cd33、cd20、cd19、cd22、cd123、il-1r、il-1、vegf、il-6r、il-4、il-10、pdl-1、tigit、pd-1、tim3、ctla4、mica、micb、il-6、il-8、tnfα、cd26、cd36、ulbp2、cd30、cd200、igf-1r、muc4ac、muc5ac、trop-2、cmet、egfr、her1、her2、her3、psma、cea、b7h3、epcam、bcma、p-钙粘素、ceacam5、ul16结合蛋白、hla-dr、dll4、tyro3、axl、mer、cd122、cd155、pdgf-dd、tgf-β受体ii(tgf-βrii)的配体、tgf-βriii的配体、dnam-1的配体、nkp46的配体、nkp44的配体、nkg2d的配体、nkp30的配体、scmhci的配体、scmhcii的配体、sctcr的配体、il-1的受体、il-2的受体、il-3的受体、il-7的受体、il-8的受体、il-10的受体、il-12的受体、il-15的受体、il-17的受体、il-18的受体、il-21的受体、pdgf-dd的受体、干细胞因子(scf)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(flt3l)的受体、mica的受体、micb的受体、ulp16结合蛋白的受体、cd155的受体、cd122的受体和cd28的受体。
[0023]
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个为可溶性白介素、可溶性细胞因子蛋白或可溶性细胞表面蛋白。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性白介素、可溶性细胞因子蛋白或可溶性细胞表面蛋白选自以下的组：il-1、il-2、il-3、il-7、il-8、il-10、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21、pdgf-dd、scf、flt3l、mica、micb和ulp16结合蛋白。
[0024]
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个为可溶性白介素受体、可溶性细胞因子受体或可溶性细胞表面受体。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性白介素受体、可溶性细胞因子受体或可溶性细胞表面受体为可溶性tgf-β受体ii(tgf-βrii)、可溶性tgf-βriii、可溶性nkg2d、可溶性nkp30、可溶性nkp44、可溶性nkp46、可溶性dnam-1、scmhci、scmhcii、sctcr、
可溶性cd155或可溶性cd28。
[0025]
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性组织因子结构域为可溶性人组织因子结构域。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性人组织因子结构域包含与seq id no:10至少80％相同的序列。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性组织因子结构域不包含以下中的任一个：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；和在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
[0026]
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性组织因子结构域包含以下中的一个或多个：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；和在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
[0027]
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，单链嵌合多肽另外包含在其n和/或c端的一个或多个另外的靶标结合结构域。
[0028]
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，含有组织因子的蛋白质为多链嵌合多肽。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，多链嵌合多肽包含：(a)第一嵌合多肽，其包含：(i)第一靶标结合结构域；(ii)可溶性组织因子结构域；和(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；(b)第二嵌合多肽，其包含：(i)一对亲和结构域中的第二结构域；和(ii)第二靶标结合结构域，其中第一嵌合多肽和第二嵌合多肽通过一对亲和结构域中的第一结构域和第二结构域的结合而缔合。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和可溶性组织因子结构域在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽另外包含介于第一嵌合多肽中的第一靶标结合结构域与可溶性组织因子结构域之间的接头序列。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性组织因子结构域和一对亲和结构域中的第一结构域在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽另外包含介于第一嵌合多肽中的可溶性组织因子结构域与一对亲和结构域中的第一结构域之间的接头序列。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，一对亲和结构域中的第二结构域和第二靶标结合结构域在第二嵌合多肽中彼此直接邻接。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第二嵌合多肽另外包含介于第二嵌合多肽中的一对亲和结构域中的第二结构域与第二靶标结合结构域之间的接头序列。
[0029]
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标
结合结构域特异性结合到相同的抗原。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到不同的抗原。
[0030]
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个为抗原结合结构域。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个特异性结合到选自以下的组的靶标：cd16a、cd28、cd3、cd33、cd20、cd19、cd22、cd123、il-1r、il-1、vegf、il-6r、il-4、il-10、pdl-1、tigit、pd-1、tim3、ctla4、mica、micb、il-6、il-8、tnfα、cd26、cd36、ulbp2、cd30、cd200、igf-1r、muc4ac、muc5ac、trop-2、cmet、egfr、her1、her2、her3、psma、cea、b7h3、epcam、bcma、p-钙粘素、ceacam5、ul16结合蛋白、hla-dr、dll4、tyro3、axl、mer、cd122、cd155、pdgf-dd、tgf-β受体ii(tgf-βrii)的配体、tgf-βriii的配体、dnam-1的配体、nkp46的配体、nkp44的配体、nkg2d的配体、nkp30的配体、scmhci的配体、scmhcii的配体、sctcr的配体、il-1的受体、il-2的受体、il-3的受体、il-7的受体、il-8的受体、il-10的受体、il-12的受体、il-15的受体、il-17的受体、il-18的受体、il-21的受体、pdgf-dd的受体、干细胞因子(scf)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(flt3l)的受体、mica的受体、micb的受体、ulp16结合蛋白的受体、cd155的受体、cd122的受体和cd28的受体。
[0031]
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个为可溶性白介素或细胞因子蛋白。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性白介素、细胞因子或配体蛋白选自以下的组：il-1、il-2、il-3、il-7、il-8、il-10、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21、pdgf-dd、scf和flt3l。
[0032]
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个为可溶性白介素或细胞因子受体。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性受体为可溶性tgf-β受体ii(tgf-βrii)、可溶性tgf-βriii、可溶性nkg2d、可溶性nkp30、可溶性nkp44、可溶性nkp46、可溶性dnam-1、scmhci、scmhcii、sctcr、可溶性cd155或可溶性cd28。
[0033]
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽另外包含一个或多个另外的靶标结合结构域。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第二嵌合多肽另外包含一个或多个另外的靶标结合结构域。
[0034]
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性组织因子结构域为可溶性人组织因子结构域。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性人组织因子结构域包含与seq id no:10至少80％相同的序列。
[0035]
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性组织因子结构域不包含以下中的任一个：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；和在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
[0036]
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性组织因子结构域包含以下
中的一个或多个：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；和在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
[0037]
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，一对亲和结构域是来自人il-15受体的α链(il15rα)的寿司结构域和可溶性il-15。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，一对亲和结构域选自由以下组成的组：芽胞杆菌核糖核酸酶和芽胞杆菌核糖核酸酶抑制子、pka和akap、基于突变核糖核酸酶i片段的衔接子/对接标签模块以及基于蛋白质突触蛋白、突触结合蛋白、突触泡蛋白和snap25的相互作用的snare模块。
[0038]
还提供通过本文描述的方法中的任一种制造的含有组织因子的蛋白质。本文还提供包括本文描述的制造的含有组织因子的蛋白质中的任一种的药物组合物。
[0039]
如本文所用，术语“嵌合”是指多肽包括最初来源于两个不同来源(例如两种天然存在的不同蛋白质，例如来自相同或不同物种)的氨基酸序列(例如结构域)。例如，嵌合多肽可包括来自至少两种不同的天然存在的人蛋白质的结构域。在一些实例中，嵌合多肽可包括作为合成序列的结构域(例如，scfv)和衍生自天然存在的蛋白质(例如，天然存在的人蛋白质)的结构域。在一些实施例中，嵌合多肽可包括至少两个不同的结构域，其为合成序列(例如，两个不同的scfv)。
[0040]“抗原结合结构域”是能够特异性结合到一种或多种不同抗原的一个或多个蛋白质结构域(例如，由来自单个多肽的氨基酸形成或由来自两个或多于两个多肽(例如，相同或不同的多肽)的氨基酸形成)。在一些实例中，抗原结合结构域可能以与天然存在的抗体相似的特异性和亲和力结合到抗原或表位。在一些实施例中，抗原结合结构域可以是抗体或其片段。在一些实施例中，抗原结合结构域可以包括替代支架。本文描述抗原结合结构域的非限制性实例。抗原结合结构域的另外的实例是本领域已知的。
[0041]“可溶性组织因子结构域”是指与缺少跨膜结构域和细胞内结构域的野生型哺乳动物组织因子蛋白(例如，野生型人组织因子蛋白)的段具有至少70％同一性(例如，至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或100％相同)的多肽。本文描述可溶性组织因子结构域的非限制性实例。
[0042]
术语“可溶性白介素蛋白”在本文中用于指成熟并且分泌的白介素蛋白或其生物活性片段。在一些实例中，可溶性白介素蛋白可以包括与野生型成熟并且分泌的哺乳动物白介素蛋白(例如，野生型人白介素蛋白)至少70％相同、至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同的序列，并且保留其生物活性。本文描述可溶性白介素蛋白的非限制性实例。
[0043]
术语“可溶性细胞因子蛋白”在本文中用于指成熟并且分泌的细胞因子蛋白或其生物活性片段。在一些实例中，可溶性细胞因子蛋白可以包括与野生型成熟并且分泌的哺乳动物白介素蛋白(例如，野生型人白介素蛋白)至少70％相同、至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同的序列，并且
保留其生物活性。本文描述可溶性细胞因子蛋白的非限制性实例。
[0044]
术语“可溶性白介素受体”在本文中以最广泛的意义用于指一种多肽，其缺少能够结合一个或多个其天然配体(例如，在生理条件下，例如在室温下、在磷酸盐缓冲盐水中)的跨膜结构域(和任选的细胞内结构域)。例如，可溶性白介素受体可以包括与野生型白介素受体的细胞外结构域至少70％相同(例如，至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同)的序列，并且保留其特异性结合到一个或多个其天然配体的能力，但缺少其跨膜结构域(并且任选地，还缺少其细胞内结构域)。本文描述可溶性白介素受体的非限制性实例。
[0045]
术语“可溶性细胞因子受体”在本文中以最广泛的意义用于指一种多肽，其缺少能够结合一个或多个其天然配体(例如，在生理条件下，例如在室温下、在磷酸盐缓冲盐水中)的跨膜结构域(和任选的细胞内结构域)。例如，可溶性细胞因子受体可以包括与野生型细胞因子受体的细胞外结构域至少70％相同(例如，至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同)的序列，并且保留其特异性结合到一个或多个其天然配体的能力，但缺少其跨膜结构域(并且任选地，还缺少其细胞内结构域)。本文描述了可溶性细胞因子受体的非限制性实例。
[0046]
术语“抗体”在本文中以其最广泛的意义使用，并且包括某些类型的免疫球蛋白分子，其包括一个或多个特异性结合到抗原或表位的抗原结合结构域。抗体具体包括例如完整抗体(例如，完整免疫球蛋白)、抗体片段和多特异性抗体。抗原结合结构域的一个实例是由vh-vl二聚体形成的抗原结合结构域。本文描述抗体的另外的实例。抗体的另外的实例是本领域已知的。
[0047]“亲和力”是指抗原结合位点与其结合配偶体(例如，抗原或表位)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外说明，否则如本文所用，“亲和力”是指固有结合亲和力，其反映抗原结合结构域与抗原或表位的成员之间的1:1相互作用。分子x与其配偶体y的亲和力可以通过解离平衡常数(kd)表示。在下文中更详细地描述贡献于解离平衡常数的动力学组分。亲和力可以通过本领域已知的常见方法来测量，包括本文描述的方法。亲和力可以例如使用表面等离子体共振(spr)技术(例如，)或生物层干涉测量术(例如，)来确定。确定对抗原结合结构域和其对应抗原或表位的亲和力的另外方法是本领域已知的。
[0048]
如本文所用，“多链多肽”是指包含两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)蛋白链(例如，至少第一嵌合多肽和第二多肽)的多肽，其中两个或更多个蛋白链通过非共价键缔合形成四级结构。
[0049]
如本文所用的“单链多肽”是指单蛋白质链。
[0050]
术语“一对亲和结构域”是以小于小于1
×
10-7
m(例如，小于1
×
10-8
m、小于1
×
10-9
m、小于1
×
10-10
m或小于1
×
10-11
m)的kd彼此特异性结合的两个不同的蛋白质结构域。在一些实例中，一对亲和结构域可以是一对天然存在的蛋白质。在一些实施例中，一对亲和结构域可以是一对合成蛋白质。本文描述亲和结构域对的非限制性实例。
[0051]
术语“表位”是指特异性结合到抗原结合结构域的抗原的一部分。表位可以例如由表面可接近的氨基酸残基和/或糖侧链组成，并且可以具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，与前者的结合而非
与后者的结合可能会丢失。表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基和不直接参与结合的其它氨基酸残基。鉴别与抗原结合结构域结合的表位的方法是本领域已知的。
[0052]
术语“治疗”是指改善病症的至少一种症状。在一些实例中，所治疗的病症是癌症，并且改善癌症的至少一种症状包括减少异常增殖、基因表达、信号传导、翻译和/或因子的分泌。一般来说，治疗方法包括将治疗有效量的组合物给予需要或已确定为需要这种治疗的受试者，所述组合物减少病症的至少一种症状。
[0053]
术语“纯化”意指为将蛋白质(例如，本文描述的示例性单链或多链嵌合多肽中的任一种)与含有蛋白质(例如，液体培养基蛋白质或存在于哺乳动物细胞中或从哺乳动物细胞分泌的一种或多种其它组分(例如，dna、rna、其它蛋白质、内毒素、病毒等))的流体中存在的一种或多种其它杂质(例如大量杂质)或组分分离而执行的步骤。可使用树脂、膜或结合蛋白质或污染物的任何其它固体载体执行纯化(例如，通过使用亲和色谱、疏水相互作用色谱、阴离子或阳离子交换色谱或分子筛色谱)。可使用至少一个色谱柱(例如，包括本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的本文描述的色谱柱中的任一个)从含有蛋白质的流体中纯化蛋白质。
[0054]
术语“精制”为本领域术语并且意指从含有接近最终期望纯度的蛋白质(例如，本文描述的单链或多链嵌合多肽中的任一种)的流体中去除剩余痕量或少量污染物或杂质而执行的步骤。举例来说，可通过使含有蛋白质的流体通过选择性结合蛋白质或存在于含有蛋白质的流体中的少量污染物或杂质的一个或多个色谱柱或一个或多个膜吸收器来执行精制。在这类实例中，一个或多个色谱柱或一个或多个膜吸收器的洗脱液/滤液含有蛋白质。
[0055]
除非另有定义，否则本文中所使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。本文描述了用于本发明的方法和材料；还可以使用其他在本领域已知的合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在是限制性的。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献通过全文引用的方式并入。在发生冲突的情况下，应以本说明书(包括定义)为准。
[0056]
本发明的其它特征和优点将通过以下详细描述和附图以及通过权利要求书变得显而易见。
附图说明
[0057]
图1为示出用于制造含有组织因子的蛋白质的示例性工作流的工作流示意图，其包括提供收获的细胞培养物(例如，基本上无细胞(例如，至少99％无细胞)的液体培养基)、使用本文描述的亲和色谱树脂中的任一种纯化含有组织因子的蛋白质、执行低ph病毒灭活、执行深层过滤、执行精制色谱、执行纳滤，和执行超滤/渗滤(在示意图中示出为“tff/最终配制物”)。
[0058]
图2为来自本文提供的示例性亲和色谱树脂(αtf抗体cnbr-琼脂糖凝胶亲和柱)的18t15-12s蛋白质的洗脱曲线，所述树脂用磷酸盐缓冲盐水平衡、装载、用磷酸盐缓冲盐水洗涤并且使用ph为2.9的0.1m乙酸洗脱。
[0059]
图3为不同亲和色谱树脂制剂的配体密度对结合能力的曲线图，其示出抗组织因子抗体偶联密度与树脂对含有组织因子的蛋白质如18t15-12s蛋白质的结合能力之间的关
系。
[0060]
图4为示出使用本文提供的示例性亲和色谱树脂(抗组织因子cnbr-琼脂糖凝胶亲和柱)对18t15-12s纯化的洗涤条件进行优化的曲线图。每个实验都使用用磷酸盐缓冲盐水平衡、装载、用磷酸盐缓冲盐水洗涤并且使用ph为2.9的0.1m乙酸洗脱的柱执行。蓝色示出的数据不包括使用ph为5.0的0.1m柠檬酸钠的另外的5cv洗涤，而橙色的数据包括使用ph为5.0的0.1m柠檬酸钠的另外的5cv洗涤。
[0061]
图5示出本文提供的新生成的示例性亲和色谱树脂(抗组织因子cnbr柱)的第一次运行的洗脱曲线，所述树脂通过用磷酸盐缓冲盐水平衡树脂、装载树脂、使用磷酸盐缓冲盐水洗涤树脂并且使用ph为2.9的0.1m乙酸洗脱树脂来纯化。
[0062]
图6示出使用图5中使用的同一柱进行的第51次纯化运行的洗脱曲线。第51次纯化运行通过用磷酸盐缓冲盐水平衡柱、装载柱、用磷酸盐缓冲盐水洗涤柱并且使用ph为2.9的0.1m乙酸洗脱柱来执行。
[0063]
图7示出承载活化间隔臂的nhs活化的琼脂糖凝胶高性能树脂的部分结构。
[0064]
图8示出含有伯氨基(r-nh2)的蛋白质配体与nhs活化的琼脂糖凝胶树脂的偶联。
[0065]
图9示出来自本文提供的示例性亲和色谱树脂(抗组织因子cnbr柱)的tgfrt15-tgfrs洗脱曲线的色谱图。深灰色线为在280nm处的吸光度，并且浅灰色线表示使用洗脱缓冲液(ph为2.9的0.1m乙酸)。
[0066]
图10示出来自本文提供的示例性亲和色谱树脂(抗组织因子cnbr柱)的2t2洗脱曲线的色谱图。深灰色线为在280nm处的吸光度，并且浅灰色线表示使用洗脱缓冲液(ph为2.9的0.1m乙酸)。
具体实施方式
[0067]
本文提供一种亲和色谱树脂，其包含附接到基础树脂的抗组织因子抗体或其抗原结合片段，所述抗组织因子抗体或其抗原结合片段包含包含seq id no:1、2或9和3的cdr的重链可变结构域和包含seq id no:4、5和6的cdr的轻链可变结构域。
[0068]
本文还提供包括本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的试剂盒。本文还提供纯化含有组织因子的蛋白质的方法，其包含使用本文描述的亲和色谱树脂中的任一种。本文还提供制造含有组织因子的蛋白质的方法，其包含：(i)使用本文描述的纯化含有组织因子的蛋白质的方法中的任一种纯化含有组织因子的蛋白质；和(ii)对从步骤(i)获得的洗脱液执行一个或多个另外的单元操作。本文还提供通过本文描述的方法中的任一种制造的含有组织因子的蛋白质。本文还提供包含本文描述的制造的含有组织因子的蛋白质中的任一种的药物组合物。
[0069]
在一些实施例中，如本文描述的亲和色谱树脂对含有组织因子的蛋白质的结合能力可为约0.5mg/ml至约6.0mg/ml(例如，约0.5mg/ml至约5.5mg/ml、约0.5mg/ml至约5.0mg/ml、约0.5mg/ml至约4.5mg/ml、约0.5mg/ml至约4.0mg/ml、约0.5mg/ml至约3.5mg/ml、约0.5mg/ml至约3.0mg/ml、约0.5mg/ml至约2.5mg/ml、约0.5mg/ml至约2.0mg/ml、约0.5mg/ml至约1.5mg/ml、约0.5mg/ml至约1.0mg/ml、约1.0mg/ml至约6.0mg/ml、约1.0mg/ml至约5.5mg/ml、约1.0mg/ml至约5.0mg/ml、约1.0mg/ml至约4.5mg/ml、约1.0mg/ml至约4.0mg/ml、约1.0mg/ml至约3.5mg/ml、约1.0mg/ml至约3.0mg/ml、约1.0mg/ml至约2.5mg/ml、约
1.0mg/ml至约2.0mg/ml、约1.0mg/ml至约1.5mg/ml、约1.5mg/ml至约6.0mg/ml、约1.5mg/ml至约5.5mg/ml、约1.5mg/ml至约5.0mg/ml、约1.5mg/ml至约4.5mg/ml、约1.5mg/ml至约4.0mg/ml、约1.5mg/ml至约3.5mg/ml、约1.5mg/ml至约3.0mg/ml、约1.5mg/ml至约2.5mg/ml、约1.5mg/ml至约2.0mg/ml、约2.0mg/ml至约6.0mg/ml、约2.0mg/ml至约5.5mg/ml、约2.0mg/ml至约5.0mg/ml、约2.0mg/ml至约4.5mg/ml、约2.0mg/ml至约4.0mg/ml、约2.0mg/ml至约3.5mg/ml、约2.0mg/ml至约3.0mg/ml、约2.0mg/ml至约2.5mg/ml、约2.5mg/ml至约6.0mg/ml、约2.5mg/ml至约5.5mg/ml、约2.5mg/ml至约5.0mg/ml、约2.5mg/ml至约4.5mg/ml、约2.5mg/ml至约4.0mg/ml、约2.5mg/ml至约3.5mg/ml、约2.5mg/ml至约3.0mg/ml、约3.0mg/ml至约6.0mg/ml、约3.0mg/ml至约5.5mg/ml、约3.0mg/ml至约5.0mg/ml、约3.0mg/ml至约4.5mg/ml、约3.0mg/ml至约4.0mg/ml、约3.0mg/ml至约3.5mg/ml、约3.5mg/ml至约6.0mg/ml、约3.5mg/ml至约5.5mg/ml、约3.5mg/ml至约5.0mg/ml、约3.5mg/ml至约4.5mg/ml、约3.5mg/ml至约4.0mg/ml、约4.0mg/ml至约6.0mg/ml、约4.0mg/ml至约5.5mg/ml、约4.0mg/ml至约5.0mg/ml、约4.0mg/ml至约4.5mg/ml、约4.5mg/ml至约6.0mg/ml、约4.5mg/ml至约5.5mg/ml、约4.5mg/ml至约5.0mg/ml、约5.0mg/ml至约6.0mg/ml、约5.0mg/ml至约5.5mg/ml或约5.5mg/ml至约6.0mg/ml)。
[0070]
如本文所用，“亲和色谱”是指基于抗原和抗体、酶和底物、受体和配体、或蛋白质和核酸之间的高度特异性相互作用来分离溶液或混合物的方法。亲和色谱(例如，蛋白质a、蛋白质g、蛋白质l或金属螯合物亲和色谱)为特异性纯化靶蛋白质的有效方法，其具有高产量回收和低水平的污染蛋白质和起始混合物中的其它组分如细胞培养物上清液、血清和血浆。一旦获得包含靶蛋白质的澄清液体或混合物，亲和色谱就可与一种或多种不同纯化技术(例如，离子交换分离、疏水相互作用分离)的组合一起用于纯化靶蛋白质。
[0071]
基于抗体(例如，单克隆或多克隆)的免疫亲和色谱已广泛用作研究、开发和制造领域中纯化特异性抗原或含有抗原的蛋白质(例如，含有人组织因子的蛋白质)的方法/过程。对于免疫亲和方法，将抗体(例如，单克隆)或抗体混合物(例如，多克隆)共价固定(例如，偶联)到固体载体材料如cnbr活化的琼脂糖凝胶、nhs-琼脂糖凝胶和适用于蛋白质偶联或固定的其它相关珠/树脂上。固体载体材料为共价附接到生物特异性配体的任何材料，其中在亲和色谱中使用的材料的实例包括琼脂糖、纤维素、葡聚糖、聚丙烯酰胺、乳胶和受控微孔玻璃。有用的载体材料可具有如高表面积与体积比、易于为配体的共价附接而修饰的化学基团、最小的非特异性结合特性、良好的流动特征以及机械和化学稳定性的特性。
[0072]
组织因子
[0073]
人组织因子是263个氨基酸的跨膜蛋白，其含有三个结构域：(1)219个氨基酸的n端胞外结构域(残基1-219)；(2)22个氨基酸的跨膜结构域(残基220-242)；和(3)21个氨基酸的胞质c端尾(残基242-263)((uniprotkb标识符编号：p13726)。胞质尾在ser253和ser258处含有两个磷酸化位点，在cys245处含有一个s-棕榈酰化位点。没有发现胞质结构域的缺失或突变影响组织因子凝血活性。组织因子在蛋白质胞内结构域中cys245处具有一个s-棕榈酰化位点。cys245位于胞内结构域的氨基酸端，并且靠近膜表面。组织因子跨膜结构域由单跨度的α-螺旋构成。
[0074]
由两个纤连蛋白iii型结构域构成的组织因子的细胞外结构域通过六氨基酸接头与跨膜结构域连接。这一接头提供构象灵活性，以使组织因子细胞外结构域与其跨膜结构
域和胞质结构域解偶联。每个组织因子纤连蛋白iii型模块均由两个重叠的β折叠构成，其中顶层折叠结构域含有三个反平行的β链，而底层折叠含有四个β链。β链通过β环在链βa和βb、βc和βd以及βe和βf之间连接，其在两个模块中均构象保守。有三个短的α螺旋段连接β链。组织因子的独特特征是链β10与链β11之间的17个氨基酸的β-发夹，这不是纤连蛋白超家族的常见成分。n端结构域还在β6f与β7g之间含有一个12个氨基酸的环，所述环不存在于c端结构域，并且是组织因子特有的。这种纤连蛋白iii型结构域结构是免疫球蛋白样家族蛋白质折叠的特征，并且在广泛多种细胞外蛋白中是保守的。
[0075]
一旦酶原fvii与组织结合形成活性组织因子-fviia复合物，就可通过有限的蛋白水解将其迅速转化成fviia。fviia以大约0.1nm(血浆fvii的1％)的浓度作为酶循环，也可以直接结合到组织因子。组织因子与fviia在组织因子-fviia复合物上的变构相互作用极大地增加了fviia的酶促活性：小的发色肽基底物的水解速率增加约20到100倍，并且天然大分子底物fix和fx的激活速率增加接近一百万倍。与结合到组织因子时fviia活性位点的变构激活相一致，磷脂双层上组织因子-fviia复合物的形成(即，当磷脂酰基-l-丝氨酸暴露在膜表面时)以ca
2
依赖性方式将fix或fx激活速率再增加1,000倍。相对于游离fviia，组织因子-fviia-磷脂复合物对fx激活的大约百万倍总体增加是凝血级联反应的关键调节点。
[0076]
fvii是约50kda的单链多肽，由406个氨基酸残基组成，具有n端富含γ-羧基谷氨酸(gla)的结构域、两个表皮生长因子样结构域(egf1和efg2)和c端丝氨酸蛋白酶结构域。fvii通过在egf2与蛋白酶结构域之间的短接头区中ile-154-arg
152
键的特异性蛋白水解裂解而被激活为fviia。这种裂解引起轻链和重链通过cys
135
和cys
262
的单个二硫键固定在一起。fviia通过其n端gla结构域以ca
2
依赖性方式结合磷脂膜。gla结构域的c端紧邻芳香族堆叠和两个egf结构域。芳香族堆叠将gla连接到结合单个ca
2
离子的egf1结构域。占用这一ca
2
结合位点会增加fviia酰胺分解活性和组织因子缔合。催化三联体由his
193
、asp
242
和ser
344
组成，并且fviia蛋白酶结构域内单个ca
2
离子的结合对其催化活性至关重要。fvii对fviia的蛋白水解激活释放了ile
153
处新形成的氨基端，使其向后折叠并且插入激活袋中，与asp
343
的羧酸盐形成盐桥，以生成氧阴离子孔。这一盐桥的形成对于fviia活性至关重要。但是，在蛋白水解激活后，游离的fviia中不会发生氧阴离子孔的形成。结果，fviia以酶原样状态循环，血浆蛋白酶抑制剂不能很好识别所述状态，使其以大约90分钟的半衰期循环。
[0077]
fviia活性位点在膜表面上方的组织因子介导的定位对于fviia朝向同源底物很重要。游离fviia在结合到膜上时采用稳定扩展结构，其活性位点定位在膜表面上方约fviia与组织因子结合后，fva活性位点将重新定位为更靠近膜约这种调节可帮助fviia催化三联体与靶标底物裂解位点适当对齐。使用无gla结构域的fviia，已显示活性位点仍位于膜上方相似的距离，证明即使在没有fviia-膜相互作用的情况下，组织因子也能够完全支持fviia活性位点定位。另外的数据显示，只要组织因子细胞外结构域以某种方式系栓到膜表面，组织因子就支持完全fviia蛋白水解活性。但是，将fviia的活性位点提高到膜表面上方大于会大大降低组织因子-fviia复合物激活fx的能力，但不会降低组织因子-fviia的酰胺分解活性。
[0078]
丙氨酸扫描诱变已用于评定组织因子细胞外结构域中特定氨基酸侧链对与fviia相互作用的作用(gibbs等人,《生物化学(biochemistry)》33(47):14003-14010,1994；
schullek等人,《生物化学杂志(j biol chem)》269(30):19399-19403,1994)。丙氨酸取代鉴别出有限数量的残基位置，在这些位置处，丙氨酸置换引起对fviia结合的亲和力降低5到10倍。发现这些残基侧链中的大多数在晶体结构中充分暴露于溶剂，与大分子配体相互作用一致。fviia配体结合位点位于两个模块之间边界处的宽广区上。在c模块中，位于突出的b-c环上的残基arg
135
和phe
140
提供与fviia的独立接触。leu
133
位于手指状结构的基底部，并且挤入两个模块之间的裂缝中。这提供由lys
20
、thr
60
、asp
58
和ile
22
组成的重要结合残基的主要簇的连续性。thr
60
仅部分暴露于溶剂，并且可能起局部结构作用，而不是与配体显著接触。结合位点延伸到模块间角的凹面，其涉及glu
24
和gln
110
，并且可能涉及更远的残基val
207
。结合区从asp58延伸到由lys
48
、lys
46
、gln
37
、asp
44
和trp
45
形成的凸表面区。trp
45
和asp
44
不会独立地与fviia相互作用，表明trp
45
位置处的突变效应可能反映这一侧链对邻近asp
44
和gln
37
侧链的局部堆积的结构重要性。相互作用区还包括两个表面暴露的芳香族残基phe
76
和tyr
78
，其在n模块中形成疏水簇的一部分。
[0079]
组织因子-fviia的已知生理底物是fvii、fix和fx以及某些蛋白酶激活受体。突变分析已鉴别出许多残基，当突变时，所述残基支持对小肽基底物的完全fviia酰胺分解活性，但缺少支持大分子底物(即，fvii、fix和fx)激活的能力(ruf等人,《生物化学杂志》267(31):22206-22210,1992；ruf等人,《生物化学杂志》267(9):6375-6381,1992；huang等人,《生物化学杂志》271(36):21752-21757,1996；kirchhofer等人,《生物化学》39(25):7380-7387,2000)。已显示在残基159-165处的组织因子环区和在这一柔性环中或附近的残基对于组织因子-fviia复合物的蛋白水解活性至关重要。这定义了提出的组织因子的底物结合位点外区，所述区与fviia活性位点相距甚远。甘氨酸残基被稍大的残基丙氨酸取代会大大损害组织因子-fviia的蛋白水解活性。这表明甘氨酸提供的柔性对于用于组织因子大分子底物识别的残基159-165的环至关重要。
[0080]
还证明了残基lys
165
和lys
166
对于底物识别和结合很重要。这些残基中的任何一个突变为丙氨酸均会引起组织因子辅助因子功能的显著降低。在大多数组织因子-fviia结构中，lys
165
和lys
166
彼此背对，lys
165
指向fviia，而lys
166
指向晶体结构中的底物结合位点外区。fviia的lys
165
和gla
35
之间的推定盐桥形成将支持组织因子与fviia的gla结构域相互作用调节底物识别的观点。这些结果表明，组织因子胞外结构域的c端部分直接与fix和fx的gla结构域、可能的邻近egf1结构域相互作用，并且fviia gla结构域的存在可以直接或间接调节这些相互作用。
[0081]
抗组织因子抗体和抗原结合抗体片段
[0082]
在一些实例中，抗组织因子抗体为人源化或完全人抗组织因子抗体(参见例如美国专利号7,968,094和美国专利号8,007,795中描述的抗组织因子抗体)。
[0083]
在一些实施例中，抗组织因子抗体可包括重链可变结构域，其包括以下一组cdr序列：包括dynvy(seq id no:1)的cdr1；包括yidpyngitiydqnfkg(seq id no:2)的cdr2；以及包括dvttaldf(seq id no:3)的cdr3。
[0084]
在一些实施例中，抗组织因子抗体可包括重链可变结构域，其包括以下一组cdr序列：包括dynvy(seq id no:1)的cdr1；包括yidpyngitiydqnlkg(seq id no:9)的cdr2；以及包括dvttaldf(seq id no:3)的cdr3。
[0085]
示例性重链可变结构域(seq id no:7)qiqlvqsggevkkpgasvrvsckasgysftdynvy
wvrqspgkglewigyidpyngitiydqnfkgkatltvdkststaymelsslrsedtavyfcardvttaldfwgqgttvtvss
[0086]
示例性重链(seq id no:127)qiqlvqsggevkkpgasvrvsckasgysftdynvywvrqspgkglewigyidpyngitiydqnfkgkatltvdkststaymelsslrsedtavyfcardvttaldfwgqgttvtvssefastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0087]
编码示例性重链的cdna(seq id no:128)cagatccagctggtgcagagcggcggcgaggtgaagaagcccggcgccagcgtgagggtgagctgcaaggccagcggctacagcttcaccgactacaacgtgtactgggtgaggcagagccccggcaagggcctggagtggatcggctacatcgacccctacaacggcatcaccatctacgaccagaacttcaagggcaaggccaccctgaccgtggacaagagcaccagcaccgcctacatggagctgagcagcctgaggagcgaggacaccgccgtgtacttctgcgccagggacgtgaccaccgccctggacttctggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagcgagttcgccagcaccaagggccccagcgtgttccccctggcccccagcagcaagagcaccagcggcggcaccgccgccctgggctgcctggtgaaggactacttccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttccccgccgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcgtggtgaccgtgcccagcagcagcctgggcacccagacctacatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaggtggagcccaagagctgcgacaagacccacacctgccccccctgccccgcccccgagctgctgggcggccccagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagcaggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccacgaggaccccgaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagcccagggaggagcagtacaacagcacctacagggtggtgagcgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtgagcaacaaggccctgcccgcccccatcgagaagaccatcagcaaggccaagggccagcccagggagccccaggtgtacaccctgccccccagcagggacgagctgaccaagaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccccgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagagcaggtggcagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgagccccggcaagtga
[0088]
在一些实施例中，抗组织因子抗体可包括重链可变结构域，其包括与seq id no:7至少70％相同(例如，至少72％、至少74％、至少75％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。
[0089]
在一些实施例中，抗组织因子抗体可包括重链可变结构域，其包括与seq id no:127至少70％相同(例如，至少72％、至少74％、至少75％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。
[0090]
在一些实施例中，抗组织因子抗体可包括轻链可变结构域，其包括以下一组cdr序列：包括lasqtidtwla(seq id no:4)的cdr1；包括aatnlad(seq id no:5)的cdr2；以及包括qqvysspft(seq id no:6)的cdr3。
[0091]
示例性轻链可变结构域(seqidno:8)diqmtqspaslsasvgdrvtitclasqtidtwlawylqkpgkspqlliyaatnladgvpsrfsgsgsgtdfsftisslqpedfatyycqqvysspftfgqgtkleik
[0092]
示例性轻链(seqidno:129)diqmtqspaslsasvgrvtitclasqtidtwlawlqkpgkspqlliyaatnldgvpsrfsgsgsgtdfsfisslqpedfatyycqqvysspftfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[0093]
编码示例性轻链的cdna(seqidno:130)gacatccagatgacccagagccccgccagcctgagcgccagcgtgggcgacagggtgaccatcacctgcctggccagccagaccatcgacacctggctggcctggtacctgcagaagcccggcaagagcccccagctgctgatctacgccgccaccaacctggccgacggcgtgcccagcaggttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcagcttcaaccatcagcagcctgcagcccgaggacttcgccacctactactgccagcaggtgtactagcagccccttcaccttcggccagggcaccaagctggagatcaagaggaccgtggccgcccccagcgtgttcatcttcccccccagcgacgagcagctgaagagcggcaccgccagcgtggtgtgcctgctgaacaacttctaccccagggaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaacagccaggagagcgtgaccgagcaggacagcaaggacagcacctacagcctgagcagcaccctgaccctgagcaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaggtgacccaccagggcctgagcagccccgtgaccaagagcttcaacaggggcgagtgctga
[0094]
在一些实施例中，抗组织因子抗体可包括轻链可变结构域，其包括与seq id no:8至少70％相同(例如，至少72％、至少74％、至少75％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。
[0095]
在一些实施例中，抗组织因子抗体可包括轻链可变结构域，其包括与seq id no:129至少70％相同(例如，至少72％、至少74％、至少75％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。
[0096]
抗组织因子抗体的非限制性实例可包括：重链可变结构域，其包括与seq id no:7至少70％相同(例如，至少72％、至少74％、至少75％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列，以及轻链可变结构域，其包括与seq id no:8至少70％相同(例如，至少72％、至少74％、至少75％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。
[0097]
抗组织因子抗体的非限制性实例可包括：重链可变结构域，其包括与seq id no:127至少70％相同(例如，至少72％、至少74％、至少75％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列，以及轻链可变结构域，其包括与seq id no:129至少70％相同(例如，至少72％、至少74％、至少75％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。
[0098]
在本文描述的抗组织因子抗体中的任一种的一些实施例中，抗组织因子抗体以以
下结合常数(kd)结合到组织因子：约0.1nm至约1μm(例如，约0.1nm至约800nm、约0.1nm至约750nm、约0.1nm至约700nm、约0.1nm至约650nm、约0.1nm至约600nm、约0.1nm至约550nm、约0.1nm至约500nm、约0.1nm至约450nm、约0.1nm至约400nm、约0.1nm至约350nm、约0.1nm至约300、约0.1nm至约250nm、约0.1nm至约200nm、约0.1nm至约150nm、约0.1nm至约100nm、约0.1nm至约80nm、约0.1nm至约60nm、约0.1nm至约50nm、约0.1nm至约40nm、约0.1nm至约25nm、约0.1nm至约20nm、约0.1nm至约15nm、约0.1nm至约10nm、约0.1nm至约8nm、约0.1nm至约6nm、约0.1nm至约5nm、约0.1nm至约4nm、约0.1nm至约3nm、约0.1nm至约2nm、约0.1nm至约1nm、约0.1nm至约0.8nm、约0.1nm至约0.6nm、约0.1nm至约0.4nm、约0.1nm至约0.2nm；约0.2nm至约1μm、约0.2nm至约800nm、约0.2nm至约750nm、约0.2nm至约700nm、约0.2nm至约650nm、约0.2nm至约600nm、约0.2nm至约550nm、约0.2nm至约500nm、约0.2nm至约450nm、约0.2nm至约400nm、约0.2nm至约350nm、约0.2nm至约300、约0.2nm至约250nm、约0.2nm至约200nm、约0.2nm至约150nm、约0.2nm至约100nm、约0.2nm至约80nm、约0.2nm至约60nm、约0.2nm至约50nm、约0.2nm至约40nm、约0.2nm至约25nm、约0.2nm至约20nm、约0.2nm至约15nm、约0.2nm至约10nm、约0.2nm至约8nm、约0.2nm至约6nm、约0.2nm至约5nm、约0.2nm至约4nm、约0.2nm至约3nm、约0.2nm至约2nm、约0.2nm至约1nm、约0.2nm至约0.8nm、约0.2nm至约0.6nm、约0.2nm至约0.4nm、约0.2nm至约0.2nm、约0.4nm至约1μm、约0.4nm至约800nm、约0.4nm至约750nm、约0.4nm至约700nm、约0.4nm至约650nm、约0.4nm至约600nm、约0.4nm至约550nm、约0.4nm至约500nm、约0.4nm至约450nm、约0.4nm至约400nm、约0.4nm至约350nm、约0.4nm至约300、约0.4nm至约250nm、约0.4nm至约200nm、约0.4nm至约150nm、约0.4nm至约100nm、约0.4nm至约80nm、约0.4nm至约60nm、约0.4nm至约50nm、约0.4nm至约40nm、约0.4nm至约25nm、约0.4nm至约20nm、约0.4nm至约15nm、约0.4nm至约10nm、约0.4nm至约8nm、约0.4nm至约6nm、约0.4nm至约5nm、约0.4nm至约4nm、约0.4nm至约3nm、约0.4nm至约2nm、约0.4nm至约1nm、约0.4nm至约0.8nm、约0.4nm至约0.6nm、约0.5nm至约1μm、约0.5nm至约800nm、约0.5nm至约750nm、约0.5nm至约700nm、约0.5nm至约650nm、约0.5nm至约600nm、约0.5nm至约550nm、约0.5nm至约500nm、约0.5nm至约450nm、约0.5nm至约400nm、约0.5nm至约350nm、约0.5nm至约300、约0.5nm至约250nm、约0.5nm至约200nm、约0.5nm至约150nm、约0.5nm至约100nm、约0.5nm至约80nm、约0.5nm至约60nm、约0.5nm至约50nm、约0.5nm至约40nm、约0.5nm至约25nm、约0.5nm至约20nm、约0.5nm至约15nm、约0.5nm至约10nm、约0.5nm至约8nm、约0.5nm至约6nm、约0.5nm至约5nm、约0.5nm至约4nm、约0.5nm至约3nm、约0.5nm至约2nm、约0.5nm至约1nm、约0.5nm至约0.8nm、约0.5nm至约0.6nm、约0.6nm至约1μm、约0.6nm至约800nm、约0.6nm至约750nm、约0.6nm至约700nm、约0.6nm至约650nm、约0.6nm至约600nm、约0.6nm至约550nm、约0.6nm至约500nm、约0.6nm至约450nm、约0.6nm至约400nm、约0.6nm至约350nm、约0.6nm至约300、约0.6nm至约250nm、约0.6nm至约200nm、约0.6nm至约150nm、约0.6nm至约100nm、约0.6nm至约80nm、约0.6nm至约60nm、约0.6nm至约50nm、约0.6nm至约40nm、约0.6nm至约25nm、约0.6nm至约20nm、约0.6nm至约15nm、约0.6nm至约10nm、约0.6nm至约8nm、约0.6nm至约6nm、约0.6nm至约5nm、约0.6nm至约4nm、约0.6nm至约3nm、约0.6nm至约2nm、约0.6nm至约1nm、约0.6nm至约0.8nm、约1nm至约1μm、约1nm至约800nm、约1nm至约750nm、约1nm至约700nm、约1nm至约650nm、约1nm至约600nm、约1nm至约550nm、约1nm至约500nm、约1nm至约450nm、约1nm至约400nm、约1nm至约350nm、约1nm至约
300、约1nm至约250nm、约1nm至约200nm、约1nm至约150nm、约1nm至约100nm、约1nm至约80nm、约1nm至约60nm、约1nm至约50nm、约1nm至约40nm、约1nm至约25nm、约1nm至约20nm、约1nm至约15nm、约1nm至约10nm、约1nm至约8nm、约1nm至约6nm、约1nm至约5nm、约1nm至约4nm、约1nm至约3nm、约1nm至约2nm、约2nm至约1μm、约2nm至约800nm、约2nm至约750nm、约2nm至约700nm、约2nm至约650nm、约2nm至约600nm、约2nm至约550nm、约2nm至约500nm、约2nm至约450nm、约2nm至约400nm、约2nm至约350nm、约2nm至约300、约2nm至约250nm、约2nm至约200nm、约2nm至约150nm、约2nm至约100nm、约2nm至约80nm、约2nm至约60nm、约2nm至约50nm、约2nm至约40nm、约2nm至约25nm、约2nm至约20nm、约2nm至约15nm、约2nm至约10nm、约2nm至约8nm、约2nm至约6nm、约2nm至约5nm、约2nm至约4nm、约2nm至约3nm、约5nm至约1μm、约5nm至约800nm、约5nm至约750nm、约5nm至约700nm、约5nm至约650nm、约5nm至约600nm、约5nm至约550nm、约5nm至约500nm、约5nm至约450nm、约5nm至约400nm、约5nm至约350nm、约5nm至约300、约5nm至约250nm、约5nm至约200nm、约5nm至约150nm、约5nm至约100nm、约5nm至约80nm、约5nm至约60nm、约5nm至约50nm、约5nm至约40nm、约5nm至约25nm、约5nm至约20nm、约5nm至约15nm、约5nm至约10nm、约5nm至约8nm、约5nm至约6nm、约10nm至约1μm、约10nm至约800nm、约10nm至约750nm、约10nm至约700nm、约10nm至约650nm、约10nm至约600nm、约10nm至约550nm、约10nm至约500nm、约10nm至约450nm、约10nm至约400nm、约10nm至约350nm、约10nm至约300、约10nm至约250nm、约10nm至约200nm、约10nm至约150nm、约10nm至约100nm、约10nm至约80nm、约10nm至约60nm、约10nm至约50nm、约10nm至约40nm、约10nm至约25nm、约10nm至约20nm、约10nm至约15nm、约20nm至约1μm、约20nm至约800nm、约20nm至约750nm、约20nm至约700nm、约20nm至约650nm、约20nm至约600nm、约20nm至约550nm、约20nm至约500nm、约20nm至约450nm、约20nm至约400nm、约20nm至约350nm、约20nm至约300、约20nm至约250nm、约20nm至约200nm、约20nm至约150nm、约20nm至约100nm、约20nm至约80nm、约20nm至约60nm、约20nm至约50nm、约20nm至约40nm、约50nm至约1μm、约50nm至约800nm、约50nm至约750nm、约50nm至约700nm、约50nm至约650nm、约50nm至约600nm、约50nm至约550nm、约50nm至约500nm、约50nm至约450nm、约50nm至约400nm、约50nm至约350nm、约50nm至约300、约50nm至约250nm、约50nm至约200nm、约50nm至约150nm、约50nm至约100nm、约50nm至约80nm、约100nm至约1μm、约100nm至约800nm、约100nm至约750nm、约100nm至约700nm、约100nm至约650nm、约100nm至约600nm、约100nm至约550nm、约100nm至约500nm、约100nm至约450nm、约100nm至约400nm、约100nm至约350nm、约100nm至约300、约100nm至约250nm、约100nm至约200nm、约100nm至约150nm、约250nm至约1μm、约250nm至约800nm、约250nm至约750nm、约250nm至约700nm、约250nm至约650nm、约250nm至约600nm、约250nm至约550nm、约250nm至约500nm、约250nm至约450nm、约250nm至约400nm、约250nm至约350nm、约250nm至约300、约400nm至约1μm、约400nm至约800nm、约400nm至约750nm、约400nm至约700nm、约400nm至约650nm、约400nm至约600nm、约400nm至约550nm、约400nm至约500nm、约400nm至约450nm、约500nm至约1μm、约500nm至约800nm、约500nm至约750nm、约500nm至约700nm、约500nm至约650nm、约500nm至约600nm、约500nm至约550nm、约600nm至约1μm、约600nm至约800nm、约600nm至约750nm、约600nm至约700nm、约600nm至约650nm、约750nm至约1μm、约750nm至约800nm、约800nm至约1μm或约950nm至约1μm)。
[0099]
在一些实施例中，抗组织因子抗体可为igg(例如，igg1、igg2、igg3和igg4)(例如，
人igg1、人igg2、人igg3和人igg4)、iga(例如，人iga)、ige(例如，人ige)或igm(例如，人igm)。
[0100]
在一些实施例中，抗组织因子抗体为人或人源化igg1抗体。在一些实施例中，抗组织因子抗体为人或人源化igg4抗体。
[0101]
在一些实施例中，抗组织因子抗体可包括igg1 fc区。在一些实施例中，抗组织因子抗体可包括重链恒定结构域，其包含与seq id no:102或seq id no:103至少70％相同(例如，至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同)的序列。
[0102]
重链恒定区(seq id no:102)efastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0103]
重链恒定区(seq id no:103)efastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcpscpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
[0104]
亲和色谱树脂
[0105]
本文提供一种亲和色谱树脂，其包含附接到基础树脂的抗组织因子抗体或其抗原结合片段，所述抗组织因子抗体或其抗原结合片段包含包含seq id no:1、2或9和3的cdr的重链可变结构域和包含seq id no:4、5和6的cdr的轻链可变结构域。在一些实施例中，重链可变结构域包含与seq id no:7至少90％相同的序列，并且轻链可变结构域包含与seq id no:8至少90％相同的序列。在一些实施例中，重链可变结构域包含seq id no:7，并且轻链可变结构域包含seq id no:8。
[0106]
在一些实施例中，基础树脂为琼脂糖凝胶。在一些实施例中，基础树脂为capto或琼脂糖。在一些实施例中，基础树脂(或基质或固定相)为天然聚合物，其包括但不限于纤维素、琼脂糖或壳聚糖；合成聚合物，其包括但不限于丙烯酰胺和乙烯基共聚物、丙烯酸聚合物或聚甲基丙烯酸酯、聚(苯乙烯-二乙烯基-苯)共聚物；或无机材料，其包括但不限于羟基磷灰石、二氧化硅、玻璃或氧化锆。在一些实施例中，抗组织因子抗体或其抗原结合片段非共价附接到基础树脂。在一些实施例中，抗组织因子抗体或其抗原结合片段共价附接到基础树脂。在一些实施例中，抗组织因子抗体或其抗原结合片段通过在抗组织因子抗体或其抗原结合片段中的半胱氨酸和基础树脂上的化学基团之间形成二硫键而共价附接到基础树脂。在一些实施例中，抗组织因子抗体或其抗原结合片段通过在抗组织因子抗体或抗原结合结构域的游离胺和基础树脂上的化学基团之间形成共价键而共价附接到基础树脂。在一些实施例中，基础树脂为cnbr活化的或n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化的固体载体材料。在一些实施例中，共价键由下式i表示：
[0107]
[0108]
其中，r表示抗组织因子抗体或其抗原结合片段。
[0109]
在一些实施例中，nhs活化的琼脂糖凝胶被设计用于共价偶联含有伯氨基(最常见的附接形式)的配体(通常为抗原或抗体)。在一些实施例中，nhs活化的琼脂糖凝胶的基质基于具有由表氯醇附接并且由n-羟基琥珀酰亚胺活化的10个原子间隔臂(6-氨基己酸)的高度交联的琼脂糖珠(图7)。在一些实施例中，nhs活化的琼脂糖凝胶4fast flow的基质基于具有14个原子间隔臂的高度交联的琼脂糖珠。在一些实施例中，由于基础基质的优异亲水性，蛋白质对nhs活化的琼脂糖凝胶的非特异性吸附(这可降低靶蛋白质的结合能力)可忽略不计。在一些实施例中，基质在高ph下为稳定的以允许严格的洗涤程序(取决于偶联配体的ph稳定性)。在一些实施例中，含有氨基的配体如蛋白质通过酯键处的亲核攻击而快速并且自发地偶联，以产生非常稳定的酰胺键(图8)。在一些实施例中，酰胺键在高达13.0的ph下为稳定的，这使得nhs活化的琼脂糖凝胶适用于需要高ph条件的应用。
[0110]
在一些实施例中，cnbr-活化的琼脂糖凝胶为预活化树脂，其用于通过溴化氰方法将抗体或其它含有-nh2基团的大蛋白质偶联到琼脂糖凝胶培养基上，而无需中间间隔臂。在一些实施例中，cnbr-活化的琼脂糖凝胶用于通过将抗体或其它含有-nh2基团的大蛋白质偶联到cnbr-活化的琼脂糖凝胶的基质来固定它们。在一些实施例中，cnbr-活化的琼脂糖凝胶4fast flow为通过使琼脂糖凝胶4fast flow与溴化氰(cnbr)反应产生的珠状、高度交联的预活化基质。在一些实施例中，cnbr活化的琼脂糖凝胶4fast flow基于以固定化单克隆抗体作为配体的抗原-抗体反应。
[0111]
在一些实施例中，试剂盒包含本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的亲和色谱树脂。
[0112]
基于抗体(例如，单克隆或多克隆)的免疫亲和色谱为广泛使用的方法/过程，以使用包含附接到基础树脂的抗体或抗原结合片段的亲和色谱树脂纯化特异性抗原或含有抗原的蛋白质(例如，含有人组织因子的蛋白质)。对于免疫亲和方法，将抗体(例如，单克隆)或抗体混合物(例如，多克隆)共价固定(例如，偶联)到固体载体材料(例如，基础树脂)如cnbr活化的琼脂糖凝胶、nhs-琼脂糖凝胶和适用于蛋白质偶联或固定的其它相关珠/树脂上。在一些实施例中，基础树脂为共价附接到生物特异性配体的任何材料。在一些实施例中，基础树脂为非共价附接到生物特异性配体的任何材料。在一些实施例中，用于亲和色谱的基础树脂的实例包括琼脂糖、capto、纤维素、陶瓷、葡聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、二氧化硅、乳胶、受控微孔玻璃和合成/有机聚合物。有用的基础树脂可具有如高表面积与体积比、易于为配体的共价附接而修饰的化学基团、最小的非特异性结合特性、良好的流动特征以及机械和化学稳定性的特性。
[0113]
在一些实施例中，基础树脂为巯基偶联树脂，其中抗体或其抗原结合片段通过基础树脂上的游离巯基和碘乙酰基共价附接到基础树脂。在一些实施例中，基础树脂为胺偶联树脂，其中胺偶联树脂具有反应性醛基，其与伯胺反应以形成席夫碱，然后用合适的还原剂(例如，氰基硼氢化钠)还原以在抗体或其抗原结合片段与基础树脂之间形成共价键。在一些实施例中，基础树脂为nhs活化的树脂，其中抗体或抗原结合片段通过反应性nhs基团和伯胺结合到树脂，以形成共价键。在一些实施例中，基础树脂为固定化蛋白质a、固定化蛋白质b或固定化蛋白质a/g，其中基础树脂结合抗体或其抗原结合片段的恒定结构域，确保抗原结合结构域背对最佳结合的基础树脂。
[0114]
在一些实施例中，色谱柱用于亲和色谱，其中色谱柱包含选自由以下组成的组的亲和色谱树脂：cnbr-活化的琼脂糖凝胶、nhs-琼脂糖凝胶、琼脂糖、capto、纤维素、陶瓷、葡聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、二氧化硅、乳胶、受控微孔玻璃和合成/有机聚合物。
[0115]
纯化含有组织因子的蛋白质的方法
[0116]
本文提供纯化含有组织因子的蛋白质的方法，其包含使用本文描述的亲和色谱树脂中的任一种。在一些实施例中，方法包含：用包含含有组织因子的蛋白质的液体装载亲和色谱树脂；使用一种或多种洗涤缓冲液洗涤亲和色谱树脂；和使用洗脱缓冲液洗脱含有组织因子的蛋白质。在一些实施例中，包含含有组织因子的蛋白质的液体为澄清的液体培养基。在一些实施例中，包含含有组织因子的蛋白质的液体包含细胞裂解物。
[0117]
在一些实施例中，一种或多种洗涤缓冲液为：(i)包含磷酸盐缓冲盐水的第一洗涤缓冲液；和(ii)包含约0.01m至约0.2m柠檬酸盐并且ph为约4.5至约5.5的第二洗涤缓冲液。在一些实施例中，第一洗涤缓冲液为磷酸盐缓冲盐水，和第二洗涤缓冲液为ph为5.0的0.1m柠檬酸盐。在一些实施例中，洗脱缓冲液包含0.01m至约0.2m乙酸盐并且ph为约2.5至约3.5。在一些实施例中，洗脱缓冲液包含0.1m乙酸盐并且ph为约2.9。
[0118]
在一些实施例中，第二洗涤缓冲液包含约0.01m至约0.2m(例如，约0.01m至约0.18m、约0.01m至约0.16m、约0.01m至约0.14m、约0.01m至约0.12m、约0.01m至约0.1m、约0.01m至约0.08m、约0.01m至约0.06m、约0.01m至约0.05m、约0.01m至约0.04m、约0.01m至约0.03m、约0.01m至约0.02m、约0.02m至约0.2m、约0.02m至约0.18m、约0.02m至约0.16m、约0.02m至约0.14m、约0.02m至约0.12m、约0.02m至约0.1m、约0.02m至约0.08m、约0.02m至约0.06m、约0.02m至约0.05m、约0.02m至约0.04m、约0.02m至约0.03m、约0.03m至约0.2m、约0.03m至约0.18m、约0.03m至约0.16m、约0.03m至约0.14m、约0.03m至约0.12m、约0.03m至约0.1m、约0.03m至约0.08m、约0.03m至约0.06m、约0.03m至约0.05m、约0.03m至约0.04m、约0.04m至约0.2m、约0.04m至约0.18m、约0.04m至约0.16m、约0.04m至约0.14m、约0.04m至约0.12m、约0.04m至约0.1m、约0.04m至约0.08m、约0.04m至约0.06m、约0.04m至约0.05m、约0.05m至约0.2m、约0.05m至约0.18m、约0.05m至约0.16m、约0.05m至约0.14m、约0.05m至约0.12m、约0.05m至约0.1m、约0.05m至约0.08m、约0.05m至约0.06m、约0.06m至约0.2m、约0.06m至约0.18m、约0.06m至约0.16m、约0.06m至约0.14m、约0.06m至约0.12m、约0.06m至约0.1m、约0.06m至约0.08m、约0.08m至约0.2m、约0.08m至约0.18m、约0.08m至约0.16m、约0.08m至约0.14m、约0.08m至约0.12m、约0.08m至约0.1m、约0.1m至约0.2m、约0.1m至约0.18m、约0.1m至约0.16m、约0.1m至约0.14m、约0.1m至约0.12m、约0.12m至约0.2m、约0.12m至约0.18m、约0.12m至约0.16m、约0.12m至约0.14m、约0.14m至约0.2m、约0.14m至约0.18m、约0.14m至约0.16m、约0.16m至约0.2m、约0.16m至约0.18m或约0.18m至约0.2m)柠檬酸盐。
[0119]
在一些实施例中，第二洗涤缓冲液的ph为约4.5至约5.5(例如，约4.5至约5.4、约4.5至约5.3、约4.5至约5.2、约4.5至约5.1、约4.5至约5.0、约4.5至约4.9、约4.5至约4.8、约4.5至约4.7、约4.5至约4.6、约4.6至约5.5、约4.6至约5.4、约4.6至约5.3、约4.6至约5.2、约4.6至约5.1、约4.6至约5.0、约4.6至约4.9、约4.6至约4.8、约4.6至约4.7、约4.7至约5.5、约4.7至约5.4、约4.7至约5.3、约4.7至约5.2、约4.7至约5.1、约4.7至约5.0、约4.7至约4.9、约4.7至约4.8、约4.8至约5.5、约4.8至约5.4、约4.8至约5.3、约4.8至约5.2、约4.8至约5.1、约4.8至约5.0、约4.8至约4.9、约4.9至约5.5、约4.9至约5.4、约4.9至约5.3、
约4.9至约5.2、约4.9至约5.1、约4.9至约5.0、约5.0至约5.5、约5.0至约5.4、约5.0至约5.3、约5.0至约5.2、约5.0至约5.1、约5.1至约5.5、约5.1至约5.4、约5.1至约5.3、约5.1至约5.2、约5.2至约5.5、约5.2至约5.4、约5.2至约5.3、约5.3至约5.5、约5.3至约5.4或约5.4至约5.5)。
[0120]
在一些实施例中，洗脱缓冲液包含约0.01m至约0.2m(例如，约0.01m至约0.18m、约0.01m至约0.16m、约0.01m至约0.14m、约0.01m至约0.12m、约0.01m至约0.1m、约0.01m至约0.08m、约0.01m至约0.06m、约0.01m至约0.05m、约0.01m至约0.04m、约0.01m至约0.03m、约0.01m至约0.02m、约0.02m至约0.2m、约0.02m至约0.18m、约0.02m至约0.16m、约0.02m至约0.14m、约0.02m至约0.12m、约0.02m至约0.1m、约0.02m至约0.08m、约0.02m至约0.06m、约0.02m至约0.05m、约0.02m至约0.04m、约0.02m至约0.03m、约0.03m至约0.2m、约0.03m至约0.18m、约0.03m至约0.16m、约0.03m至约0.14m、约0.03m至约0.12m、约0.03m至约0.1m、约0.03m至约0.08m、约0.03m至约0.06m、约0.03m至约0.05m、约0.03m至约0.04m、约0.04m至约0.2m、约0.04m至约0.18m、约0.04m至约0.16m、约0.04m至约0.14m、约0.04m至约0.12m、约0.04m至约0.1m、约0.04m至约0.08m、约0.04m至约0.06m、约0.04m至约0.05m、约0.05m至约0.2m、约0.05m至约0.18m、约0.05m至约0.16m、约0.05m至约0.14m、约0.05m至约0.12m、约0.05m至约0.1m、约0.05m至约0.08m、约0.05m至约0.06m、约0.06m至约0.2m、约0.06m至约0.18m、约0.06m至约0.16m、约0.06m至约0.14m、约0.06m至约0.12m、约0.06m至约0.1m、约0.06m至约0.08m、约0.08m至约0.2m、约0.08m至约0.18m、约0.08m至约0.16m、约0.08m至约0.14m、约0.08m至约0.12m、约0.08m至约0.1m、约0.1m至约0.2m、约0.1m至约0.18m、约0.1m至约0.16m、约0.1m至约0.14m、约0.1m至约0.12m、约0.12m至约0.2m、约0.12m至约0.18m、约0.12m至约0.16m、约0.12m至约0.14m、约0.14m至约0.2m、约0.14m至约0.18m、约0.14m至约0.16m、约0.16m至约0.2m、约0.16m至约0.18m或约0.18m至约0.2m)乙酸盐。
[0121]
在一些实施例中，洗脱缓冲液的ph为约2.5至约3.5(例如，约2.5至约3.4、约2.5至约3.3、约2.5至约3.2、约2.5至约3.1、约2.5至约3.0、约2.5至约2.9、约2.5至约2.8、约2.5至约2.7、约2.5至约2.6、约2.6至约3.5、约2.6至约3.4、约2.6至约3.3、约2.6至约3.2、约2.6至约3.1、约2.6至约3.0、约2.6至约2.9、约2.6至约2.8、约2.6至约2.7、约2.7至约3.5、约2.7至约3.4、约2.7至约3.3、约2.7至约3.2、约2.7至约3.1、约2.7至约3.0、约2.7至约2.9、约2.7至约2.8、约2.8至约3.5、约2.8至约3.4、约2.8至约3.3、约2.8至约3.2、约2.8至约3.1、约2.8至约3.0、约2.8至约2.9、约2.9至约3.5、约2.9至约3.4、约2.9至约3.3、约2.9至约3.2、约2.9至约3.1、约2.9至约3.0、约3.0至约3.5、约3.0至约3.4、约3.0至约3.3、约3.0至约3.2、约3.0至约3.1、约3.1至约3.5、约3.1至约3.4、约3.1至约3.3、约3.1至约3.2、约3.2至约3.5、约3.2至约3.4、约3.2至约3.3、约3.3至约3.5、约3.3至约3.4或约3.4至约3.5)。
[0122]
制造含有组织因子的蛋白质的方法
[0123]
本文提供制造含有组织因子的蛋白质的方法，其包含：(i)使用本文描述的方法中的任一种纯化含有组织因子的蛋白质；和(ii)对从步骤(i)获得的洗脱液执行一个或多个添加单元操作。可在用于制造含有组织因子的蛋白质的过程中执行的单元操作的非限制性实例包括：捕获蛋白质、纯化蛋白质、精制蛋白质、灭活病毒、调节含有蛋白质的流体的离子浓度和/或ph，并且过滤含有蛋白质的流体。图1中描绘制造含有组织因子的蛋白质的非限
制性方法。
[0124]
在一些实施例中，一个或多个另外的单元操作按顺序包括：执行低ph病毒灭活、执行深层过滤、执行精制色谱、执行纳滤，和执行超滤和渗滤(uf/df)。
[0125]
本文还提供通过本文描述的方法中的任一种制造的含有组织因子的蛋白质。在一些实施例中，药物组合物包含制造的含有组织因子的蛋白质。
[0126]
单链嵌合多肽
[0127]
含有组织因子的蛋白质的非限制性实例为单链嵌合多肽，其包括：(i)第一靶标结合结构域(例如，本文描述或本领域已知的靶标结合结构域中的任一种)、(ii)可溶性组织因子结构域(例如，本文描述或本领域已知的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)，以及(iii)作为第二靶标结合结构域(例如，本文描述或本领域已知的靶标结合结构域中的任一种)。
[0128]
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)与可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)彼此直接邻接。在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含介于第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性第一靶标结合结构域)与可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)之间的接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)与第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)彼此直接邻接。在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含介于可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)与第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之间的接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。
[0129]
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)与第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)彼此直接邻接。在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，单链嵌合多肽还包含在第一靶标结合结构域(例如，本文描述或本领域已知的任一个示例性靶标结合结构域)与第二靶标结合结构域(例如，本文描述或本领域已知的任一个示例性靶标结合结构域)之间的接头序列(例如，本文描述或本领域已知的任一个示例性接头序列)。在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，
[0130]
第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)与可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)彼此直接邻接。在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含介于第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)与可溶性组织因子结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性可溶性组织因子结构域)之间的接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例
性接头序列)。
[0131]
本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例可以进一步包括一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)位于其n端和/或c端的另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)。
[0132]
在一些实施例中，单链嵌合多肽可以包括一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)位于其n端的另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)。在一些实施例中，位于单链嵌合多肽n端的一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一可以直接邻接第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)，或可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包括接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)，所述接头序列介于单链嵌合多肽n端的至少一个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一与第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)或可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)之间。
[0133]
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，单链嵌合多肽包括一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)位于其c端的另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)。在一些实施例中，位于单链嵌合多肽c端的一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一直接邻接第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)，或可溶性组织因子结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性可溶性组织因子结构域)。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)，所述接头序列介于单链嵌合多肽c端的至少一个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一与第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)或可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)之间。
[0134]
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，单链嵌合多肽包含一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)位于其n端和其c端的另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)。在一些实施例中，位于单链嵌合多肽n端的一个或多个其它抗原结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一直接邻接第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)，或可溶性组织因子结构域(例如本文所
述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包括接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)，所述接头序列介于n端的一个或多个其它抗原结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一与第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)或可溶性组织因子结构域(例如任一种示例性可溶性组织因子结构域)之间。在一些实施例中，位于c端的一个或多个其它抗原结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一直接邻接第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)，或可溶性组织因子结构域(例如任一种示例性可溶性组织因子结构域)。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包括接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)，所述接头序列介于c端的一个或多个其它抗原结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一与第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)或可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)之间。
[0135]
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的两个或更多个(例如三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)特异性地结合到相同抗原。在一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的两个或更多个(例如三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)特异性地结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的两个或更多个(例如三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)包括相同的氨基酸序列。
[0136]
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)各自特异性地结合到相同抗原。在一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一
个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)各自特异性地结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)另外的靶标结合结构域各自包含相同的氨基酸序列。
[0137]
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)特异性地结合到不同抗原。
[0138]
在任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个靶标结合结构域中的一个或多个是抗原结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性抗原结合结构域)。在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域各自是抗原结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性抗原结合结构域)。在一些实施例中，抗原结合结构域可包括scfv或单结构域抗体。
[0139]
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一种或多种另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的一种或多种(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十种)特异性地结合到选自由以下组成的组的靶标：cd16a、cd28、cd3、cd33、cd20、cd19、cd22、cd123、il-1r、il-1、vegf、il-6r、il-4、il-10、pdl-1、tigit、pd-1、tim3、ctla4、mica、micb、il-6、il-8、tnfα、cd26、cd36、ulbp2、cd30、cd200、igf-1r、muc4ac、muc5ac、trop-2、cmet、egfr、her1、her2、her3、psma、cea、b7h3、epcam、bcma、p-钙粘素、ceacam5、ul16结合蛋白、hla-dr、dll4、tyro3、axl、mer、cd122、cd155、pdgf-dd、tgf-β受体ii(tgf-βrii)的配体、tgf-βriii的配体、dnam1的配体、nkp46的配体、nkp44的配体、nkg2d的配体、nkp30的配体、scmhci的配体、scmhcii的配体、sctcr的配体、il-1的受体、il-2的受体、il-3的受体、il-7的受体、il-8的受体、il-10的受体、il-12的受体、il-15的受体、il-17的受体、il-18的受体、il-21的受体、pdgf-dd的受体、干细胞因子(scf)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(flt3l)的受体、mica的受体、micb的受体、ulp16结合蛋白的受体、cd155的受体、cd122的受体和cd28的受体。
[0140]
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的一个或多个是可溶性白介素或细胞因子蛋白。可溶性白介素蛋白和可溶性细胞因子蛋白的非限制性实例包括：il-1、il-2、il-3、il-7、il-8、il-10、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21、pdgf-dd和scf。
[0141]
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域
(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的一个或多个是可溶性白介素或细胞因子受体。可溶性白介素受体和可溶性细胞因子受体的非限制性实例包括：可溶性tgf-β受体ii(tgf-βrii)、可溶性tgf-βriii、可溶性nkg2d、可溶性nkp30、可溶性nkp44、可溶性nkp46、可溶性dnam-1、scmhci、scmhcii、sctcr、可溶性cd155、可溶性cd122、可溶性cd3或可溶性cd28。
[0142]
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述的任一种靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述的任一种靶标结合结构域)和一种或多种另外的靶标结合结构域(例如本文所述的任一种靶标结合结构域)可以各自独立地特异性结合到选自以下的组的靶标：cd16a、cd33、cd20、cd19、cd22、cd123、pdl-1、tigit、pd-1、tim3、ctla4、mica、micb、il-6、il-8、tnfα、cd26、cd36、ulbp2、cd30、cd200、igf-1r、muc4ac、muc5ac、trop-2、cmet、egfr、her1、her2、her3、psma、cea、b7h3、epcam、bcma、p-钙粘素、ceacam5、ul16结合蛋白、hla-dr、dll4、tyro3、axl、mer、cd122、cd155、pdgf-dd、tgf-β受体ii(tgf-βrii)的配体、tgf-βriii的配体、dnam1的配体、nkp46的配体、nkp44的配体、nkg2d的配体、nkp30的配体、scmhci的配体、scmhcii的配体、sctcr的配体、pdgf-dd的受体、干细胞因子(scf)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(flt3l)的受体、mica的受体、micb的受体、ulp16结合蛋白的受体、cd155的受体和cd122的受体。
[0143]
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的一个或多个是可溶性白介素或细胞因子蛋白。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性白介素或细胞因子蛋白选自以下的组：il-1、il-2、il-3、il-7、il-8、il-10、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21、pdgf-dd和scf。
[0144]
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的一个或多个是可溶性白介素或细胞因子受体。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性受体是可溶性tgf-β受体ii(tgf-βrii)、可溶性tgf-βriii、tnfα的可溶性受体、il-4的可溶性受体，或il-10的可溶性受体。
[0145]
在一些实施例中，单链嵌合多肽具有与seq id no:22-29至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的核酸序列或氨基酸序列。
[0146]
可溶性组织因子结构域
[0147]
在本文所描述的任何多肽、组合物或方法的一些实施例中，可溶性组织因子结构域可为缺少信号序列、跨膜结构域和细胞内结构域的野生型组织因子多肽。在一些实例中，
可溶性组织因子结构域可为组织因子突变体，其中野生型组织因子多肽缺少信号序列、跨膜结构域和细胞内结构域，并且已在所选择的氨基酸处被进一步修饰。在一些实例中，可溶性组织因子结构域可以是可溶性人组织因子结构域。在一些实例中，可溶性组织因子结构域可以是可溶性小鼠组织因子结构域。在一些实例中，可溶性组织因子结构域可为大鼠可溶性组织因子结构域。下文显示可溶性人组织因子结构域、小鼠可溶性组织因子结构域、大鼠可溶性组织因子结构域和突变可溶性组织因子结构域的非限制性实例。
[0148]
示例性可溶性人组织因子结构域(seq id no:10)sgttntvaaynltwkstnfktilewepkpvnqvytvqistksgdwkskcfyttdtecdltdeivkdvkqtylarvfsypagnvestgsageplyenspeftpyletnlgqptiqsfeqvgtkvnvtvedertlvrrnntflslrdvfgkdliytlyywkssssgkktaktntneflidvdkgenycfsvqavipsrtvnrkstdspvecmgqekgefre
[0149]
编码可溶性人组织因子结构域的示例性核酸(seq id no:11)agcggcacaaccaacacagtcgctgcctataacctcacttggaagagcaccaacttcaaaaccatcctcgaatgggaacccaaacccgttaaccaagtttacaccgtgcagatcagcaccaagtccggcgactggaagtccaaatgtttctataccaccgacaccgagtgcgatctcaccgatgagatcgtgaaagatgtgaaacagacctacctcgcccgggtgtttagctaccccgccggcaatgtggagagcactggttccgctggcgagcctttatacgagaacagccccgaatttaccccttacctcgagaccaatttaggacagcccaccatccaaagctttgagcaagttggcacaaaggtgaatgtgacagtggaggacgagcggactttagtgcggcggaacaacacctttctcagcctccgggatgtgttcggcaaagatttaatctacacactgtattactggaagtcctcttcctccggcaagaagacagctaaaaccaacacaaacgagtttttaatcgacgtggataaaggcgaaaactactgtttcagcgtgcaagctgtgatcccctcccggaccgtgaataggaaaagcaccgatagccccgttgagtgcatgggccaagaaaagggcgagttccgggag
[0150]
示例性可溶性小鼠组织因子结构域(seq id no:12)agipekafnltwistdfktilewqpkptnytytvqisdrsrnwknkcfsttdtecdltdeivkdvtwayeakvlsvprrnsvhgdgdqlvihgeeppftnapkflpyrdtnlgqpviqqfeqdgrklnvvvkdsltlvrkngtfltlrqvfgkdlgyiityrkgsstgkktnitntnefsidveegvsycffvqamifsrktnqnspgsstvcteqwksflge
[0151]
示例性可溶性大鼠组织因子结构域(seq id no:13)agtppgkafnltwistdfktilewqpkptnytytvqisdrsrnwkykctgttdtecdltdeivkdvnwtyearvlsvpwrnsthgketlfgthgeeppftnarkflpyrdtkigqpviqkyeqggtklkvtvkdsftlvrkngtfltlrqvfgndlgyiltyrkdsstgrktntthtneflidvekgvsycffaqavifsrktnhkspesitkcteqwksvlge
[0152]
示例性突变可溶性人组织因子结构域(seq id no:14)sgttntvaaynltwkstnfatalewepkpvnqvytvqistksgdwkskcfyttdtecaltdeivkdvkqtylarvfsypagnvestgsageplyenspeftpyletnlgqptiqsfeqvgtkvnvtvedertlvarnntalslrdvfgkdliytlyywkssssgkktaktntneflidvdkgenycfsvqavipsrtvnrkstdspvecmgqekgefre
[0153]
示例性突变可溶性人组织因子结构域(seq id no:15)sgttntvaaynltwkstnfatalewepkpvnqvytvqistksgdakskcfyttdtecaltdeivkdvkqtylarvfsypagnvestgsageplaenspeftpyletnlgqptiqsfeqvgtkvnvtvedertlvarnntalslrdvfgkdliytlyywkssssgkktaktntneflidvdkgenycfsvqavipsrtvnrkstdspvecmgqekgefre
[0154]
在一些实施例中，可溶性组织因子结构域可包括与seq id no:10、12、13、14或15至少70％相同、至少72％相同、至少74％相同、至少76％相同、至少78％相同、至少80％相同、至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％
相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同的序列。在一些实施例中，可溶性组织因子结构域可包括seq id no:10、12、13、14或15的序列，其n端有一到二十个氨基酸(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)氨基酸已去除和/或其c端有一到二十个氨基酸(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)氨基酸已去除。
[0155]
如本领域中可了解，本领域技术人员将理解，在不同哺乳动物物种之间保守的氨基酸的突变更可能降低蛋白质的活性和/或结构稳定性，而在不同哺乳动物物种之间不具保守性的氨基酸的突变不太可能降低蛋白质的活性和/或结构稳定性。
[0156]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实例中，可溶性组织因子结构域不能结合到因子viia。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实例中，可溶性组织因子结构域不将非活性因子x转化为因子xa。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，多链嵌合多肽不刺激哺乳动物的凝血。
[0157]
在一些实例中，可溶性组织因子结构域可为可溶性人组织因子结构域。在一些实施例中，可溶性组织因子结构域可以是可溶性小鼠组织因子结构域。在一些实施例中，可溶性组织因子结构域可为可溶性大鼠组织因子结构域。
[0158]
在一些实例中，可溶性组织因子结构域不包括以下中的一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个或七个)：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；和在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。在一些实施例中，突变可溶性组织因子具有seq id no:14或seq id no:15的氨基酸序列。
[0159]
在一些实例中，可溶性组织因子结构域可由包括与seq id no:11至少70％相同、至少72％相同、至少74％相同、至少76％相同、至少78％相同、至少80％相同、至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同的序列的核酸编码。
[0160]
在一些实施例中，可溶性组织因子结构域的总长度可为约20个氨基酸至约220个氨基酸、约20个氨基酸至约215个氨基酸、约20个氨基酸至约210个氨基酸、约20个氨基酸至约205个氨基酸、约20个氨基酸至约200个氨基酸、约20个氨基酸至约195个氨基酸、约20个氨基酸至约190个氨基酸、约20个氨基酸至约185个氨基酸、约20个氨基酸至约180个氨基酸、约20个氨基酸至约175个氨基酸、约20个氨基酸至约170个氨基酸、约20个氨基酸至约165个氨基酸、约20个氨基酸至约160个氨基酸、约20个氨基酸至约155个氨基酸、约20个氨基酸至约150个氨基酸、约20个氨基酸至约145个氨基酸、约20个氨基酸至约140个氨基酸、约20个氨基酸至约135个氨基酸、约20个氨基酸至约130个氨基酸、约20个氨基酸至约125个氨基酸、约20个氨基酸至约120个氨基酸、约20个氨基酸至约115个氨基酸、约20个氨基酸至约110个氨基酸、约20个氨基酸至约105个氨基酸、约20个氨基酸至约100个氨基酸、约20个氨基酸至约95个氨基酸、约20个氨基酸至约90个氨基酸、约20个氨基酸至约85个氨基酸、约
20个氨基酸至约80个氨基酸、约20个氨基酸至约75个氨基酸、约20个氨基酸至约70个氨基酸、约20个氨基酸至约60个氨基酸、约20个氨基酸至约50个氨基酸、约20个氨基酸至约40个氨基酸、约20个氨基酸至约30个氨基酸。
[0161]
接头序列
[0162]
在一些实施例中，接头序列可为柔性接头序列。可使用的接头序列的非限制性实例描述于klein等人,《蛋白质工程、设计和选择(protein engineering,design&selection)》27(10):325-330,2014；priyanka等人,《蛋白质科学(protein sci.)》22(2):153-167,2013中。在一些实例中，接头序列是合成接头序列。
[0163]
在一些实施例中，本文描述的单链嵌合多肽中的任一种可以包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个接头序列(例如相同或不同的接头序列，例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。在一些实施例中，本文描述的单链嵌合多肽中的任一种可以包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个接头序列(例如相同或不同的接头序列，例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。
[0164]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽可包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个接头序列(例如相同或不同的接头序列，例如本文所描述或本领域已知的任一种示例性接头序列)。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二嵌合多肽可包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个接头序列(例如，相同或不同的接头序列，例如本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。
[0165]
在一些实施例中，接头序列的总长度可为1个氨基酸至约100个氨基酸、1个氨基酸至约90个氨基酸、1个氨基酸至约80个氨基酸、1个氨基酸至约70个氨基酸、1个氨基酸至约60个氨基酸、1个氨基酸至约50个氨基酸、1个氨基酸至约45个氨基酸、1个氨基酸至约40个氨基酸、1个氨基酸至约35个氨基酸、1个氨基酸至约30个氨基酸、1个氨基酸至约25个氨基酸、1个氨基酸至约24个氨基酸、1个氨基酸至约22个氨基酸、1个氨基酸至约20个氨基酸、1个氨基酸至约18个氨基酸、1个氨基酸至约16个氨基酸、1个氨基酸至约14个氨基酸、1个氨基酸至约12个氨基酸、1个氨基酸至约10个氨基酸、1个氨基酸至约8个氨基酸、1个氨基酸至约6个氨基酸、1个氨基酸至约4个氨基酸。
[0166]
在一些实施例中，接头富含甘氨酸(gly或g)残基。在一些实施例中，接头富含丝氨酸(ser或s)残基。在一些实施例中，接头富含甘氨酸和丝氨酸残基。在一些实施例中，接头具有一个或多个甘氨酸-丝氨酸残基对(gs)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个gs对。在一些实施例中，接头具有一个或多个gly-gly-gly-ser(gggs)(seq id no:16)序列，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个gggs(seq id no:16)序列。在一些实施例中，接头具有一个或多个gly-gly-gly-gly-ser(ggggs)(seq id no:17)序列，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个ggggs(seq id no:17)序列。在一些实施例中，接头具有一个或多个gly-gly-ser-gly(ggsg)(seq id no:18)序列，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个ggsg(seq id no:18)序列。
[0167]
在一些实施例中，接头序列可包含以下或由以下组成：ggggsggggsggggs(seq id no:19)。在一些实施例中，接头序列可由包含以下或由以下组成的核酸编码：ggcggtggagg
atccggaggaggtggctccggcggcggaggatct(seq id no:20)。
[0168]
在一些实施例中，接头序列可包含以下或由以下组成：gggsgggs(seq id no:21)。
[0169]
靶标结合结构域
[0170]
在本文描述的单或多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和/或另外的一个或多个靶标结合结构域可为抗原结合结构域(例如，本文描述或本领域已知的示例性抗原结合结构域中的任一种)、可溶性白介素或细胞因子蛋白(例如，本文描述的示例性可溶性白介素蛋白或可溶性细胞因子蛋白中的任一种)和可溶性白介素或细胞因子受体(例如，本文描述的示例性可溶性白介素受体或可溶性细胞因子受体中的任一种)。
[0171]
在本文描述的单或多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和/或一个或多个另外的靶标结合结构域的氨基酸总数可各自独立为约5个氨基酸至约1000个氨基酸、约5个氨基酸至约950个氨基酸、约5个氨基酸至约900个氨基酸、约5个氨基酸至约850个氨基酸、约5个氨基酸至约800个氨基酸、约5个氨基酸至约750个氨基酸、约5个氨基酸至约700个氨基酸、约5个氨基酸至约650个氨基酸、约5个氨基酸至约600个氨基酸、约5个氨基酸至约550个氨基酸、约5个氨基酸至约500个氨基酸、约5个氨基酸至约450个氨基酸、约5个氨基酸至约400个氨基酸、约5个氨基酸至约350个氨基酸、约5个氨基酸至约300个氨基酸、约5个氨基酸至约280个氨基酸、约5个氨基酸至约260个氨基酸、约5个氨基酸至约240个氨基酸、约5个氨基酸至约220个氨基酸、约5个氨基酸至约200个氨基酸、约5个氨基酸至约195个氨基酸、约5个氨基酸至约190个氨基酸、约5个氨基酸至约185个氨基酸、约5个氨基酸至约180个氨基酸、约5个氨基酸至约175个氨基酸、约5个氨基酸至约170个氨基酸、约5个氨基酸至约165个氨基酸、约5个氨基酸至约160个氨基酸、约5个氨基酸至约155个氨基酸、约5个氨基酸至约150个氨基酸、约5个氨基酸至约145个氨基酸、约5个氨基酸至约140个氨基酸、约5个氨基酸至约135个氨基酸、约5个氨基酸至约130个氨基酸、约5个氨基酸至约125个氨基酸、约5个氨基酸至约120个氨基酸、约5个氨基酸至约115个氨基酸、约5个氨基酸至约110个氨基酸、约5个氨基酸至约105个氨基酸、约5个氨基酸至约100个氨基酸、约5个氨基酸至约95个氨基酸、约5个氨基酸至约90个氨基酸、约5个氨基酸至约85个氨基酸、约5个氨基酸至约80个氨基酸、约5个氨基酸至约75个氨基酸、约5个氨基酸至约70个氨基酸、约5个氨基酸至约65个氨基酸、约5个氨基酸至约60个氨基酸、约5个氨基酸至约55个氨基酸、约5个氨基酸至约50个氨基酸、约5个氨基酸至约45个氨基酸、约5个氨基酸至约40个氨基酸、约5个氨基酸至约35个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约20个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约5个氨基酸至约10个氨基酸，
[0172]
本文描述的靶标结合结构域中的任一种可以小于1
×
10-7
m、小于1
×
10-8
m、小于1
×
10-9
m、小于1
×
10-10
m、小于1
×
10-11
m、小于1
×
10-12
m或小于1
×
10-13
m的解离平衡常数(kd)结合到其靶标。在一些实施例中，本文提供的抗原结合蛋白构建体可以约1
×
10-3
m至约1
×
10-5
m、约1
×
10-4
m至约1
×
10-6
m、约1
×
10-5
m至约1
×
10-7
m、约1
×
10-6
m至约1
×
10-8
m、约1
×
10-7
m至约1
×
10-9
m、约1
×
10-8
m至约1
×
10-10
m，或约1
×
10-9
m至约1
×
10-11
m(包括端点)的kd结合到鉴别的抗原。
[0173]
本文描述的靶标结合结构域中的任一种可以在约1pm至约30nm(例如，约1pm至约
25nm、约1pm至约20nm、约1pm至约15nm、约1pm至约10nm、约1pm至约5nm、约1pm至约2nm、约1pm至约1nm、约1pm至约950pm、约1pm至约900pm、约1pm至约850pm、约1pm至约800pm、约1pm至约750pm、约1pm至约700pm、约1pm至约650pm、约1pm至约600pm、约1pm至约550pm、约1pm至约500pm、约1pm至约450pm、约1pm至约400pm、约1pm至约350pm、约1pm至约300pm、约1pm至约250pm、约1pm至约200pm、约1pm至约150pm、约1pm至约100pm、约1pm至约90pm、约1pm至约80pm、约1pm至约70pm、约1pm至约60pm、约1pm至约50pm、约1pm至约40pm、约1pm至约30pm、约1pm至约20pm、约1pm至约10pm、约1pm至约5pm、约1pm至约4pm、约1pm至约3pm、约1pm至约2pm)之间的kd结合到其靶标。
[0174]
本文描述的靶标结合结构域中的任一种可以在约1nm至约10nm(例如，约1nm至约9nm、约1nm至约8nm、约1nm至约7nm、约1nm至约6nm、约1nm至约5nm、约1nm至约4nm、约1nm至约3nm、约1nm至约2nm、约2nm至约10nm、约2nm至约9nm、约2nm至约8nm、约2nm至约7nm、约2nm至约6nm、约2nm至约5nm、约2nm至约4nm、约2nm至约3nm、约3nm至约10nm、约3nm至约9nm、约3nm至约8nm、约3nm至约7nm、约3nm至约6nm、约3nm至约5nm、约3nm至约4nm、约4nm至约10nm、约4nm至约9nm、约4nm至约8nm、约4nm至约7nm、约4nm至约6nm、约4nm至约5nm、约5nm至约10nm、约5nm至约9nm、约5nm至约8nm、约5nm至约7nm、约5nm至约6nm、约6nm至约10nm、约6nm至约9nm、约6nm至约8nm、约6nm至约7nm、约7nm至约10nm、约7nm至约9nm、约7nm至约8nm、约8nm至约10nm、约8nm至约9nm和约9nm至约10nm)之间的kd结合到其靶标。
[0175]
可以使用本领域中已知的多种不同方法来确定本文描述的任一种抗原结合蛋白构建体的kd值(例如，电泳迁移变动分析、滤膜结合分析、表面等离振子体共振和生物分子结合动力学分析等)。
[0176]
抗原结合结构域
[0177]
在本文描述的单链或多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的抗原。在这些单链或多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的表位。在这些单链或多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域包括相同的氨基酸序列。
[0178]
在本文描述的单链或多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到不同的抗原。
[0179]
在本文描述的单链或多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个是抗原结合结构域。在本文描述的单链或多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自是抗原结合结构域。在本文描述的单链或多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，抗原结合结构域包括或为scfv或单结构域抗体(例如，vhh或vnar结构域)。
[0180]
在一些实例中，抗原结合结构域(例如，本文描述的抗原结合结构域中的任一种)可以特异性结合到以下中的任一个：cd16a(参见例如第9,035,026号美国专利中描述的那些)、cd28(参见例如第7,723,482号美国专利中描述的那些)、cd3(参见例如第9,226,962号美国专利中描述的那些)、cd33(参见例如第8,759,494号美国专利中描述的那些)、cd20(参见例如wo 2014/026054中描述的那些)、cd19(参见例如第9,701,758号美国专利中描述的那些)、cd22(参见例如wo 2003/104425中描述的那些)、cd123(参见例如wo 2014/130635中
描述的那些)、il-1r(参见例如第8,741,604号美国专利中描述的那些)、il-1(参见例如wo 2014/095808中描述的那些)、vegf(参见例如第9,090,684号美国专利中描述的那些)、il-6r(参见例如第7,482,436号美国专利中描述的那些)、il-4(参见例如第2012/0171197号美国专利申请公开中描述的那些)、il-10(参见例如第2016/0340413号美国专利申请公开中描述的那些)、pdl-1(参见例如drees等人,《蛋白质表达和纯化(protein express.purif.)》94:60-66,2014中所述的那些)、tigit(参见例如美国专利申请公开第2017/0198042号中所述的那些)、pd-1(参见例如美国专利第7,488,802号中所述的那些)、tim3(参见例如美国专利第8,552,156号中所述的那些、ctla4(参见例如wo 2012/120125中所述的那些)、mica(参见例如wo 2016/154585中所述的那些)、micb(参见例如美国专利第8,753,640号中所述的那些)、il-6(参见例如gejima等人,《人抗体(human antibodies)》11(4):121-129,2002中所述的那些)、il-8(参见例如美国专利第6,117,980号中所述的那些)、tnfα(参见例如geng等人,《免疫学研究(immunol.res.)》62(3):377-385,2015中所述的那些)、cd26(参见例如wo 2017/189526中所述的那些)、cd36(参见例如美国专利申请公开第2015/0259429号中所述的那些)、ulbp2(参见例如美国专利第9,273,136号中所述的那些)、cd30(参见例如homach等人,《斯堪的纳维亚免疫学杂志(scand.j.immunol.)》48(5):497-501,1998中所描述的那些)、cd200(参见例如第9,085,623号美国专利中所描述的那些)、igf-1r(参见例如第2017/0051063号美国专利申请公开中所描述的那些)、muc4ac(参见例如wo 2012/170470中所描述的那些)、muc5ac(参见例如第9,238,084号美国专利中所描述的那些)、trop-2(参见例如wo 2013/068946中所描述的那些)、cmet(参见例如edwardraja等人,《生物技术与生物工程(biotechnol.bioeng.)》106(3):367-375,2010中所描述的那些)、egfr(参见例如akbari等人,《蛋白质表达和纯化》127:8-15,2016中所描述的那些)、her1(参见例如第2013/0274446号美国专利申请公开中所描述的那些)、her2(参见例如cao等人,《生物技术快报(biotechnol.lett.)》37(7):1347-1354,2015中所描述的那些)、her3(参见例如第9,505,843号美国专利中所描述的那些)、psma(参见例如parker等人,《蛋白质表达和纯化》89(2):136-145,2013中所描述的那些)、cea(参见例如wo 1995/015341中所描述的那些)、b7h3(参见例如第9,371,395号美国专利中所描述的那些)、epcam(参见例如wo 2014/159531中描述的那些)、bcma(参见例如smith等人,《分子疗法(mol.ther.)》26(6):1447-1456,2018中所描述的那些)、p-钙粘素(参见例如第7,452,537号美国专利中所描述的那些)、ceacam5(参见例如第9,617,345号美国专利中所描述的那些)、ul16结合蛋白(参见例如wo 2017/083612中所描述的那些)、hla-dr(参见例如pistillo等人,《实验和临床免疫遗传学(exp.clin.immunogenet.)》14(2):123-130,1997中所描述的那些)、dll4(参见例如wo 2014/007513中所描述的那些)、tyro3(参见例如wo 2016/166348中所描述的那些)、axl(参见例如wo 2012/175692中所描述的那些)、mer(参见例如wo 2016/106221中所描述的那些)、cd122(参见例如美国专利申请公开第2016/0367664号中所描述的那些)、cd155(参见例如wo 2017/149538中所描述的那些)或pdgf-dd(参见例如美国专利第9,441,034号中所描述的那些)。
[0181]
存在于本文描述的单链或多链嵌合多肽中的任一种中的抗原结合结构域各自独立地选自由以下组成的组：vhh结构域、vnar结构域和scfv。在一些实施例中，本文描述的抗原结合结构域中的任一种是bite、(scfv)2、纳米抗体(nanobody)、纳米抗体-has、dart、
tandab、单链双功能抗体(scdiabody)、单链双功能抗体-ch3、scfv-ch-cl-scfv、hsabody、单链双功能抗体-has或串联scfv。可用于单链或多链嵌合多肽中的任一种中的抗原结合结构域的另外实例是本领域已知的。
[0182]
vhh结构域是可在骆驼科动物中发现的单个单体可变抗体结构域。vnar结构域是可在软骨鱼中发现的单个单体抗体可变结构域。vhh结构域和v
nar
结构域的非限制性方面描述于例如cromie等人,《医药化学当前话题(curr.top.med.chem.)》15:2543-2557,2016；de genst等人,《发育与比较免疫学(dev.comp.immunol.)》30:187-198,2006；de meyer等人,《生物技术趋势(trends biotechnol.)》32:263-270,2014；kijanka等人,《纳米医学(nanomedicine)》10:161-174,2015；kovaleva等人,《生物疗法专家观点(expert.opin.biol.ther.)》14:1527-1539,2014；krah等人,《免疫药理学和免疫毒理学(immunopharmacol.immunotoxicol.)》38:21-28,2016；mujic-delic等人,《药理科学趋势(trends pharmacol.sci.)》35:247-255,2014；muyldermans,《生物技术杂志(j.biotechnol.)》74:277-302,2001；muyldermans等人,《生物化学科学趋势(trends biochem.sci.)》26:230-235,2001；muyldermans,《生物化学年鉴(ann.rev.biochem.)》82:775-797,2013；rahbarizadeh等人,《免疫学研究(immunol.invest.)》40:299-338,2011；van audenhove等人,《e生物医学(ebiomedicine)》8:40-48,2016；van bockstaele等人,《研究药物当前观点(curr.opin.investig.drugs)》10:1212-1224,2009；vincke等人,《分子生物学方法(methods mol.biol.)》911:15-26,2012；和wesolowski等人,《医学微生物学和免疫学(med.microbiol.immunol.)》198:157-174,2009。
[0183]
在一些实施例中，本文所述的单链或多链嵌合多肽中的每个抗原结合结构域都是vhh结构域，或至少一个抗原结合结构域是vhh结构域。在一些实施例中，本文所述的单链或多链嵌合多肽中的每个抗原结合结构域都是vnar结构域，或至少一个抗原结合结构域是vnar结构域。在一些实施例中，本文所述的单链或多链嵌合多肽中的每个抗原结合结构域都是scfv结构域，或至少一个抗原结合结构域是scfv结构域。
[0184]
在一些实施例中，存在于单链或多链嵌合多肽中的多肽中的两种或更多种可组装(例如非共价组装)以形成本文描述的抗原结合结构域中的任一种，例如抗体的抗原结合片段(例如本文描述的抗体的抗原结合片段中的任一种)、vhh-scab、vhh-fab、双scfab、f(ab')2、双功能抗体、互换单抗、daf(二合一)、daf(四合一)、dutamab、dt-igg、臼包杵型共同轻链、臼包杵型组装体、电荷对、fab臂交换、seedbody、luz-y、fcab、κλ体、正交fab、dvd-igg、igg(h)-scfv、scfv-(h)igg、igg(l)-scfv、scfv-(l)igg、igg(l,h)-fv、igg(h)-v、v(h)-igg、igg(l)-v、v(l)-igg、kih igg-scfab、2scfv-igg、igg-2scfv、scfv4-ig、zybody、dvi-igg、双功能抗体-ch3、三体、微型抗体(miniantibody)、微抗体(minibody)、tribi微抗体、scfv-ch3 kih、fab-scfv、f(ab')
2-scfv2、scfv-kih、fab-scfv-fc、四价hcab、单链双功能抗体-fc、双功能抗体-fc、串联scfv-fc、胞内抗体、对接和锁定(dock and lock)、lmmtac、igg-igg偶联物、cov-x体和scfv1-peg-scfv2。参见例如spiess等人,《分子免疫学(mol.immunol.)》67:95-106,2015，其在此全文并入，以便描述这些元件。抗体的抗原结合片段的非限制性实例包括fv片段、fab片段、f(ab')2片段和fab'片段。抗体的抗原结合片段的另外实例是igg的抗原结合片段(例如，igg1、igg2、igg3或igg4的抗原结合片段)(例如，人或人源化igg，例如人或人源化igg1、igg2、igg3或igg4的抗原结合片段)；iga的抗原结合
片段(例如，iga1或iga2的抗原结合片段)(例如，人或人源化iga，例如人或人源化iga1或iga2的抗原结合片段)；igd的抗原结合片段(例如，人或人源化igd的抗原结合片段)；ige的抗原结合片段(例如，人或人源化ige的抗原结合片段)；或igm的抗原结合片段(例如，人或人源化igm的抗原结合片段)。
[0185]“fv”片段包括一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的非共价连接的二聚体。
[0186]“fab”片段包括除fv片段的重链和轻链可变结构域外，轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(c
h1
)。
[0187]“f(ab')
2”片段包括在铰链区附近通过二硫键接合的两个fab片段。
[0188]“双可变结构域免疫球蛋白”或“dvd-ig”是指多价且多特异性结合蛋白，如例如digiammarino等人,《分子生物学方法》899:145-156,2012；jakob等人,《单抗(mabs)》5:358-363,2013；和美国专利第7,612,181号；第8,258,268号；第8,586,714号；第8,716,450号；第8,722,855号；第8,735,546号；和第8,822,645号中所描述，其中的每一个均通过引用整体并入。
[0189]
dart描述于例如garber,《自然综述：药物发现(nature reviews drug discovery)》13:799-801,2014中。
[0190]
在一些实施例中，本文所述的任一种抗原结合结构域能够结合到选自由以下组成的组的抗原：蛋白质、碳水化合物、脂质和其组合。
[0191]
抗原结合结构域的其它实例和方面是本领域已知的。
[0192]
可溶性白介素或细胞因子蛋白
[0193]
在本文描述的单链或多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个可以是可溶性白介素蛋白或可溶性细胞因子蛋白。在一些实施例中，可溶性白介素或可溶性细胞因子蛋白选自以下的组：il-2、il-3、il-7、il-8、il-10、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21、pdgf-dd、scf和flt3l。可溶性il-2、il-3、il-7、il-8、il-10、il-15、il-17、il-18、il-21、pdgf-dd、scf和flt3l的非限制性实例在下文提供。
[0194]
人可溶性il-2(seq id no:104)
[0195][0196]
人可溶性il-3(seq id no:105)
[0197][0198]
人可溶性il-7(seq id no:106)
[0199][0200]
人可溶性il-8(seq id no:107)
[0201][0202]
人可溶性il-10(seq id no:108)
[0203][0204]
人可溶性il-15(seq id no:109)
[0205][0206]
人可溶性il-17(seq id no:110)
[0207][0208]
人可溶性il-18(seq id no:111)
[0209][0210]
人可溶性pdgf-dd(seq id no:112)
[0211][0212]
人可溶性scf(seq id no:113)
[0213][0214]
人可溶性flt3l(seq id no:114)
[0215][0216]
以下提供可溶性mica、micb、ulbp1、ulbp2、ulbp3、ulbp4、ulbp5和ulbp6的非限制性实例。
[0217]
人可溶性mica(seq id no:115)
[0218][0219]
人可溶性micb(seq id no:116)
[0220][0221]
人可溶性ulbp1(seq id no:117)
[0222][0223]
人可溶性ulbp2(seq id no:118)
[0224][0225]
人可溶性ulbp3(seq id no:119)
[0226][0227]
人可溶性ulbp4(seq id no:120)
[0228][0229]
人可溶性ulbp5(seq id no:121)
[0230][0231]
人可溶性ulbp6(seq id no:122)
[0232][0233]
可溶性白介素蛋白和可溶性细胞因子蛋白的另外实例是本领域已知的。
[0234]
可溶性受体
[0235]
在本文描述的单链或多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个是可溶性白介素受体或可溶性细胞因子受体。在一些实施例中，可溶性受体是可溶性tgf-β受体ii(tgf-βrii)(参见例如yung等人,《美国呼吸与重症医学杂志(am.j.resp.crit.care med.)》194(9):1140-1151,2016中所描述的那些)、可溶性tgf-βriii(参见例如heng等人,《胎盘(placenta)》57:320,2017中所描述的那些)、可溶性nkg2d(参见例如cosman等人,《免疫(immunity)》14(2):123-133,2001；costa等人,《免疫学前沿(front.immunol.)》,第9卷,第1150条,2018年5月29日；doi：10.3389/fimmu.2018.01150)、可溶性nkp30(参见例如costa等人,《免疫学前沿》,第9卷,第1150章,2018年5月29日；数字对象标识符：10.3389/fimmu.2018.01150)、可溶性nkp44(参见例如costa等人,《免疫学前沿immunol.)》第9卷，论文1150，2018年5月29日；doi:10.3389/fimmu.2018.01150中所述的那些)、可溶性nkp46(参见例如mandelboim等人，《自然(nature)》409:1055-1060，2001；costa等人，《免疫学前沿(front.immunol.)》第9卷，论文1150，2018年5月29日；doi:10.3389/fimmu.2018.01150)、可溶性dnam1(参见例如costa等人，《免疫学前沿(front.immunol.)》，第9卷，论文1150，2018年5月29日；doi:10.3389/fimmu.2018.01150中所述的那些)、scmhci(参见例如washburn等人，《公共科学图书馆
·
综合(plos one)》6(3):e18439，2011中所述的那些)、scmhcii(参见例如bishwajit等人，《细胞免疫学(cellular immunol.)》170(1):25-33,1996中所描述的那些)、sctcr(参见例如weber等人，《自然》356(6372):793-796,1992中所描述的那些)、可溶性cd155(参见例如tahara-hanaoka等人,《国际免疫学(int.immunol.)》16(4):533-538,2004中所描述的那些)或可溶性cd28(参见例如hebbar等人,《临床与实验免疫学(clin.exp.immunol.)》136:388-392,2004)。可溶性白介素受体和可溶性细胞因子受体的另外实例是本领域已知的。
[0236]
a型单链嵌合多肽的示例性实施例
[0237]
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和/或第二靶标结合结构域可以独立地特异性结合到cd3(例如，人cd3)或cd28(例如，人cd28)。在一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到cd3(例如，人cd3)，而第二靶标结合结构域特异性结合到cd28(例如，人cd28)。在一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到cd28(例如，人cd28)，而第二靶标结合结构域特异性结合到cd3(例如，人cd3)。
[0238]
b型单链嵌合多肽的示例性实施例
[0239]
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和/或第二靶标结合结构域可以独立地特异性结合到il-2受体(例如，人il-2受体)。
[0240]
c型单链嵌合多肽的示例性实施例
[0241]
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和/或第二靶标结合结构域可以独立地特异性结合到il-15受体(例如，人il-15受体)。
[0242]
示例性单链嵌合多肽的序列
[0243]
编码αcd3scfv/tf/αcd28scfv单链多肽的核酸如下(seq id no:22)：
[0244]
(信号肽)
[0245]
atgaagtgggtgaccttcatcagcttattatttttattcagctccgcctattcc
[0246]
(αcd3轻链可变区)
[0247]
cagatcgtgctgacccaaagccccgccatcatgagcgctagccccggtgagaaggtgaccatgacatgctccgcttccagctccgtgtcctacatgaactggtatcagcagaaaagcggaaccagccccaaaaggtggatctacgacaccagcaagctggcctccggagtgcccgctcatttccggggctctggatccggcaccagctactctttaaccatttccggcatggaagctgaagacgctgccacctactattgccagcaatggagcagcaaccccttcacattcggatctggcaccaagctcgaaatcaatcgt
[0248]
(接头)
[0249]
ggaggaggtggcagcggcggcggtggatccggcggaggaggaagc
[0250]
(αcd3重链可变区)
[0251]
caagttcaactccagcagagcggcgctgaactggcccggcccggcgcctccgtcaagatgagctgcaaggcttccggctatacatttactcgttacacaatgcattgggtcaagcagaggcccggtcaaggtttagagtggatcggatatatcaacccttcccggggctacaccaactataaccaaaagttcaaggataaagccactttaaccactgacaagagctcctccaccgcctacatgcagctgtcctctttaaccagcgaggactccgctgtttactactgcgctaggtattacgacgaccactactgtttagactattggggacaaggtaccactttaaccgtcagcagc
[0252]
(人组织因子219形式)
[0253]
tccggcaccaccaataccgtggccgcttataacctcacatggaagagcaccaacttcaagacaattctggaatgggaacccaagcccgtcaatcaagtttacaccgtgcagatctccaccaaatccggagactggaagagcaagtgcttctacacaacagacaccgagtgtgatttaaccgacgaaatcgtcaaggacgtcaagcaaacctatctggctcgggtcttttcctaccccgctggcaatgtcgagtccaccggctccgctggcgagcctctctacgagaattcccccgaattcaccccttatttagagaccaatttaggccagcctaccatccagagcttcgagcaagttggcaccaaggtgaacgtcaccgtcgaggatgaaaggactttagtgcggcggaataacacatttttatccctccgggatgtgttcggcaaagacctcatctacacactgtactattggaagtccagctcctccggcaaaaagaccgctaagaccaacaccaacgagtttttaattgacgtggacaaaggcgagaactactgcttcagcgtgcaagccgtgatcccttctcgtaccgtcaaccggaagagcacagattcccccgttgagtgcatgggccaagaaaagggcgagttccgggag
[0254]
(αcd28轻链可变区)
[0255]
gtccagctgcagcagagcggacccgaactcgtgaaacccggtgcttccgtgaaaatgtcttgtaaggccagcggatacaccttcacctcctatgtgatccagtgggtcaaacagaagcccggacaaggtctcgagtggatcggcagcatcaacccttacaacgactataccaaatacaacgagaagtttaagggaaaggctactttaacctccgacaaaagctccatcacagcctacatggagttcagctctttaacatccgaggacagcgctctgtactattgcgcccggtggggcgacggcaattactggggacggggcacaacactgaccgtgagcagc
[0256]
(接头)
[0257]
ggaggcggaggctccggcggaggcggatctggcggtggcggctcc
[0258]
(αcd28轻链可变区)
[0259]
gacatcgagatgacccagtcccccgctatcatgtccgcctctttaggcgagcgggtcacaatgacttgtacagcctcctccagcgtctcctcctcctacttccattggtaccaacagaaacccggaagctcccctaaactgtgcat
ctacagcaccagcaatctcgccagcggcgtgccccctaggttttccggaagcggaagcaccagctactctttaaccatctcctccatggaggctgaggatgccgccacctacttttgtcaccagtaccaccggtcccccaccttcggaggcggcaccaaactggagacaaagagg
[0260]
αcd3scfv/tf/αcd28scfv单链嵌合多肽的氨基酸序列如下(seq id no:23)：
[0261]
(信号肽)
[0262]
mkwvtfisllflfssays
[0263]
(αcd3轻链可变区)
[0264]
qivltqspaimsaspgekvtmtcsasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtsklasgvpahfrgsgsgtsysltisgmeaedaatyycqqwssnpftfgsgtkleinr
[0265]
(接头)
[0266]
ggggsggggsggggs
[0267]
(αcd3重链可变区)
[0268]
qvqlqqsgaelarpgasvkmsckasgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvss
[0269]
(人组织因子219)
[0270]
sgttntvaaynltwkstnfktilewepkpvnqvytvqistksgdwkskcfyttdtecdltdeivkdvkqtylarvfsypagnvestgsageplyenspeftpyletnlgqptiqsfeqvgtkvnvtvedertlvrrnntflslrdvfgkdliytlyywkssssgkktaktntneflidvdkgenycfsvqavipsrtvnrkstdspvecmgqekgefre
[0271]
(αcd28轻链可变区)
[0272]
vqlqqsgpelvkpgasvkmsckasgytftsyviqwvkqkpgqglewigsinpyndytkynekfkgkatltsdkssitaymefssltsedsalyycarwgdgnywgrgttltvss
[0273]
(接头)
[0274]
ggggsggggsggggs
[0275]
(αcd28重链可变区)
[0276]
diemtqspaimsaslgervtmtctasssvsssyfhwyqqkpgsspklciystsnlasgvpprfsgsgstsysltissmeaedaatyfchqyhrsptfgggtkletkr
[0277]
编码αcd28scfv/tf/αcd3scfv单链多肽的核酸序列如下(seq id no:24)：
[0278]
(信号肽)
[0279]
atgaaatgggtcaccttcatctctttactgtttttatttagcagcgcctacagc
[0280]
(αcd28轻链可变区)
[0281]
gtgcagctgcagcagtccggacccgaactggtcaagcccggtgcctccgtgaaaatgtcttgtaaggcttctggctacacctttacctcctacgtcatccaatgggtgaagcagaagcccggtcaaggtctcgagtggatcggcagcatcaatccctacaacgattacaccaagtataacgaaaagtttaagggcaaggccactctgacaagcgacaagagctccattaccgcctacatggagttttcctctttaacttctgaggactccgctttatactattgcgctcgttggggcgatggcaattattggggccggggaactactttaacagtgagctcc
[0282]
(接头)
[0283]
ggcggcggcggaagcggaggtggaggatctggcggtggaggcagc
[0284]
(αcd28重链可变区)
[0285]
gacatcgagatgacacagtcccccgctatcatgagcgcctctttaggagaacgtgtgaccatgacttgt
acagcttcctccagcgtgagcagctcctatttccactggtaccagcagaaacccggctcctcccctaaactgtgtatctactccacaagcaatttagctagcggcgtgcctcctcgttttagcggctccggcagcacctcttactctttaaccattagctctatggaggccgaagatgccgccacatacttttgccatcagtaccaccggtcccctacctttggcggaggcacaaagctggagaccaagcgg
[0286]
(人组织因子219形式)
[0287]
agcggcaccaccaacacagtggccgcctacaatctgacttggaaatccaccaacttcaagaccatcctcgagtgggagcccaagcccgttaatcaagtttataccgtgcagatttccaccaagagcggcgactggaaatccaagtgcttctataccacagacaccgagtgcgatctcaccgacgagatcgtcaaagacgtgaagcagacatatttagctagggtgttctcctaccccgctggaaacgtggagagcaccggatccgctggagagcctttatacgagaactcccccgaattcaccccctatctggaaaccaatttaggccagcccaccatccagagcttcgaacaagttggcacaaaggtgaacgtcaccgtcgaagatgagaggactttagtgcggaggaacaatacatttttatccttacgtgacgtcttcggcaaggatttaatctacacactgtattactggaagtctagctcctccggcaagaagaccgccaagaccaataccaacgaatttttaattgacgtggacaagggcgagaactactgcttctccgtgcaagctgtgatcccctcccggacagtgaaccggaagtccaccgactcccccgtggagtgcatgggccaagagaagggagagtttcgtgag
[0288]
(αcd3轻链可变区)
[0289]
cagatcgtgctgacccagtcccccgctattatgagcgctagccccggtgaaaaggtgactatgacatgcagcgccagctcttccgtgagctacatgaactggtatcagcagaagtccggcaccagccctaaaaggtggatctacgacaccagcaagctggccagcggcgtccccgctcactttcggggctccggctccggaacaagctactctctgaccatcagcggcatggaagccgaggatgccgctacctattactgtcagcagtggagctccaaccccttcacctttggatccggcaccaagctcgagattaatcgt
[0290]
(接头)
[0291]
ggaggcggaggtagcggaggaggcggatccggcggtggaggtagc
[0292]
(αcd3重链可变区)
[0293]
caagttcagctccagcaaagcggcgccgaactcgctcggcccggcgcttccgtgaagatgtcttgtaaggcctccggctataccttcacccggtacacaatgcactgggtcaagcaacggcccggtcaaggtttagagtggattggctatatcaacccctcccggggctataccaactacaaccagaagttcaaggacaaagccaccctcaccaccgacaagtccagcagcaccgcttacatgcagctgagctctttaacatccgaggattccgccgtgtactactgcgctcggtactacgacgatcattactgcctcgattactggggccaaggtaccaccttaacagtctcctcc
[0294]
αcd28scfv/tf/αcd3scfv单链嵌合多肽的氨基酸序列如下(seq id no:25)：
[0295]
(信号肽)
[0296]
mkwvtfisllflfssays
[0297]
(αcd28轻链可变区)
[0298]
vqlqqsgpelvkpgasvkmsckasgytftsyviqwvkqkpgqglewigsinpyndytkynekfkgkatltsdkssitaymefssltsedsalyycarwgdgnywgrgttltvss
[0299]
(接头)
[0300]
ggggsggggsggggs
[0301]
(αcd28重链可变区)
[0302]
diemtqspaimsaslgervtmtctasssvsssyfhwyqqkpgsspklciystsnlasgvpprfsgsgstsysltissmeaedaatyfchqyhrsptfgggtkletkr
[0303]
(人组织因子219)
[0304]
sgttntvaaynltwkstnfktilewepkpvnqvytvqistksgdwkskcfyttdtecdltdeivkdvkqtylarvfsypagnvestgsageplyenspeftpyletnlgqptiqsfeqvgtkvnvtvedertlvrrnntflslrdvfgkdliytlyywkssssgkktaktntneflidvdkgenycfsvqavipsrtvnrkstdspvecmgqekgefre
[0305]
(αcd3轻链可变区)
[0306]
qivltqspaimsaspgekvtmtcsasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtsklasgvpahfrgsgsgtsysltisgmeaedaatyycqqwssnpftfgsgtkleinr
[0307]
(接头)
[0308]
ggggsggggsggggs
[0309]
(αcd3重链可变区)
[0310]
qvqlqqsgaelarpgasvkmsckasgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvss
[0311]
编码il-2/tf/il-2单链嵌合多肽的核酸序列如下(seq id no:26)：
[0312]
(信号肽)
[0313]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[0314]
(第一il-2片段)
[0315]
gcccccacctcctcctccaccaagaagacccagctgcagctggagcatttactgctggatttacagatgattttaaacggcatcaacaactacaagaaccccaagctgactcgtatgctgaccttcaagttctacatgcccaagaaggccaccgagctgaagcatttacagtgtttagaggaggagctgaagcccctcgaggaggtgctgaatttagcccagtccaagaatttccatttaaggccccgggatttaatcagcaacatcaacgtgatcgttttagagctgaagggctccgagaccaccttcatgtgcgagtacgccgacgagaccgccaccatcgtggagtttttaaatcgttggatcaccttctgccagtccatcatctccactttaacc
[0316]
(人组织因子219形式)
[0317]
agcggcacaaccaacacagtcgctgcctataacctcacttggaagagcaccaacttcaaaaccatcctcgaatgggaacccaaacccgttaaccaagtttacaccgtgcagatcagcaccaagtccggcgactggaagtccaaatgtttctataccaccgacaccgagtgcgatctcaccgatgagatcgtgaaagatgtgaaacagacctacctcgcccgggtgtttagctaccccgccggcaatgtggagagcactggttccgctggcgagcctttatacgagaacagccccgaatttaccccttacctcgagaccaatttaggacagcccaccatccaaagctttgagcaagttggcacaaaggtgaatgtgacagtggaggacgagcggactttagtgcggcggaacaacacctttctcagcctccgggatgtgttcggcaaagatttaatctacacactgtattactggaagtcctcttcctccggcaagaagacagctaaaaccaacacaaacgagtttttaatcgacgtggataaaggcgaaaactactgtttcagcgtgcaagctgtgatcccctcccggaccgtgaataggaaaagcaccgatagccccgttgagtgcatgggccaagaaaagggcgagttccgggag
[0318]
(第二il-2片段)
[0319]
gcacctacttcaagttctacaaagaaaacacagctacaactggagcatttactgctggatttacagatgattttgaatggaattaataattacaagaatcccaaactcaccaggatgctcacatttaagttttacatgcccaagaaggccacagaactgaaacatcttcagtgtctagaagaagaactcaaacctctggaggaagtgctaaatttagctcaaagcaaaaactttcacttaagacccagggacttaatcagcaatatcaacgtaatagttctggaactaaagggatctgaaacaacattcatgtgtgaatatgctgatgagacagcaaccattgtagaatttctgaacagatggattaccttttgtcaaagcatcatctcaacactaact
[0320]
il-2/tf/il-2单链嵌合多肽的氨基酸序列如下(seq id no:27)：
[0321]
(信号肽)
[0322]
mkwvtfisllflfssays
[0323]
(人il-2)
[0324]
aptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiistlt
[0325]
(人组织因子219)
[0326]
sgttntvaaynltwkstnfktilewepkpvnqvytvqistksgdwkskcfyttdtecdltdeivkdvkqtylarvfsypagnvestgsageplyenspeftpyletnlgqptiqsfeqvgtkvnvtvedertlvrrnntflslrdvfgkdliytlyywkssssgkktaktntneflidvdkgenycfsvqavipsrtvnrkstdspvecmgqekgefre
[0327]
(人il-2)
[0328]
aptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiistlt
[0329]
编码il-15/tf/il-15单链嵌合多肽的核酸序列如下(seq id no:28)：
[0330]
(信号肽)
[0331]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[0332]
(第一il-15片段)
[0333]
aactgggtgaacgtgatcagcgatttaaagaagatcgaggatttaatccagagcatgcacatcgacgccactctgtacactgagagcgacgtgcaccctagctgcaaggtgactgccatgaagtgctttttactggagctgcaagttatctctttagagagcggcgatgccagcatccacgacactgtggagaatttaatcattttagccaacaactctttaagcagcaacggcaacgtgacagagagcggctgcaaggagtgcgaggagctggaggagaagaacatcaaggagtttttacagagcttcgtgcacatcgtgcagatgttcatcaacactagc
[0334]
(人组织因子219形式)
[0335]
agcggcacaaccaacacagtcgctgcctataacctcacttggaagagcaccaacttcaaaaccatcctcgaatgggaacccaaacccgttaaccaagtttacaccgtgcagatcagcaccaagtccggcgactggaagtccaaatgtttctataccaccgacaccgagtgcgatctcaccgatgagatcgtgaaagatgtgaaacagacctacctcgcccgggtgtttagctaccccgccggcaatgtggagagcactggttccgctggcgagcctttatacgagaacagccccgaatttaccccttacctcgagaccaatttaggacagcccaccatccaaagctttgagcaagttggcacaaaggtgaatgtgacagtggaggacgagcggactttagtgcggcggaacaacacctttctcagcctccgggatgtgttcggcaaagatttaatctacacactgtattactggaagtcctcttcctccggcaagaagacagctaaaaccaacacaaacgagtttttaatcgacgtggataaaggcgaaaactactgtttcagcgtgcaagctgtgatcccctcccggaccgtgaataggaaaagcaccgatagccccgttgagtgcatgggccaagaaaagggcgagttccgggag
[0336]
(第二il-15片段)
[0337]
aactgggtgaacgtcatcagcgatttaaagaagatcgaagatttaattcagtccatgcatatcgacgccactttatacacagaatccgacgtgcacccctcttgtaaggtgaccgccatgaaatgttttttactggagctgcaagttatctctttagagagcggagacgctagcatccacgacaccgtggagaatttaatcattttagccaataactctttatccagcaacggcaacgtgacagagtccggctgcaaggagtgcgaagagctggaggagaagaacatcaaggagtttctgcaatcctttgtgcacattgtccagatgttcatcaatacctcc
[0338]
il-15/tf/il-15单链嵌合多肽的氨基酸序列如下(seq id no:29)：
[0339]
(信号肽)
[0340]
mkwvtfisllflfssays
[0341]
(人il-15)
[0342]
nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints
[0343]
(人组织因子219)
[0344]
sgttntvaaynltwkstnfktilewepkpvnqvytvqistksgdwkskcfyttdtecdltdeivkdvkqtylarvfsypagnvestgsageplyenspeftpyletnlgqptiqsfeqvgtkvnvtvedertlvrrnntflslrdvfgkdliytlyywkssssgkktaktntneflidvdkgenycfsvqavipsrtvnrkstdspvecmgqekgefre
[0345]
(人il-15)
[0346]
nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints
[0347]
多链嵌合多肽
[0348]
含有组织因子的蛋白质的非限制性实例为多链嵌合多肽，其包括：(a)第一嵌合多肽，其包括：(i)第一靶标结合结构域；(ii)可溶性组织因子结构域；和(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；和(b)第二嵌合多肽，其包括：(i)一对亲和结构域中的第二结构域；和(ii)第二靶标结合结构域，其中第一嵌合多肽与第二嵌合多肽通过一对亲和结构域中的第一结构域和第二结构域的结合而缔合。
[0349]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如，本文所描述的第一靶标结合结构域中的任一种)和可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包含在第一嵌合多肽中的第一靶标结合结构域(例如，本文所描述的示例性第一靶标结合结构域中的任一种)与可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。
[0350]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包含在第一嵌合多肽中的可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。
[0351]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，一对亲和结构域中的第二结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第二结构域中的任一种)与第二靶标结合结构域(例如，本文所描述的示例性第二靶标结合结构域中的任一种)在第二嵌合多肽中彼此直接邻接。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二嵌合多肽进一步包含介于第二嵌合多肽中的一对亲和结构域中的第二结构域(例如本文所述的任一种示例性亲和结构域对中的的任一种示例性第二结构域)与第二靶
标结合结构域(例如本文所述的任一种示例性第二靶标结合结构域)之间的接头序列(例如本文所述或所属领域已知的任一种示例性接头序列)。
[0352]
在多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包括一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)，其中一个或多个其它抗原结合结构域中的至少一个定位于可溶性组织因子结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性可溶性组织因子结构域)与亲和结构域对中的第一结构域(例如本文所述的任一种示例性亲和结构域对中的任一种示例性第一结构域)之间。在一些实施例中，第一嵌合多肽可进一步包括在可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)，和/或一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的本文所描述的示例性第一结构域中的任一种)之间的本文所接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。
[0353]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽在第一嵌合多肽的n端和/或c端进一步包括一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)另外的靶标结合结构域。在一些实施例中，在第一嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接亲和结构域对中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的本文所描述的示例性第一结构域中的任一种)。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包括在一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的本文所描述的示例性第一结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。在一些实施例中，在第一嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包含在一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。
[0354]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，在第一嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)安置于第一嵌合多肽的n和/或c端，并且一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)定位在可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述或本领域已知的任何示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的
示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间。在一些实施例中，在第一嵌合多肽中，安置于n端的一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)或一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包含第一嵌合多肽中安置于至少一个另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)或一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的接头序列中的任一种)。在一些实施例中，在第一嵌合多肽中，安置于c端的一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)或一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包括第一嵌合多肽中安置于至少一个另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)或一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的接头序列中的任一种)。在一些实施例中，位于可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的第一结构域中的任一种或本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种)之间的一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接可溶性组织因子结构域和/或一对亲和结构域中的第一结构域。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包含接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)，所述接头序列安置于(i)可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)之间，所述一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个位于可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间，和/或(ii)一对亲和结构域中的第一结构域与一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个之间，所述一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个位于可溶性组织因子结构域与一对亲和结构域中的第一结构域之间。
[0355]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二嵌合多肽在第二嵌合多肽的n端和/或c端进一步包括一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)。在一些实施例中，在第二嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合
结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接所述一对亲和结构域中的第二结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第二结构域中的任一种)。在一些实施例中，第二嵌合多肽进一步包括第二嵌合多肽中在一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第二结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第二结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。在一些实施例中，在第二嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接第二靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的靶标结合结构域中的任一种)。在一些实施例中，第二嵌合多肽进一步包括第二嵌合多肽中在一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与第二靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。
[0356]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个(例如，三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个)特异性结合到相同的抗原。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个(例如，三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个)特异性结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个(例如，三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个)包括相同的氨基酸序列。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域各自特异性结合到相同的抗原。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域各自特异性结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域各自包括相同的氨基酸序列。
[0357]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域特异性结合到不同的抗原。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个靶标结合结构域中的一个或多个(例如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个)是抗原结合结构域。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域各自是抗原结合结构域(例如，scfv或单结构域抗体)。
[0358]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域
(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)特异性地结合到选自由以下组成的组的靶标：cd16a、cd28、cd3、cd33、cd20、cd19、cd22、cd123、il-1r、il-1、vegf、il-6r、il-4、il-10、pdl-1、tigit、pd-1、tim3、ctla4、mica、micb、il-6、il-8、tnfα、cd26、cd36、ulbp2、cd30、cd200、igf-1r、muc4ac、muc5ac、trop-2、cmet、egfr、her1、her2、her3、psma、cea、b7h3、epcam、bcma、p-钙粘素、ceacam5、ul16结合蛋白、hla-dr、dll4、tyro3、axl、mer、cd122、cd155、pdgf-dd、tgf-β受体ii(tgf-βrii)的配体、tgf-βriii的配体、dnam1的配体、nkp46的配体、nkp44的配体、nkg2d的配体、nkp30的配体、scmhci的配体、scmhcii的配体、sctcr的配体、il-1的受体、il-2的受体、il-3的受体、il-7的受体、il-8的受体、il-10的受体、il-12的受体、il-15的受体、il-17的受体、il-18的受体、il-21的受体、pdgf-dd的受体、干细胞因子(scf)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(flt3l)的受体、mica的受体、micb的受体、ulp16结合蛋白的受体、cd155的受体、cd122的受体和cd28的受体。
[0359]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的一个或多个是可溶性白介素或细胞因子蛋白。可溶性白介素蛋白和可溶性细胞因子蛋白的非限制性实例包括：il-1、il-2、il-3、il-7、il-8、il-10、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21、pdgf-dd和scf。
[0360]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的一个或多个是可溶性白介素或细胞因子受体。可溶性白介素受体和可溶性细胞因子受体的非限制性实例包括：可溶性tgf-β受体ii(tgf-βrii)、可溶性tgf-βriii、可溶性nkg2d、可溶性nkp30、可溶性nkp44、可溶性nkp46、可溶性dnam1、scmhci、scmhcii、sctcr、可溶性cd155、可溶性cd122、可溶性cd3或可溶性cd28。
[0361]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述的任一种靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述的任一种靶标结合结构域)和一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述的任一种靶标结合结构域)可各自独立地特异性结合到选自以下组的靶标：cd16a、cd33、cd20、cd19、cd22、cd123、pdl-1、tigit、pd-1、tim3、ctla4、mica、micb、il-6、il-8、tnfα、cd26、cd36、ulbp2、cd30、cd200、igf-1r、muc4ac、muc5ac、trop-2、cmet、egfr、her1、her2、her3、psma、cea、b7h3、epcam、bcma、p-钙粘素、ceacam5、ul16结合蛋白、hla-dr、dll4、tyro3、axl、mer、cd122、cd155、pdgf-dd、tgf-β受体ii(tgf-βrii)的配体、tgf-βriii的配体、dnam-1的配体、nkp46的配体、nkp44的配体、nkg2d的配体、nkp30的配体、scmhci的配体、scmhcii的配体、sctcr的配体、pdgf-dd的受体、干细胞因子(scf)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(flt3l)的受体、mica的受体、micb的受体、ulp16结合蛋白的受体、cd155的受体和cd122的
受体。
[0362]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述的任一种靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述的任一种靶标结合结构域)和一个或多个其它结合结构域(例如本文所述的任一种靶标结合结构域)中的一个或两个是可溶性白介素或细胞因子蛋白。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性白介素或细胞因子蛋白选自以下的组：il-1、il-2、il-3、il-7、il-8、il-10、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21、pdgf-dd和scf。
[0363]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个是可溶性白介素受体或细胞因子受体。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性受体是可溶性tgf-β受体ii(tgf-βrii)、可溶性tgf-βriii、tnfα的可溶性受体、il-4的可溶性受体，或il-10的可溶性受体。
[0364]
细胞活化剂的非限制性实例是多链嵌合多肽，其包括：(a)第一和第二嵌合多肽，其各自包括：(i)第一靶标结合结构域；(ii)fc结构域；和(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；以及(b)第三和第四嵌合多肽，其各自包括：(i)一对亲和结构域中的第二结构域；和(ii)第二靶标结合结构域，其中第一和第二嵌合多肽与第三和第四嵌合多肽通过一对亲和结构域中的第一结构域与第二结构域的结合而缔合，并且第一和第二嵌合多肽通过其fc结构域而缔合。
[0365]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一和第二嵌合多肽中的第一靶标结合结构域(例如本文所述的任一种第一靶标结合结构域)与fc结构域(例如本文所述的任一种示例性fc结构域)彼此直接邻接。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一和第二嵌合多肽另外包含介于第一和第二嵌合多肽中的第一靶标结合结构域(例如本文所述的示例性第一靶标结合结构域中的任一种)与fc结构域(例如本文描述的示例性fc结构域中的任一种)之间的接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的示例性接头序列中的任一种)。
[0366]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一和第二嵌合多肽中的fc结构域(例如本文所述的任一种示例性fc结构域)与亲和结构域对中的第一结构域(例如本文所述的任一种示例性亲和结构域对中的任一种示例性第一结构域)彼此直接邻接。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一和第二嵌合多肽进一步包含介于第一和第二嵌合多肽中的fc结构域(例如本文所述的任一种示例性fc结构域)与亲和结构域对中的第一结构域(例如本文所述的任一种示例性亲和结构域对中的任一种示例性第一结构域)之间的接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。
[0367]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第三和第四嵌合多肽中的亲和结构域对中的第二结构域(例如本文所述的任一种示例性亲和结构域对中的任一种示例性第二结构域)与第二靶标结合结构域(例如本文所述的任一种示例性第二靶标结合结构域)彼此直接邻接。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第三和第四嵌合多肽进一步包含介于第三和第四嵌合多肽中的亲和结构域对中的第二结构域(例如本文所述的任一种示例性亲和结构域对中的任一种示例性第二结构域)与第二靶标结合结构域(例如本文所述的任一种示例性第二靶标结合结构域)之间的接头序列(例如本文所述
或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。
[0368]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的抗原。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的表位。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域包括相同的氨基酸序列。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到不同的抗原。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个是抗原结合结构域(例如本文所述的任一种示例性第二靶标结合结构域)。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自是抗原结合结构域(例如本文所述的任一种示例性第二靶标结合结构域)。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，抗原结合结构域(例如本文所述的任一种示例性第二靶标结合结构域)包括scfv或单结构域抗体。
[0369]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的一个或两个特异性地结合到选自由以下组成的组的靶标：cd16a、cd28、cd3、cd33、cd20、cd19、cd22、cd123、il-1r、il-1、vegf、il-6r、il-4、il-10、pdl-1、tigit、pd-1、tim3、ctla4、mica、micb、il-6、il-8、tnfα、cd26、cd36、ulbp2、cd30、cd200、igf-1r、muc4ac、muc5ac、trop-2、cmet、egfr、her1、her2、her3、psma、cea、b7h3、epcam、bcma、p-钙粘素、ceacam5、ul16结合蛋白、hla-dr、dll4、tyro3、axl、mer、cd122、cd155、pdgf-dd、tgf-β受体ii(tgf-βrii)的配体、tgf-βriii的配体、dnam1的配体、nkp46的配体、nkp44的配体、nkg2d的配体、nkp30的配体、scmhci的配体、scmhcii的配体、sctcr的配体、il-1的受体、il-2的受体、il-3的受体、il-7的受体、il-8的受体、il-10的受体、il-12的受体、il-15的受体、il-17的受体、il-18的受体、il-21的受体、pdgf-dd的受体、干细胞因子(scf)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(flt3l)的受体、mica的受体、micb的受体、ulp16结合蛋白的受体、cd155的受体、cd122的受体和cd28的受体。
[0370]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)与第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的一个或两个为可溶性白介素或细胞因子蛋白。可溶性白介素蛋白和可溶性细胞因子蛋白的非限制性实例包括：il-1、il-2、il-3、il-7、il-8、il-10、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21、pdgf-dd和scf。
[0371]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)是可溶性白介素或细胞因子受体。可溶性白介素受体和可溶性细胞因子受体的非限制性实例包括：可溶性tgf-β受体ii(tgf-βrii)、可溶性tgf-βriii、可溶性nkg2d、可溶性nkp30、可溶性nkp44、可溶性nkp46、可溶性dnam1、scmhci、scmhcii、sctcr、可溶性cd155、可溶性cd122、可溶性cd3或可溶性cd28。
[0372]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域可以各自独立地特异性结合到选自以下的组的靶标：cd16a、cd33、cd20、cd19、cd22、cd123、pdl-1、tigit、pd-1、tim3、ctla4、mica、micb、il-6、il-8、tnfα、cd26、cd36、ulbp2、cd30、cd200、igf-1r、muc4ac、muc5ac、trop-2、cmet、egfr、her1、her2、her3、psma、cea、b7h3、epcam、bcma、p-钙粘素、ceacam5、ul16结合蛋白、hla-dr、dll4、tyro3、axl、mer、cd122、cd155、pdgf-dd、tgf-β受体ii(tgf-βrii)的配体、tgf-βriii的配体、dnam1的配体、nkp46的配体、nkp44的配体、nkg2d的配体、nkp30的配体、scmhci的配体、scmhcii的配体、sctcr的配体、pdgf-dd的受体、干细胞因子(scf)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(flt3l)的受体、mica的受体、micb的受体、ulp16结合蛋白的受体、cd155的受体，和cd122的受体。
[0373]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个是可溶性白介素或细胞因子蛋白。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性白介素或细胞因子蛋白选自以下的组：il-1、il-2、il-3、il-7、il-8、il-10、il-12、il-15、il-17、il-18、il-21、pdgf-dd和scf。
[0374]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个是可溶性白介素受体或细胞因子受体。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性受体是可溶性tgf-β受体ii(tgf-βrii)、可溶性tgf-βriii、tnfα的可溶性受体、il-4的可溶性受体，或il-10的可溶性受体。
[0375]
在一些实施例中，多链嵌合多肽具有与seq id no:30-101至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的核酸序列或氨基酸。
[0376]
另外的抗原结合结构域
[0377]
在单或多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽另外包括一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)另外的靶标结合结构域(例如，本文描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)。在多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，一个或多个另外的抗原结合结构域中的至少一个可位于可溶性组织因子结构域(例如，本文描述或本领域已知的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间。在一些实施例中，第一嵌合多肽可进一步包括在可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)，和/或一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的本文所描述的示例性第一结构域中的任一种)之间的本文所接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。
[0378]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽在第一嵌
合多肽的n端和/或c端进一步包括一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)另外的靶标结合结构域。在一些实施例中，在第一嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接亲和结构域对中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的本文所描述的示例性第一结构域中的任一种)。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包括在一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的本文所描述的示例性第一结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。在一些实施例中，在第一嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包含在一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。
[0379]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，在第一嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)安置于第一嵌合多肽的n和/或c端，并且一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)定位在可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述或本领域已知的任何示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间。在一些实施例中，在第一嵌合多肽中，安置于n端的一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)或一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包含第一嵌合多肽中安置于至少一个另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)或一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的接头序列中的任一种)。在一些实施例中，在第一嵌合多肽中，安置于c端的一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)或一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包括第一嵌合多肽中安置于至少一个另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结
合结构域中的任一种)与第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)或一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的接头序列中的任一种)。在一些实施例中，位于可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的第一结构域中的任一种或本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种)之间的一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接可溶性组织因子结构域和/或一对亲和结构域中的第一结构域。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包含接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)，所述接头序列安置于(i)可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)之间，所述一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个位于可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间，和/或(ii)一对亲和结构域中的第一结构域与一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个之间，所述一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个位于可溶性组织因子结构域与一对亲和结构域中的第一结构域之间。
[0380]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二嵌合多肽在第二嵌合多肽的n端和/或c端进一步包括一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)。在一些实施例中，在第二嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接所述一对亲和结构域中的第二结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第二结构域中的任一种)。在一些实施例中，第二嵌合多肽进一步包括第二嵌合多肽中在一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第二结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第二结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。在一些实施例中，在第二嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接第二靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的靶标结合结构域中的任一种)。在一些实施例中，第二嵌合多肽进一步包括第二嵌合多肽中在一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与第二靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。
[0381]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个(例如，三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九
个或更多个或十个或更多个)特异性结合到相同的抗原。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个(例如，三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个)特异性结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个(例如，三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个)包括相同的氨基酸序列。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域各自特异性结合到相同的抗原。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域各自特异性结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域各自包括相同的氨基酸序列。
[0382]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域特异性结合到不同的抗原。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个靶标结合结构域中的一个或多个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个)是抗原结合结构域。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域各自是抗原结合结构域(例如，scfv或单结构域抗体)。
[0383]
亲和结构域对
[0384]
在一些实施例中，多链嵌合多肽包括：1)包括一对亲和结构域中的第一结构域的第一嵌合多肽，和2)包括一对亲和结构域中的第二结构域的第二嵌合多肽，使得第一嵌合多肽和第二嵌合多肽通过一对亲和结构域中的第一结构域和第二结构域的结合而缔合。在一些实施例中，一对亲和结构域是来自人il-15受体的α链(il15rα)的寿司结构域和可溶性il-15。寿司结构域，也称为短共有重复序列或1型糖蛋白基序，是蛋白质-蛋白质相互作用中的常见基序。已在许多蛋白质结合分子，包括补体组分c1r、c1s、因子h和c2m以及非免疫分子因子xiii和β2-糖蛋白上鉴别了寿司结构域。典型的寿司结构域具有大约60个氨基酸残基，并且含有四个半胱氨酸(ranganathan,《太平洋生物计算专题讨论会(pac.symp biocomput.)》2000:155-67)。第一半胱氨酸可与第三半胱氨酸形成二硫键，并且第二半胱氨酸可与第四半胱氨酸形成二硫桥键。在其中一对亲和结构域中的一个成员是可溶性il-15的一些实施例中，可溶性il15具有d8n或d8a氨基酸取代。在其中一对亲和结构域中的一个成员是人il-15受体的α链(il15rα)的一些实施例中，人il15rα是成熟全长il15rα。在一些实施例中，所述一对亲和结构域是芽胞杆菌核糖核酸酶和芽胞杆菌核糖核酸酶抑制子。在一些实施例中，所述一对亲和结构域是pka和akap。在一些实施例中，所述一对亲和结构域是基于突变核糖核酸酶i片段的衔接子/对接标签模块(rossi,《美国国家科学院院刊(proc natl acad sci usa.)》103:6841-6846,2006；sharkey等人,《癌症研究(cancer res.)》68:5282-5290,2008；rossi等人,《药物科学趋势(trends pharmacol sci.)》33:474-481,2012)或基于蛋白质突触蛋白、突触结合蛋白、突触泡蛋白和snap25相互作用的
snare模块(deyev等人,《自然
·
生物技术(nat biotechnol.)》1486-1492,2003)。
[0385]
在一些实施例中，多链嵌合多肽的第一嵌合多肽包括一对亲和结构域中的第一结构域，并且多链嵌合多肽的第二嵌合多肽包括一对亲和结构域中的第二结构域，其中一对亲和结构域中的第一结构域和一对亲和结构域中的第二结构域以小于1
×
10-7
m、小于1
×
10-8
m、小于1
×
10-9
m、小于1
×
10-10
m、小于1
×
10-11
m、小于1
×
10-12
m或小于1
×
10-13
m的解离平衡常数(kd)彼此结合。在一些实施例中，一对亲和结构域中的第一结构域与一对亲和结构域中的第二结构域以如下kd彼此结合：约1
×
10-4
m至约1
×
10-6
m、约1
×
10-5
m至约1
×
10-7
m、约1
×
10-6
m至约1
×
10-8
m、约1
×
10-7
m至约1
×
10-9
m、约1
×
10-8
m至约1
×
10-10
m、约1
×
10-9
m至约1
×
10-11
m、约1
×
10-10
m至约1
×
10-12
m、约1
×
10-11
m至约1
×
10-13
m、约1
×
10-4
m至约1
×
10-5
m、约1
×
10-5
m至约1
×
10-6
m、约1
×
10-6
m至约1
×
10-7
m、约1
×
10-7
m至约1
×
10-8
m、约1
×
10-8
m至约1
×
10-9
m、约1
×
10-9
m至约1
×
10-10
m、约1
×
10-10
m至约1
×
10-11
m、约1
×
10-11
m至约1
×
10-12
m或约1
×
10-12
m至约1
×
10-13
m(包括端点)。本领域已知的多种不同方法中的任一种均可以用于确定一对亲和结构域中的第一结构域与一对亲和结构域中的第二结构域的结合的kd值(例如，电泳迁移变动分析、滤膜结合分析、表面等离子体共振和生物分子结合动力学分析等)。
[0386]
在一些实施例中，多链嵌合多肽的第一嵌合多肽包括一对亲和结构域中的第一结构域，并且多链嵌合多肽的第二嵌合多肽包括一对亲和结构域中的第二结构域，其中一对亲和结构域中的第一结构域、一对亲和结构域中的第二结构域或两者为约10至100个氨基酸的长度。举例来说，一对亲和结构域中的第一结构域、一对亲和结构域中的第二结构域或两者可为约10至100个氨基酸的长度、约15至100个氨基酸的长度、约20至100个氨基酸的长度、约25至100个氨基酸的长度、约30至100个氨基酸的长度、约35至100个氨基酸的长度、约40至100个氨基酸的长度、约45至100个氨基酸的长度、约50至100个氨基酸的长度、约55至100个氨基酸的长度、约60至100个氨基酸的长度、约65至100个氨基酸的长度、约70至100个氨基酸的长度、约75至100个氨基酸的长度、约80至100个氨基酸的长度、约85至100个氨基酸的长度、约90至100个氨基酸的长度、约95至100个氨基酸的长度、约10至95个氨基酸的长度、约10至90个氨基酸的长度、约10至85个氨基酸的长度、约10至80个氨基酸的长度、约10至75个氨基酸的长度、约10至70个氨基酸的长度、约10至65个氨基酸的长度、约10至60个氨基酸的长度、约10至55个氨基酸的长度、约10至50个氨基酸的长度、约10至45个氨基酸的长度、约10至40个氨基酸的长度、约10至35个氨基酸的长度、约10至30个氨基酸的长度、约10至25个氨基酸的长度、约10至20个氨基酸的长度、约10至15个氨基酸的长度、约20至30个氨基酸的长度、约30至40个氨基酸的长度、约40至50个氨基酸的长度、约50至60个氨基酸的长度、约60至70个氨基酸的长度、约70至80个氨基酸的长度、约80至90个氨基酸的长度、约90至100个氨基酸的长度、约20至90个氨基酸的长度、约30至80个氨基酸的长度、约40至70个氨基酸的长度、约50至60个氨基酸的长度或介于两者之间的任何范围。在一些实施例中，一对亲和结构域中的第一结构域、一对亲和结构域中的第二结构域或两者为约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸的长度。
[0387]
在一些实施例中，本文公开的一对亲和结构域中的第一和/或第二结构域中的任一个可以在其n端和/或c端包括一个或多个另外的氨基酸(例如1、2、3、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸)，只要一对亲和结构域中第一和/或第二结构域的功能保留完整即可。例如，
来自人il-15受体的α链(il15rα)的寿司结构域可以在n端和/或c端包括一个或多个另外的氨基酸，同时仍保留与可溶性il-15结合的能力。另外地或可替代地，可溶性il-15可以在n端和/或c端包括一个或多个另外的氨基酸，同时仍保留与来自人il-15受体的α链(il15rα)的寿司结构域结合的能力。
[0388]
来自il-15受体α的α链(il15rα)的寿司结构域的非限制性实例可包括与itcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcir(seq id no:123)至少70％相同、至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同的序列。在一些实施例中，来自il15rα的α链的寿司结构域可由包括attacatgcccccctcccatgagcgtggagcacgccgacatctgggtgaagagctatagcctctacagccgggagaggtatatctgtaacagcggcttcaagaggaaggccggcaccagcagcctcaccgagtgcgtgctgaataaggctaccaacgtggctcactggacaacaccctctttaaagtgcatccgg(seq id no:124)的核酸编码。
[0389]
在一些实施例中，可溶性il-15可包括与nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints(seq id no:125)至少70％相同、至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同的序列。在一些实施例中，可溶性il-15可由包括aactgggtgaacgtcatcagcgatttaaagaagatcgaagatttaattcagtccatgcatatcgacgccactttatacacagaatccgacgtgcacccctcttgtaaggtgaccgccatgaaatgttttttactggagctgcaagttatctctttagagagcggagacgctagcatccacgacaccgtggagaatttaatcattttagccaataactctttatccagcaacggcaacgtgacagagtccggctgcaaggagtgcgaagagctggaggagaagaacatcaaggagtttctgcaatcctttgtgcacattgtccagatgttcatcaatacctcc(seq id no:126)的序列的核酸编码。
[0390]
示例性多链嵌合多肽-a型
[0391]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到il-18的受体或il-12的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一靶标结合结构域和可溶性组织因子结构域在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一嵌合多肽还包含在第一嵌合多肽中第一靶标结合结构域与可溶性组织因子结构域之间的接头序列(例如，本文描述的任一个示例性接头)。
[0392]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个是可溶性il-15或可溶性il-18。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地是可溶性il-15或可溶性il-18。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域都特异性结合到il-18的受体或il-12的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的表位。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域包括相同的氨基酸序列。
[0393]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到il-12的受体，而第二靶标结合结构域特异性结合到il-18的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到il-18的受体，而第二靶标结合结构域特异性结合到il-12的受体。
[0394]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域包括可溶性il-18(例如，可溶性人il-18)。
[0395]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二靶标结合结构域包括可溶性il-12(例如，可溶性人il-12)。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人il-15包括可溶性人il-12β(p40)的序列和可溶性人il-12α(p35)的序列。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性il-15人il-15进一步包括可溶性il-12β(p40)的序列与可溶性人il-12α(p35)的序列之间的接头序列(例如，本文所描述的示例性接头序列中的任一种)。
[0396]
示例性多链嵌合多肽-b型
[0397]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到il-21的受体或tgf-β。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一靶标结合结构域和可溶性组织因子结构域在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一嵌合多肽还包含在第一嵌合多肽中第一靶标结合结构域与可溶性组织因子结构域之间的接头序列(例如，本文描述的任一个示例性接头)。
[0398]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个是可溶性il-21(例如，可溶性人il-21多肽)或可溶性tgf-β受体(例如，可溶性tgfrβrii受体)。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地为可溶性il-21或可溶性tgf-β受体(例如，可溶性tgfrβrii受体)。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域均特异性结合到il-21的受体或tgf-β。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的表位。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域包括相同的氨基酸序列。
[0399]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到il-21的受体，而第二靶标结合结构域特异性结合到tgf-β。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合tgf-β，而第二靶标结合结构域特异性结合到il-21的受体。
[0400]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二靶标结合结构域包括可溶性tgf-β受体(例如，可溶性tgfrβrii受体(例如，可溶性人tgfrβrii受体))。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人tgfrβrii包括可溶性人tgfrβrii的第一序列和可溶性人tgfrβrii的第二序列。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人tgfrβrii包括安置于可溶性人tgfrβrii的第一序列与可溶性人tgfrβrii的第二序列之间的接头。
[0401]
示例性多链嵌合多肽-c型
[0402]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到il-7的受体或il-21的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一靶标结合结构域和可溶性组织因子结构域在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一嵌合多肽还包含在第一嵌合多肽中第一靶标结合结构域与可溶性组织因子结构域之间的接头序列(例如，本文描述的任一个示例性接头)。
[0403]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构
12的受体。
[0412]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个是可溶性il-15或可溶性il-18。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地是可溶性il-15或可溶性il-18。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域都特异性结合到il-18的受体或il-12的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的表位。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域包括相同的氨基酸序列。
[0413]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到il-12的受体，而第二靶标结合结构域特异性结合到il-18的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到il-18的受体，而第二靶标结合结构域特异性结合到il-12的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到cd16，而第二靶标结合结构域特异性结合到il-18的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到il-18的受体，而第二靶标结合结构域特异性结合到cd16。
[0414]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个特异性结合到相同的抗原。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个特异性结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个包含相同的氨基酸序列。
[0415]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域包括可溶性il-18(例如，可溶性人il-18)。
[0416]
示例性多链嵌合多肽-f型
[0417]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到il-7(例如，可溶性人il-7)的受体、cd16(例如，抗cd16 scfv)或il-21(例如，可溶性人il-21)的受体。在本文所描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包括另外的靶标结合结构域。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括另外的靶标结合结构域。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，另外的靶标结合结构域特异性结合到cd16或il-21的受体。
[0418]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到受体il-7，而第二靶标结合结构域特异性结合到cd16或il-21的受体。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域包括可溶性il-7蛋白。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性il-7蛋白是可溶性人il-7。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二抗原结合结构域包括特异性结合到cd16的靶标结合结构域。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二靶标结合结构域包括特异性结合到cd16的scfv。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二靶标结合结构域特异性结合到il-21的受体。在本文描述的
多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二靶标结合结构域包括可溶性il-21。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性il-21是可溶性人il-21。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括特异性结合到il-21的受体的另外的靶标结合结构域。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，另外的靶标结合结构域包括可溶性il-21。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性il-21是可溶性人il-21。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括特异性结合到cd16的另外的靶标结合结构域。
[0419]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个特异性结合到相同的抗原。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个特异性结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个包含相同的氨基酸序列。
[0420]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域包括可溶性il-7(例如，可溶性人il-7)。
[0421]
示例性多链嵌合多肽-g型
[0422]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到tgfβ(例如，人tgfβrii受体)、cd16(例如，抗cd16 scfv)或il-21(例如，可溶性人il-21)的受体。在本文所描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包括另外的靶标结合结构域。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括另外的靶标结合结构域。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，另外的靶标结合结构域特异性结合到cd16或il-21的受体。
[0423]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到tgf-β、cd16或il-21的受体。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到tgf-β，并且第二靶标结合结构域特异性结合到cd16或il-21的受体。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域是可溶性tgf-β受体。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性tgf-β受体是可溶性tgfβrii受体。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二靶标结合结构域特异性结合到cd16。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二抗原结合结构域包括特异性结合到cd16的抗原结合结构域。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二抗原结合结构域包括特异性结合到cd16的scfv。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二靶标结合结构域特异性结合到il-21的受体。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二靶标结合结构域包括可溶性il-21。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二靶标结合结构域包括可溶性人il-21。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括特异性结合到il-21的受体的另外的靶标结合结构域。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，另外的靶标结合结构域包括可溶性il-21。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一
些实施例中，可溶性il-21是可溶性人il-21。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括特异性结合到cd16的另外的靶标结合结构域。
[0424]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个特异性结合到相同的抗原。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个特异性结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个包含相同的氨基酸序列。
[0425]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域包括tgfβrii受体(例如，可溶性人tgfβrii受体)。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人tgfrβrii包括可溶性人tgfrβrii的第一序列和可溶性人tgfrβrii的第二序列。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人tgfrβrii包括安置于可溶性人tgfrβrii的第一序列与可溶性人tgfrβrii的第二序列之间的接头。
[0426]
示例性多链嵌合多肽-h型
[0427]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到il-7的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一靶标结合结构域和可溶性组织因子结构域在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一嵌合多肽还包含在第一嵌合多肽中第一靶标结合结构域与可溶性组织因子结构域之间的接头序列(例如，本文描述的任一个示例性接头)。
[0428]
示例性多链嵌合多肽-i型
[0429]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到tgf-β。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一靶标结合结构域和可溶性组织因子结构域在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一嵌合多肽还包含在第一嵌合多肽中第一靶标结合结构域与可溶性组织因子结构域之间的接头序列(例如，本文描述的任一个示例性接头)。
[0430]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到tgf-β。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的表位。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域包括相同的氨基酸序列。
[0431]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域是可溶性tgf-β受体(例如，可溶性tgfβrii受体，例如可溶性人tgfβrii)。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人tgfrβrii包括可溶性人tgfrβrii的第一序列和可溶性人tgfrβrii的第二序列。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人tgfrβrii包括安置于可溶性人tgfrβrii的第一序列与可溶性人tgfrβrii的第二序列之间的接头。
[0432]
示例性多链嵌合多肽-j型
[0433]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到il-7的受体、il-21的受体或cd137l的受体。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括另外的靶标结合结构域。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，另外的靶标结合结构域特异性结
合到il-21(例如，可溶性il-21，例如可溶性人il-21)的受体或cd137l(例如，可溶性cd137l，例如可溶性人cd137l)的受体。
[0434]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到il-7的受体，而第二靶标结合结构域特异性结合到il-21的受体或cd137l的受体。在一些实施例中，另外的靶标结合结构域特异性结合到il-21的受体或cd137l的受体。
[0435]
示例性多链嵌合多肽-k型
[0436]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到il-7的受体或tgf-β。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一靶标结合结构域和可溶性组织因子结构域在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一嵌合多肽还包含在第一嵌合多肽中第一靶标结合结构域与可溶性组织因子结构域之间的接头序列(例如，本文描述的任一个示例性接头)。
[0437]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到il-7的受体，而第二靶标结合结构域特异性结合到tgf-β。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到tgf-β，并且第二靶标结合结构域特异性结合到il-7的受体。
[0438]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二靶标结合结构域包含特异性结合到tgf-β的靶标结合结构域。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二靶标结合结构域是可溶性tgf-β受体(例如，可溶性tgfβrii受体，例如可溶性人tgfβrii受体)。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人tgfrβrii包括可溶性人tgfrβrii的第一序列和可溶性人tgfrβrii的第二序列。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人tgfrβrii包括安置于可溶性人tgfrβrii的第一序列与可溶性人tgfrβrii的第二序列之间的接头。
[0439]
示例性多链嵌合多肽-l型
[0440]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到tgf-β、il-21的受体或cd137l的受体。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括另外的靶标结合结构域。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，另外的靶标结合结构域特异性结合到il-21(例如，可溶性il-21，例如可溶性人il-21)的受体或cd137l(例如，可溶性cd137l，例如可溶性人cd137l)的受体。
[0441]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到tgf-β，而第二靶标结合结构域特异性结合到il-21的受体或cd137l的受体。
[0442]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域是可溶性tgf-β受体(例如，可溶性tgfβrii受体，例如可溶性人tgfβrii受体)。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人tgfrβrii包括可溶性人tgfrβrii的第一序列和可溶性人tgfrβrii的第二序列。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人tgfrβrii包括安置于可溶性人tgfrβrii的第一序列与可溶性人tgfrβrii的第二序列之间的接头。
[0443]
示例性多链嵌合多肽-m型
[0444]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到tgf-β或il-21的受体。在本文描述的这些多
链嵌合多肽的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括另外的靶标结合结构域。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，另外的靶标结合结构域特异性结合到il-21(例如，可溶性il-21，例如可溶性人il-21)的受体或tgf-β(例如，可溶性tgf-β受体，例如可溶性tgfβrii受体)。
[0445]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到tgf-β，而第二靶标结合结构域特异性结合到tgf-β或il-21的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域是可溶性tgf-β受体(例如，可溶性tgfβrii受体，例如可溶性人tgfβrii受体)。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人tgfrβrii包括可溶性人tgfrβrii的第一序列和可溶性人tgfrβrii的第二序列。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人tgfrβrii包括安置于可溶性人tgfrβrii的第一序列与可溶性人tgfrβrii的第二序列之间的接头。
[0446]
示例性多链嵌合多肽-n型
[0447]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到tgf-β或cd16。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括另外的靶标结合结构域。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，另外的靶标结合结构域特异性结合到cd16(例如，抗cd16 scfv)或tgf-β(例如可溶性tgf-β受体，例如可溶性tgfβrii受体)。
[0448]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到tgf-β，而第二靶标结合结构域特异性结合到tgf-β或cd16。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域是可溶性tgf-β受体(例如，可溶性tgfβrii受体，例如可溶性人tgfβrii受体)。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人tgfrβrii包括可溶性人tgfrβrii的第一序列和可溶性人tgfrβrii的第二序列。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人tgfrβrii包括安置于可溶性人tgfrβrii的第一序列与可溶性人tgfrβrii的第二序列之间的接头。
[0449]
示例性多链嵌合多肽-o型
[0450]
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到tgf-β或cd137l的受体。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括另外的靶标结合结构域。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，另外的靶标结合结构域特异性结合到tgf-β的受体(例如可溶性tgf-β受体，例如可溶性tgfβrii受体)或cd137l。
[0451]
在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一靶标结合结构域和可溶性组织因子结构域在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一嵌合多肽还包含在第一嵌合多肽中第一靶标结合结构域与可溶性组织因子结构域之间的接头序列(例如，本文描述的任一个示例性接头)。
[0452]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性组织因子结构域和一对亲和结构域中的第一结构域在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一嵌合多肽还包括在第一嵌合多肽中可溶性组织因子结构域与一对亲和结构域中的第一结构域之间的接头序列(例如，本文描述的任一个示例性接头)。
[0453]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，一对亲和结构域中的第二结构域和第二靶
标结合结构域在第二嵌合多肽中彼此直接邻接。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括在第二嵌合多肽中一对亲和结构域中的第二结构域与第二靶标结合结构域之间的接头序列(例如，本文描述的任一个示例性接头)。
[0454]
在一些实施例中，第二嵌合多肽还在第二嵌合多肽的n端或c端包含一个或多个另外的靶标结合结构域。
[0455]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，另外的靶标结合结构域和一对亲和结构域中的第二结构域在第二嵌合多肽中彼此直接邻接。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括在第二嵌合多肽中一对亲和结构域中的第二结构域与另外的靶标结合结构域之间的接头序列(例如，本文描述的任一个示例性接头)。
[0456]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，另外的靶标结合结构域和第二靶标结合结构域在第二嵌合多肽中彼此直接邻接。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括在第二嵌合多肽中第二靶标结合结构域与另外的靶标结合结构域之间的接头序列(例如，本文描述的任一个示例性接头)。
[0457]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性组织因子结构域可以是本文描述的任一种示例性可溶性组织因子结构域。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，所述一对亲和结构域可以是本文描述的任一对示例性亲和结构域。
[0458]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到tgf-β，而第二靶标结合结构域特异性结合到cd137l。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域或另外的靶标结合结构域是可溶性tgf-β受体(例如，可溶性tgfβrii受体，例如可溶性人tgfβrii受体)。
[0459]
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人tgfrβrii包括可溶性人tgfrβrii的第一序列和可溶性人tgfrβrii的第二序列。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人tgfrβrii包括安置于可溶性人tgfrβrii的第一序列与可溶性人tgfrβrii的第二序列之间的接头。
[0460]
示例性多链嵌合多肽的序列
[0461]
il12/il-15rαsu构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:30)：
[0462]
(信号肽)
[0463]
atgaaatgggtgacctttatttctttactgttcctctttagcagcgcctactcc
[0464]
(人il-12亚基β(p40))
[0465]
atttgggaactgaagaaggacgtctacgtggtcgaactggactggtatcccgatgctcccggcgaaatggtggtgctcacttgtgacacccccgaagaagacggcatcacttggaccctcgatcagagcagcgaggtgctgggctccggaaagaccctcacaatccaagttaaggagttcggagacgctggccaatacacatgccacaagggaggcgaggtgctcagccattccttattattattacacaagaaggaagacggaatctggtccaccgacattttaaaagatcagaaggagcccaagaataagacctttttaaggtgtgaggccaaaaactacagcggtcgtttcacttgttggtggctgaccaccatttccaccgatttaaccttctccgtgaaaagcagccggggaagctccgaccctcaaggtgtgacatgtggagccgctaccctcagcgctgagagggttcgtggcgataacaaggaatacgagtacagcgtggagtgccaagaagatagcgcttgtcccgctgccgaagaatctttacccattgaggtgatggtggacgccgtgcacaaactcaagtacgagaactacacctcctccttctttatccgggacatcattaagcccgatcctcctaagaatttacagctgaagcctctcaaaaatagccggcaagttgaggtctcttgggaatatcccgacacttggagcacaccccacagctacttctctttaaccttttgtgtgcaa
gttcaaggtaaaagcaagcgggagaagaaagaccgggtgtttaccgacaaaaccagcgccaccgtcatctgtcggaagaacgcctccatcagcgtgagggctcaagatcgttattactccagcagctggtccgagtgggccagcgtgccttgttcc
[0466]
(接头)
[0467]
ggcggtggaggatccggaggaggtggctccggcggcggaggatct
[0468]
(人il-12亚基α(p35))
[0469]
cgtaacctccccgtggctacccccgatcccggaatgttcccttgtttacaccacagccagaatttactgagggccgtgagcaacatgctgcagaaagctaggcagactttagaattttacccttgcaccagcgaggagatcgaccatgaagatatcaccaaggacaagacatccaccgtggaggcttgtttacctctggagctgacaaagaacgagtcttgtctcaactctcgtgaaaccagcttcatcacaaatggctcttgtttagcttcccggaagacctcctttatgatggctttatgcctcagctccatctacgaggatttaaagatgtaccaagtggagttcaagaccatgaacgccaagctgctcatggaccctaaacggcagatctttttagaccagaacatgctggctgtgattgatgagctgatgcaagctttaaacttcaactccgagaccgtccctcagaagtcctccctcgaggagcccgatttttacaagacaaagatcaaactgtgcattttactccacgcctttaggatccgggccgtgaccattgaccgggtcatgagctatttaaacgccagc
[0470]
(人il-15rα寿司结构域)
[0471]
attacatgcccccctcccatgagcgtggagcacgccgacatctgggtgaagagctatagcctctacagccgggagaggtatatctgtaacagcggcttcaagaggaaggccggcaccagcagcctcaccgagtgcgtgctgaataaggctaccaacgtggctcactggacaacaccctctttaaagtgcatccgg
[0472]
il12/il-15rαsu融合蛋白(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(seq id no:31)：
[0473]
(信号肽)
[0474]
mkwvtfisllflfssays
[0475]
(人il-12亚基β(p40))
[0476]
iwelkkdvyvveldwypdapgemvvltcdtpeedgitwtldqssevlgsgktltiqvkefgdagqytchkggevlshsllllhkkedgiwstdilkdqkepknktflrceaknysgrftcwwlttistdltfsvkssrgssdpqgvtcgaatlsaervrgdnkeyeysvecqedsacpaaeeslpievmvdavhklkyenytssffirdiikpdppknlqlkplknsrqvevsweypdtwstphsyfsltfcvqvqgkskrekkdrvftdktsatvicrknasisvraqdryyssswsewasvpcs
[0477]
(接头)
[0478]
ggggsggggsggggs
[0479]
(人il-12亚基α(p35))
[0480]
rnlpvatpdpgmfpclhhsqnllravsnmlqkarqtlefypctseeidheditkdktstveaclpleltknesclnsretsfitngsclasrktsfmmalclssiyedlkmyqvefktmnakllmdpkrqifldqnmlavidelmqalnfnsetvpqkssleepdfyktkiklcillhafriravtidrvmsylnas
[0481]
(人il-15rα寿司结构域)
[0482]
itcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcir
[0483]
il-18/tf/il-15构建体的核酸序列如下(seq id no:32)：
[0484]
(信号肽)
[0485]
atgaagtgggtcacatttatctctttactgttcctcttctccagcgcctacagc
[0486]
(人il-18)
[0487]
tacttcggcaaactggaatccaagctgagcgtgatccggaatttaaacgaccaagttctgtttatcgatcaaggtaaccggcctctgttcgaggacatgaccgactccgattgccgggacaatgccccccggaccatcttcattatctccatgtacaaggacagccagccccggggcatggctgtgacaattagcgtgaagtgtgagaaaatcagcactttatcttgtgagaacaagatcatctcctttaaggaaatgaacccccccgataacatcaaggacaccaagtccgatatcatcttcttccagcggtccgtgcccggtcacgataacaagatgcagttcgaatcctcctcctacgagggctactttttagcttgtgaaaaggagagggatttattcaagctgatcctcaagaaggaggacgagctgggcgatcgttccatcatgttcaccgtccaaaacgaggat
[0488]
(人组织因子219)
[0489]
agcggcacaaccaacacagtcgctgcctataacctcacttggaagagcaccaacttcaaaaccatcctcgaatgggaacccaaacccgttaaccaagtttacaccgtgcagatcagcaccaagtccggcgactggaagtccaaatgtttctataccaccgacaccgagtgcgatctcaccgatgagatcgtgaaagatgtgaaacagacctacctcgcccgggtgtttagctaccccgccggcaatgtggagagcactggttccgctggcgagcctttatacgagaacagccccgaatttaccccttacctcgagaccaatttaggacagcccaccatccaaagctttgagcaagttggcacaaaggtgaatgtgacagtggaggacgagcggactttagtgcggcggaacaacacctttctcagcctccgggatgtgttcggcaaagatttaatctacacactgtattactggaagtcctcttcctccggcaagaagacagctaaaaccaacacaaacgagtttttaatcgacgtggataaaggcgaaaactactgtttcagcgtgcaagctgtgatcccctcccggaccgtgaataggaaaagcaccgatagccccgttgagtgcatgggccaagaaaagggcgagttccgggag
[0490]
(人il-15)
[0491]
aactgggtgaacgtcatcagcgatttaaagaagatcgaagatttaattcagtccatgcatatcgacgccactttatacacagaatccgacgtgcacccctcttgtaaggtgaccgccatgaaatgttttttactggagctgcaagttatctctttagagagcggagacgctagcatccacgacaccgtggagaatttaatcattttagccaataactctttatccagcaacggcaacgtgacagagtccggctgcaaggagtgcgaagagctggaggagaagaacatcaaggagtttctgcaatcctttgtgcacattgtccagatgttcatcaatacctcc
[0492]
il-18/tf/il-15融合蛋白(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(seq id no:33)：
[0493]
(信号肽)
[0494]
mkwvtfisllflfssays
[0495]
(人il-18)
[0496]
yfgklesklsvirnlndqvlfidqgnrplfedmtdsdcrdnaprtifiismykdsqprgmavtisvkcekistlscenkiisfkemnppdnikdtksdiiffqrsvpghdnkmqfesssyegyflacekerdlfklilkkedelgdrsimftvqned
[0497]
(人组织因子219)
[0498]
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[0499]
(人il-15)
[0500]
nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints
[0501]
il-12/il-15rαsu/αcd16scfv构建体的核酸序列如下(seq id no:34)：
[0502]
(信号肽)
[0503]
atgaaatgggtgacctttatttctttactgttcctctttagcagcgcctactcc
[0504]
(人il-12亚基β(p40))
[0505]
atttgggaactgaagaaggacgtctacgtggtcgaactggactggtatcccgatgctcccggcgaaatggtggtgctcacttgtgacacccccgaagaagacggcatcacttggaccctcgatcagagcagcgaggtgctgggctccggaaagaccctcacaatccaagttaaggagttcggagacgctggccaatacacatgccacaagggaggcgaggtgctcagccattccttattattattacacaagaaggaagacggaatctggtccaccgacattttaaaagatcagaaggagcccaagaataagacctttttaaggtgtgaggccaaaaactacagcggtcgtttcacttgttggtggctgaccaccatttccaccgatttaaccttctccgtgaaaagcagccggggaagctccgaccctcaaggtgtgacatgtggagccgctaccctcagcgctgagagggttcgtggcgataacaaggaatacgagtacagcgtggagtgccaagaagatagcgcttgtcccgctgccgaagaatctttacccattgaggtgatggtggacgccgtgcacaaactcaagtacgagaactacacctcctccttctttatccgggacatcattaagcccgatcctcctaagaatttacagctgaagcctctcaaaaatagccggcaagttgaggtctcttgggaatatcccgacacttggagcacaccccacagctacttctctttaaccttttgtgtgcaagttcaaggtaaaagcaagcgggagaagaaagaccgggtgtttaccgacaaaaccagcgccaccgtcatctgtcggaagaacgcctccatcagcgtgagggctcaagatcgttattactccagcagctggtccgagtgggccagcgtgccttgttcc
[0506]
(接头)
[0507]
ggcggtggaggatccggaggaggtggctccggcggcggaggatct
[0508]
(人il-12亚基α(p35))
[0509]
cgtaacctccccgtggctacccccgatcccggaatgttcccttgtttacaccacagccagaatttactgagggccgtgagcaacatgctgcagaaagctaggcagactttagaattttacccttgcaccagcgaggagatcgaccatgaagatatcaccaaggacaagacatccaccgtggaggcttgtttacctctggagctgacaaagaacgagtcttgtctcaactctcgtgaaaccagcttcatcacaaatggctcttgtttagcttcccggaagacctcctttatgatggctttatgcctcagctccatctacgaggatttaaagatgtaccaagtggagttcaagaccatgaacgccaagctgctcatggaccctaaacggcagatctttttagaccagaacatgctggctgtgattgatgagctgatgcaagctttaaacttcaactccgagaccgtccctcagaagtcctccctcgaggagcccgatttttacaagacaaagatcaaactgtgcattttactccacgcctttaggatccgggccgtgaccattgaccgggtcatgagctatttaaacgccagc
[0510]
(人il-15rα寿司结构域)
[0511]
attacatgcccccctcccatgagcgtggagcacgccgacatctgggtgaagagctatagcctctacagccgggagaggtatatctgtaacagcggcttcaagaggaaggccggcaccagcagcctcaccgagtgcgtgctgaataaggctaccaacgtggctcactggacaacaccctctttaaagtgcatccgg
[0512]
(抗人cd16轻链可变结构域)
[0513]
tccgagctgacccaggaccctgctgtgtccgtggctctgggccagaccgtgaggatcacctgccagggcgactccctgaggtcctactacgcctcctggtaccagcagaagcccggccaggctcctgtgctggtgatctacggcaagaacaacaggccctccggcatccctgacaggttctccggatcctcctccggcaacaccgcctccctgaccatcacaggcgctcaggccgaggacgaggctgactactactgcaactccagggactcctccggcaaccatgtggtgttcggcggcggcaccaagctgaccgtgggccat
[0514]
(接头)
[0515]
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[0516]
(抗人cd16重链可变结构域)
[0517]
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[0518]
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[0519]
(信号肽)
[0520]
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[0521]
(人il-12亚基β(p40))
[0522]
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[0523]
(接头)
[0524]
ggggsggggsggggs
[0525]
(人il-12亚基α(p35))
[0526]
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[0527]
(人il-15rα寿司结构域)
[0528]
itcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcir
[0529]
(抗人cd16轻链可变结构域)
[0530]
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[0531]
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[0532]
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[0533]
(抗人cd16重链可变结构域)
[0534]
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[0535]
il-18/il-15rαsu构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:36)：
[0536]
(信号肽)
[0537]
atgaagtgggtcacatttatctctttactgttcctcttctccagcgcctacagc
[0538]
(人il-18)
[0539]
tacttcggcaaactggaatccaagctgagcgtgatccggaatttaaacgaccaagttctgtttatcgatcaaggtaaccggcctctgttcgaggacatgaccgactccgattgccgggacaatgccccccggaccatcttcattatctccatgtacaaggacagccagccccggggcatggctgtgacaattagcgtgaagtgtgagaaaatcagcactttatcttgtgagaacaagatcatctcctttaaggaaatgaacccccccgataacatcaaggacaccaagtccgatatcatc
ttcttccagcggtccgtgcccggtcacgataacaagatgcagttcgaatcctcctcctacgagggctactttttagcttgtgaaaaggagagggatttattcaagctgatcctcaagaaggaggacgagctgggcgatcgttccatcatgttcaccgtccaaaacgaggat
[0540]
(人il-15rα寿司结构域)
[0541]
attacatgcccccctcccatgagcgtggagcacgccgacatctgggtgaagagctatagcctctacagccgggagaggtatatctgtaacagcggcttcaagaggaaggccggcaccagcagcctcaccgagtgcgtgctgaataaggctaccaacgtggctcactggacaacaccctctttaaagtgcatccgg
[0542]
il-18/il-15rαsu融合蛋白(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(seq id no:37)：
[0543]
(信号肽)
[0544]
mkwvtfisllflfssays
[0545]
(人il-18)
[0546]
yfgklesklsvirnlndqvlfidqgnrplfedmtdsdcrdnaprtifiismykdsqprgmavtisvkcekistlscenkiisfkemnppdnikdtksdiiffqrsvpghdnkmqfesssyegyflacekerdlfklilkkedelgdrsimftvqned
[0547]
(人il-15rα寿司结构域)
[0548]
itcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcir
[0549]
il-12/tf/il-15构建体(包括前导序列)的核酸序列如下(seq id no:38)：
[0550]
(信号肽)
[0551]
atgaaatgggtgacctttatttctttactgttcctctttagcagcgcctactcc
[0552]
(人il-12亚基β(p40))
[0553]
atttgggaactgaagaaggacgtctacgtggtcgaactggactggtatcccgatgctcccggcgaaatggtggtgctcacttgtgacacccccgaagaagacggcatcacttggaccctcgatcagagcagcgaggtgctgggctccggaaagaccctcacaatccaagttaaggagttcggagacgctggccaatacacatgccacaagggaggcgaggtgctcagccattccttattattattacacaagaaggaagacggaatctggtccaccgacattttaaaagatcagaaggagcccaagaataagacctttttaaggtgtgaggccaaaaactacagcggtcgtttcacttgttggtggctgaccaccatttccaccgatttaaccttctccgtgaaaagcagccggggaagctccgaccctcaaggtgtgacatgtggagccgctaccctcagcgctgagagggttcgtggcgataacaaggaatacgagtacagcgtggagtgccaagaagatagcgcttgtcccgctgccgaagaatctttacccattgaggtgatggtggacgccgtgcacaaactcaagtacgagaactacacctcctccttctttatccgggacatcattaagcccgatcctcctaagaatttacagctgaagcctctcaaaaatagccggcaagttgaggtctcttgggaatatcccgacacttggagcacaccccacagctacttctctttaaccttttgtgtgcaagttcaaggtaaaagcaagcgggagaagaaagaccgggtgtttaccgacaaaaccagcgccaccgtcatctgtcggaagaacgcctccatcagcgtgagggctcaagatcgttattactccagcagctggtccgagtgggccagcgtgccttgttcc
[0554]
(接头)
[0555]
ggcggtggaggatccggaggaggtggctccggcggcggaggatct
[0556]
(人il-12亚基α(p35))
[0557]
cgtaacctccccgtggctacccccgatcccggaatgttcccttgtttacaccacagccagaatttactgagggccgtgagcaacatgctgcagaaagctaggcagactttagaattttacccttgcaccagcgaggagatcgacca
tgaagatatcaccaaggacaagacatccaccgtggaggcttgtttacctctggagctgacaaagaacgagtcttgtctcaactctcgtgaaaccagcttcatcacaaatggctcttgtttagcttcccggaagacctcctttatgatggctttatgcctcagctccatctacgaggatttaaagatgtaccaagtggagttcaagaccatgaacgccaagctgctcatggaccctaaacggcagatctttttagaccagaacatgctggctgtgattgatgagctgatgcaagctttaaacttcaactccgagaccgtccctcagaagtcctccctcgaggagcccgatttttacaagacaaagatcaaactgtgcattttactccacgcctttaggatccgggccgtgaccattgaccgggtcatgagctatttaaacgccagc
[0558]
(人组织因子219)
[0559]
agcggcacaaccaacacagtcgctgcctataacctcacttggaagagcaccaacttcaaaaccatcctcgaatgggaacccaaacccgttaaccaagtttacaccgtgcagatcagcaccaagtccggcgactggaagtccaaatgtttctataccaccgacaccgagtgcgatctcaccgatgagatcgtgaaagatgtgaaacagacctacctcgcccgggtgtttagctaccccgccggcaatgtggagagcactggttccgctggcgagcctttatacgagaacagccccgaatttaccccttacctcgagaccaatttaggacagcccaccatccaaagctttgagcaagttggcacaaaggtgaatgtgacagtggaggacgagcggactttagtgcggcggaacaacacctttctcagcctccgggatgtgttcggcaaagatttaatctacacactgtattactggaagtcctcttcctccggcaagaagacagctaaaaccaacacaaacgagtttttaatcgacgtggataaaggcgaaaactactgtttcagcgtgcaagctgtgatcccctcccggaccgtgaataggaaaagcaccgatagccccgttgagtgcatgggccaagaaaagggcgagttccgggag
[0560]
(人il-15)
[0561]
aactgggtgaacgtcatcagcgatttaaagaagatcgaagatttaattcagtccatgcatatcgacgccactttatacacagaatccgacgtgcacccctcttgtaaggtgaccgccatgaaatgttttttactggagctgcaagttatctctttagagagcggagacgctagcatccacgacaccgtggagaatttaatcattttagccaataactctttatccagcaacggcaacgtgacagagtccggctgcaaggagtgcgaagagctggaggagaagaacatcaaggagtttctgcaatcctttgtgcacattgtccagatgttcatcaatacctcc
[0562]
il-12/tf/il-15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(seq id no:39)：
[0563]
(信号肽)
[0564]
mkwvtfisllflfssays
[0565]
(人il-12亚基β(p40))
[0566]
iwelkkdvyvveldwypdapgemvvltcdtpeedgitwtldqssevlgsgktltiqvkefgdagqytchkggevlshsllllhkkedgiwstdilkdqkepknktflrceaknysgrftcwwlttistdltfsvkssrgssdpqgvtcgaatlsaervrgdnkeyeysvecqedsacpaaeeslpievmvdavhklkyenytssffirdiikpdppknlqlkplknsrqvevsweypdtwstphsyfsltfcvqvqgkskrekkdrvftdktsatvicrknasisvraqdryyssswsewasvpcs
[0567]
(接头)
[0568]
ggggsggggsggggs
[0569]
(人il-12亚基α(p35))
[0570]
rnlpvatpdpgmfpclhhsqnllravsnmlqkarqtlefypctseeidheditkdktstveaclpleltknesclnsretsfitngsclasrktsfmmalclssiyedlkmyqvefktmnakllmdpkrqifldqnmlavidelmqalnfnsetvpqkssleepdfyktkiklcillhafriravtidrvmsylnas
[0571]
(人组织因子219)
[0572]
sgttntvaaynltwkstnfktilewepkpvnqvytvqistksgdwkskcfyttdtecdltdeivkdvkq
tylarvfsypagnvestgsageplyenspeftpyletnlgqptiqsfeqvgtkvnvtvedertlvrrnntflslrdvfgkdliytlyywkssssgkktaktntneflidvdkgenycfsvqavipsrtvnrkstdspvecmgqekgefre
[0573]
(人il-15)
[0574]
nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints
[0575]
tgfβrii/il-15rαsu构建体(包括信号序列)的核酸序列如下(seq id no:40)：
[0576]
(信号肽)
[0577]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[0578]
(人tgfβrii-第1片段)
[0579]
atccccccccatgtgcaaaagagcgtgaacaacgatatgatcgtgaccgacaacaacggcgccgtgaagtttccccagctctgcaagttctgcgatgtcaggttcagcacctgcgataatcagaagtcctgcatgtccaactgcacgatcacctccatctgcgagaagccccaagaagtgtgcgtggccgtgtggcggaaaaatgacgagaacatcaccctggagaccgtgtgtcacgaccccaagctcccttatcacgacttcattctggaggacgctgcctcccccaaatgcatcatgaaggagaagaagaagcccggagagaccttctttatgtgttcctgtagcagcgacgagtgtaacgacaacatcatcttcagcgaagagtacaacaccagcaaccctgat
[0580]
(接头)
[0581]
ggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagt
[0582]
(人tgfβrii-第2片段)
[0583]
attcctccccacgtgcagaagagcgtgaataatgacatgatcgtgaccgataacaatggcgccgtgaaatttccccagctgtgcaaattctgcgatgtgaggttttccacctgcgacaaccagaagtcctgtatgagcaactgcacaatcacctccatctgtgagaagcctcaggaggtgtgcgtggctgtctggcggaagaatgacgagaatatcaccctggaaaccgtctgccacgatcccaagctgccctaccacgatttcatcctggaagacgccgccagccctaagtgcatcatgaaagagaaaaagaagcctggcgagacctttttcatgtgctcctgcagcagcgacgaatgcaacgacaatatcatctttagcgaggaatacaataccagcaaccccgac
[0584]
(人il-15rα寿司结构域)
[0585]
atcacgtgtcctcctcctatgtccgtggaacacgcagacatctgggtcaagagctacagcttgtactccagggagcggtacatttgtaactctggtttcaagcgtaaagccggcacgtccagcctgacggagtgcgtgttgaacaaggccacgaatgtcgcccactggacaacccccagtctcaaatgtattaga
[0586]
tgfβrii/il-15rαsu构建体(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(seq id no:41)：
[0587]
(信号肽)
[0588]
mkwvtfisllflfssays
[0589]
(人tgfβrii-第1片段)
[0590]
ipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpd
[0591]
(接头)
[0592]
ggggsggggsggggs
[0593]
(人tgfβrii-第2片段)
[0594]
ipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrknd
enitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpd
[0595]
(人il-15rα寿司结构域)
[0596]
itcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcir
[0597]
il-21/tf/il-15构建体(包括前导序列)的核酸序列如下(seq id no:42)：
[0598]
(信号肽)
[0599]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[0600]
(人il-21)
[0601]
cagggccaggacaggcacatgatccggatgaggcagctcatcgacatcgtcgaccagctgaagaactacgtgaacgacctggtgcccgagtttctgcctgcccccgaggacgtggagaccaactgcgagtggtccgccttctcctgctttcagaaggcccagctgaagtccgccaacaccggcaacaacgagcggatcatcaacgtgagcatcaagaagctgaagcggaagcctccctccacaaacgccggcaggaggcagaagcacaggctgacctgccccagctgtgactcctacgagaagaagccccccaaggagttcctggagaggttcaagtccctgctgcagaagatgatccatcagcacctgtcctccaggacccacggctccgaggactcc
[0602]
(人组织因子219)
[0603]
tccggcaccaccaataccgtggccgcttataacctcacatggaagagcaccaacttcaagacaattctggaatgggaacccaagcccgtcaatcaagtttacaccgtgcagatctccaccaaatccggagactggaagagcaagtgcttctacacaacagacaccgagtgtgatttaaccgacgaaatcgtcaaggacgtcaagcaaacctatctggctcgggtcttttcctaccccgctggcaatgtcgagtccaccggctccgctggcgagcctctctacgagaattcccccgaattcaccccttatttagagaccaatttaggccagcctaccatccagagcttcgagcaagttggcaccaaggtgaacgtcaccgtcgaggatgaaaggactttagtgcggcggaataacacatttttatccctccgggatgtgttcggcaaagacctcatctacacactgtactattggaagtccagctcctccggcaaaaagaccgctaagaccaacaccaacgagtttttaattgacgtggacaaaggcgagaactactgcttcagcgtgcaagccgtgatcccttctcgtaccgtcaaccggaagagcacagattcccccgttgagtgcatgggccaagaaaagggcgagttccgggag
[0604]
(人il-15)
[0605]
aactgggtgaacgtcatcagcgatttaaagaagatcgaagatttaattcagtccatgcatatcgacgccactttatacacagaatccgacgtgcacccctcttgtaaggtgaccgccatgaaatgttttttactggagctgcaagttatctctttagagagcggagacgctagcatccacgacaccgtggagaatttaatcattttagccaataactctttatccagcaacggcaacgtgacagagtccggctgcaaggagtgcgaagagctggaggagaagaacatcaaggagtttctgcaatcctttgtgcacattgtccagatgttcatcaatacctcc
[0606]
成熟的il-21/tf/il-15融合蛋白(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(seq id no:43)：
[0607]
(信号肽)
[0608]
mkwvtfisllflfssays
[0609]
(人il-21)
[0610]
qgqdrhmirmrqlidivdqlknyvndlvpeflpapedvetncewsafscfqkaqlksantgnneriinvsikklkrkppstnagrrqkhrltcpscdsyekkppkeflerfksllqkmihqhlssrthgseds
[0611]
(人组织因子219)
[0612]
sgttntvaaynltwkstnfktilewepkpvnqvytvqistksgdwkskcfyttdtecdltdeivkdvkqtylarvfsypagnvestgsageplyenspeftpyletnlgqptiqsfeqvgtkvnvtvedertlvrrnntflslrdv
fgkdliytlyywkssssgkktaktntneflidvdkgenycfsvqavipsrtvnrkstdspvecmgqekgefre
[0613]
(人il-15)
[0614]
nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints
[0615]
il-21/tf突变体/il-15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:44，加阴影的核苷酸是突变体，并且突变密码子带有下划线)：
[0616]
(信号序列)
[0617]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[0618]
(人il-21)
[0619]
cagggccaggacaggcacatgatccggatgaggcagctcatcgacatcgtcgaccagctgaagaactacgtgaacgacctggtgcccgagtttctgcctgcccccgaggacgtggagaccaactgcgagtggtccgccttctcctgctttcagaaggcccagctgaagtccgccaacaccggcaacaacgagcggatcatcaacgtgagcatcaagaagctgaagcggaagcctccctccacaaacgccggcaggaggcagaagcacaggctgacctgccccagctgtgactcctacgagaagaagccccccaaggagttcctggagaggttcaagtccctgctgcagaagatgatccatcagcacctgtcctccaggacccacggctccgaggactcc
[0620]
(人组织因子219突变体)
[0621]
tccggcaccaccaataccgtggccgcttataacctcacatggaagagcaccaacttcgcgacagctctggaatgggaacccaagcccgtcaatcaagtttacaccgtgcagatctccaccaaatccggagactggaagagcaagtgcttctacacaacagacaccgagtgtgctttaaccgacgaaatcgtcaaggacgtcaagcaaacctatctggctcgggtcttttcctaccccgctggcaatgtcgagtccaccggctccgctggcgagcctctctacgagaattcccccgaattcaccccttatttagagaccaatttaggccagcctaccatccagagcttcgagcaagttggcaccaaggtgaacgtcaccgtcgaggatgaaaggactttagtggcgcggaataacacagctttatccctccgggatgtgttcggcaaagacctcatctacacactgtactattggaagtccagctcctccggcaaaaagaccgctaagaccaacaccaacgagtttttaattgacgtggacaaaggcgagaactactgcttcagcgtgcaagccgtgatcccttctcgtaccgtcaaccggaagagcacagattcccccgttgagtgcatgggccaagaaaagggcgagttccgggag
[0622]
(人il-15)
[0623]
aactgggtgaacgtcatcagcgatttaaagaagatcgaagatttaattcagtccatgcatatcgacgccactttatacacagaatccgacgtgcacccctcttgtaaggtgaccgccatgaaatgttttttactggagctgcaagttatctctttagagagcggagacgctagcatccacgacaccgtggagaatttaatcattttagccaataactctttatccagcaacggcaacgtgacagagtccggctgcaaggagtgcgaagagctggaggagaagaacatcaaggagtttctgcaatcctttgtgcacattgtccagatgttcatcaatacctcc
[0624]
il-21/tf突变体/il-15构建体(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(seq id no:45，取代的残基被示出为加阴影并且带有下划线)：
[0625]
(信号肽)
[0626]
mkwvtfisllflfssays
[0627]
(人il-21)
[0628]
qgqdrhmirmrqlidivdqlknyvndlvpeflpapedvetncewsafscfqkaqlksantgnneriinvsikklkrkppstnagrrqkhrltcpscdsyekkppkeflerfksllqkmihqhlssrthgseds
[0629]
(人组织因子219)
[0630]
sgttntvaaynltwkstnfatalewepkpvnqvytvqistksgdwkskcfyttdtecaltdeivkdvkqtylarvfsypagnvestgsageplyenspeftpyletnlgqptiqsfeqvgtkvnvtvedertlvarnntalslrdvfgkdliytlyywkssssgkktaktntneflidvdkgenycfsvqavipsrtvnrkstdspvecmgqekgefre
[0631]
(人il-15)
[0632]
nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints
[0633]
il-21/il-15rαsu构建体(包括信号序列)的核酸序列如下(seq id no:46)：
[0634]
(信号序列)
[0635]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[0636]
(人il-21)
[0637]
cagggccaggacaggcacatgatccggatgaggcagctcatcgacatcgtcgaccagctgaagaactacgtgaacgacctggtgcccgagtttctgcctgcccccgaggacgtggagaccaactgcgagtggtccgccttctcctgctttcagaaggcccagctgaagtccgccaacaccggcaacaacgagcggatcatcaacgtgagcatcaagaagctgaagcggaagcctccctccacaaacgccggcaggaggcagaagcacaggctgacctgccccagctgtgactcctacgagaagaagccccccaaggagttcctggagaggttcaagtccctgctgcagaagatgatccatcagcacctgtcctccaggacccacggctccgaggactcc
[0638]
(人il-15rα寿司结构域)
[0639]
attacatgcccccctcccatgagcgtggagcacgccgacatctgggtgaagagctatagcctctacagccgggagaggtatatctgtaacagcggcttcaagaggaaggccggcaccagcagcctcaccgagtgcgtgctgaataaggctaccaacgtggctcactggacaacaccctctttaaagtgcatccgg
[0640]
il-21/il-15rαsu构建体(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(seq id no:101)：
[0641]
(信号肽)
[0642]
mkwvtfisllflfssays
[0643]
(人il-21)
[0644]
qgqdrhmirmrqlidivdqlknyvndlvpeflpapedvetncewsafscfqkaqlksantgnneriinvsikklkrkppstnagrrqkhrltcpscdsyekkppkeflerfksllqkmihqhlssrthgseds
[0645]
(人il-15rα寿司结构域)
[0646]
itcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcir
[0647]
tgfβrii/tf/il-15构建体(包括前导序列)的核酸序列如下(seq id no:47)：
[0648]
(信号肽)
[0649]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[0650]
(人tgfβrii-第1片段)
[0651]
atccccccccatgtgcaaaagagcgtgaacaacgatatgatcgtgaccgacaacaacggcgccgtgaagtttccccagctctgcaagttctgcgatgtcaggttcagcacctgcgataatcagaagtcctgcatgtccaactgcacgatcacctccatctgcgagaagccccaagaagtgtgcgtggccgtgtggcggaaaaatgacgagaacatcaccctggagaccgtgtgtcacgaccccaagctcccttatcacgacttcattctggaggacgctgcctcccccaaatgcatcatgaaggagaagaagaagcccggagagaccttctttatgtgttcctgtagcagcgacgagtgtaacgacaacatcatcttcagcgaagagtacaacaccagcaaccctgat
[0652]
(接头)
[0653]
ggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagt
[0654]
(人tgfβrii-第2片段)
[0655]
attcctccccacgtgcagaagagcgtgaataatgacatgatcgtgaccgataacaatggcgccgtgaaatttccccagctgtgcaaattctgcgatgtgaggttttccacctgcgacaaccagaagtcctgtatgagcaactgcacaatcacctccatctgtgagaagcctcaggaggtgtgcgtggctgtctggcggaagaatgacgagaatatcaccctggaaaccgtctgccacgatcccaagctgccctaccacgatttcatcctggaagacgccgccagccctaagtgcatcatgaaagagaaaaagaagcctggcgagacctttttcatgtgctcctgcagcagcgacgaatgcaacgacaatatcatctttagcgaggaatacaataccagcaaccccgac
[0656]
(人组织因子219)
[0657]
tccggcaccaccaataccgtggccgcttataacctcacatggaagagcaccaacttcaagacaattctggaatgggaacccaagcccgtcaatcaagtttacaccgtgcagatctccaccaaatccggagactggaagagcaagtgcttctacacaacagacaccgagtgtgatttaaccgacgaaatcgtcaaggacgtcaagcaaacctatctggctcgggtcttttcctaccccgctggcaatgtcgagtccaccggctccgctggcgagcctctctacgagaattcccccgaattcaccccttatttagagaccaatttaggccagcctaccatccagagcttcgagcaagttggcaccaaggtgaacgtcaccgtcgaggatgaaaggactttagtgcggcggaataacacatttttatccctccgggatgtgttcggcaaagacctcatctacacactgtactattggaagtccagctcctccggcaaaaagaccgctaagaccaacaccaacgagtttttaattgacgtggacaaaggcgagaactactgcttcagcgtgcaagccgtgatcccttctcgtaccgtcaaccggaagagcacagattcccccgttgagtgcatgggccaagaaaagggcgagttccgggag
[0658]
(人il-15)
[0659]
aactgggtgaacgtcatcagcgatttaaagaagatcgaagatttaattcagtccatgcatatcgacgccactttatacacagaatccgacgtgcacccctcttgtaaggtgaccgccatgaaatgttttttactggagctgcaagttatctctttagagagcggagacgctagcatccacgacaccgtggagaatttaatcattttagccaataactctttatccagcaacggcaacgtgacagagtccggctgcaaggagtgcgaagagctggaggagaagaacatcaaggagtttctgcaatcctttgtgcacattgtccagatgttcatcaatacctcc
[0660]
tgfβrii/tf/il-15融合蛋白(包括信号肽)的氨基酸序列如下(seq id no:48)：
[0661]
(信号肽)
[0662]
mkwvtfisllflfssays
[0663]
(人tgfβrii-第1片段)
[0664]
ipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpd
[0665]
(接头)
[0666]
ggggsggggsggggs
[0667]
(人tgfβrii-第2片段)
[0668]
ipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpd
[0669]
(人组织因子219)
[0670]
sgttntvaaynltwkstnfktilewepkpvnqvytvqistksgdwkskcfyttdtecdltdeivkdvkqtylarvfsypagnvestgsageplyenspeftpyletnlgqptiqsfeqvgtkvnvtvedertlvrrnntflslrdvfgkdliytlyywkssssgkktaktntneflidvdkgenycfsvqavipsrtvnrkstdspvecmgqekgefre
[0671]
(人il-15)
[0672]
nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints
[0673]
编码il-7/il-15rαsu构建体的第二嵌合多肽(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:49)：
[0674]
(信号肽)
[0675]
atgggagtgaaagttctttttgcccttatttgtattgctgtggccgaggcc
[0676]
(人il-7)
[0677]
gattgtgatattgaaggtaaagatggcaaacaatatgagagtgttctaatggtcagcatcgatcaattattggacagcatgaaagaaattggtagcaattgcctgaataatgaatttaacttttttaaaagacatatctgtgatgctaataaggaaggtatgtttttattccgtgctgctcgcaagttgaggcaatttcttaaaatgaatagcactggtgattttgatctccacttattaaaagtttcagaaggcacaacaatactgttgaactgcactggccaggttaaaggaagaaaaccagctgccctgggtgaagcccaaccaacaaagagtttggaagaaaataaatctttaaaggaacagaaaaaactgaatgacttgtgtttcctaaagagactattacaagagataaaaacttgttggaataaaattttgatgggcactaaagaacac
[0678]
(人il-15rα寿司结构域)
[0679]
atcacgtgccctccccccatgtccgtggaacacgcagacatctgggtcaagagctacagcttgtactccagggagcggtacatttgtaactctggtttcaagcgtaaagccggcacgtccagcctgacggagtgcgtgttgaacaaggccacgaatgtcgcccactggacaacccccagtctcaaatgcattaga
[0680]
il-7/il-15rαsu构建体的第二嵌合多肽(包括信号肽序列)如下(seq id no:50)：
[0681]
(信号肽)
[0682]
mkwvtfisllflfssays
[0683]
(人il-7)
[0684]
dcdiegkdgkqyesvlmvsidqlldsmkeigsnclnnefnffkrhicdankegmflfraarklrqflkmnstgdfdlhllkvsegttillnctgqvkgrkpaalgeaqptksleenkslkeqkklndlcflkrllqeiktcwnkilmgtkeh
[0685]
(人组织因子219)
[0686]
sgttntvaaynltwkstnfktilewepkpvnqvytvqistksgdwkskcfyttdtecdltdeivkdvkqtylarvfsypagnvestgsageplyenspeftpyletnlgqptiqsfeqvgtkvnvtvedertlvrrnntflslrdvfgkdliytlyywkssssgkktaktntneflidvdkgenycfsvqavipsrtvnrkstdspvecmgqekgefre
[0687]
(人il-15)
[0688]
nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints
[0689]
由金唯智(genewiz)合成的编码il-21/tf/il-15构建体的第一嵌合多肽(包括前导序列)的核酸序列如下(seq id no:51)：
[0690]
(信号肽)
[0691]
atgggagtgaaagttctttttgcccttatttgtattgctgtggccgaggcc
[0692]
(人il-21片段)
[0693]
caaggtcaagatcgccacatgattagaatgcgtcaacttatagatattgttgatcagctgaaaaattat
gtgaatgacttggtccctgaatttctgccagctccagaagatgtagagacaaactgtgagtggtcagctttttcctgttttcagaaggcccaactaaagtcagcaaatacaggaaacaatgaaaggataatcaatgtatcaattaaaaagctgaagaggaaaccaccttccacaaatgcagggagaagacagaaacacagactaacatgcccttcatgtgattcttatgagaaaaaaccacccaaagaattcctagaaagattcaaatcacttctccaaaagatgattcatcagcatctgtcctctagaacacacggaagtgaagattcc
[0694]
(人组织因子219)
[0695]
tcaggcactacaaatactgtggcagcatataatttaacttggaaatcaactaatttcaagacaattttggagtgggaacccaaacccgtcaatcaagtctacactgttcaaataagcactaagtcaggagattggaaaagcaaatgcttttacacaacagacacagagtgtgacctcaccgacgagattgtgaaggatgtgaagcagacgtacttggcacgggtcttctcctacccggcagggaatgtggagagcaccggttctgctggggagcctctgtatgagaactccccagagttcacaccttacctggagacaaacctcggacagccaacaattcagagttttgaacaggtgggaacaaaagtgaatgtgaccgtagaagatgaacggactttagtcagaaggaacaacactttcctaagcctccgggatgtttttggcaaggacttaatttatacactttattattggaaatcttcaagttcaggaaagaaaacagccaaaacaaacactaatgagtttttgattgatgtggataaaggagaaaactactgtttcagtgttcaagcagtgattccctcccgaacagttaaccggaagagtacagacagcccggtagagtgtatgggccaggagaaaggggaattcagagaa
[0696]
(人il-15)
[0697]
aactgggtgaacgtcatcagcgatttaaagaagatcgaagatttaattcagtccatgcatatcgacgccactttatacacagaatccgacgtgcacccctcttgtaaggtgaccgccatgaaatgttttttactggagctgcaagttatctctttagagagcggagacgctagcatccacgacaccgtggagaatttaatcattttagccaataactctttatccagcaacggcaacgtgacagagtccggctgcaaggagtgcgaagagctggaggagaagaacatcaaggagtttctgcaatcctttgtgcacattgtccagatgttcatcaatacctcc
[0698]
包括前导序列的il-21/tf/il-15构建体的第一嵌合多肽如下(seq id no:52)：
[0699]
(信号肽)
[0700]
mgvkvlfaliciavaea
[0701]
(人il-21)
[0702]
qgqdrhmirmrqlidivdqlknyvndlvpeflpapedvetncewsafscfqkaqlksantgnneriinvsikklkrkppstnagrrqkhrltcpscdsyekkppkeflerfksllqkmihqhlssrthgseds
[0703]
(人组织因子219)
[0704]
sgttntvaaynltwkstnfktilewepkpvnqvytvqistksgdwkskcfyttdtecdltdeivkdvkqtylarvfsypagnvestgsageplyenspeftpyletnlgqptiqsfeqvgtkvnvtvedertlvrrnntflslrdvfgkdliytlyywkssssgkktaktntneflidvdkgenycfsvqavipsrtvnrkstdspvecmgqekgefre
[0705]
(人il-15)
[0706]
nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints
[0707]
由金唯智合成的编码il-21/il-15rαsu结构域的第二嵌合多肽(包括前导序列)的核酸序列如下(seq id no:53)：
[0708]
(信号肽)
[0709]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[0710]
(人il-21)
[0711]
cagggccaggacaggcacatgatccggatgaggcagctcatcgacatcgtcgaccagctgaagaactacgtgaacgacctggtgcccgagtttctgcctgcccccgaggacgtggagaccaactgcgagtggtccgccttctcctgctttcagaaggcccagctgaagtccgccaacaccggcaacaacgagcggatcatcaacgtgagcatcaagaagctgaagcggaagcctccctccacaaacgccggcaggaggcagaagcacaggctgacctgccccagctgtgactcctacgagaagaagccccccaaggagttcctggagaggttcaagtccctgctgcagaagatgatccatcagcacctgtcctccaggacccacggctccgaggactcc
[0712]
(人il-15rα寿司结构域)
[0713]
attacatgcccccctcccatgagcgtggagcacgccgacatctgggtgaagagctatagcctctacagccgggagaggtatatctgtaacagcggcttcaagaggaaggccggcaccagcagcctcaccgagtgcgtgctgaataaggctaccaacgtggctcactggacaacaccctctttaaagtgcatccgg
[0714]
il-21/il-15rα寿司结构域的第二嵌合多肽(包括前导序列)如下(seq id no:54)：
[0715]
(信号序列)
[0716]
mkwvtfisllflfssays
[0717]
(人il-21)
[0718]
qgqdrhmirmrqlidivdqlknyvndlvpeflpapedvetncewsafscfqkaqlksantgnneriinvsikklkrkppstnagrrqkhrltcpscdsyekkppkeflerfksllqkmihqhlssrthgseds
[0719]
(人il-15rα寿司结构域)
[0720]
itcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcir
[0721]
编码il-7/tf/il-15的第一嵌合多肽的核酸序列如下(seq id no:55)：
[0722]
(信号肽)
[0723]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[0724]
(人il-7片段)
[0725]
gattgcgacatcgagggcaaggacggcaagcagtacgagagcgtgctgatggtgtccatcgaccagctgctggacagcatgaaggagatcggctccaactgcctcaacaacgagttcaacttcttcaagcggcacatctgcgacgccaacaaggagggcatgttcctgttcagggccgccaggaaactgcggcagttcctgaagatgaactccaccggcgacttcgacctgcacctgctgaaggtgtccgagggcaccaccatcctgctgaactgcaccggacaggtgaagggccggaaacctgctgctctgggagaggcccaacccaccaagagcctggaggagaacaagtccctgaaggagcagaagaagctgaacgacctgtgcttcctgaagaggctgctgcaggagatcaagacctgctggaacaagatcctgatgggcaccaaggagcat
[0726]
(人组织因子219)
[0727]
agcggcacaaccaacacagtcgctgcctataacctcacttggaagagcaccaacttcaaaaccatcctcgaatgggaacccaaacccgttaaccaagtttacaccgtgcagatcagcaccaagtccggcgactggaagtccaaatgtttctataccaccgacaccgagtgcgatctcaccgatgagatcgtgaaagatgtgaaacagacctacctcgcccgggtgtttagctaccccgccggcaatgtggagagcactggttccgctggcgagcctttatacgagaacagccccgaatttaccccttacctcgagaccaatttaggacagcccaccatccaaagctttgagcaagttggcacaaaggtgaatgtgacagtggaggacgagcggactttagtgcggcggaacaacacctttctcagcctccgggatgtgttcggcaaagatttaatctacacactgtattactggaagtcctcttcctccggcaagaagacagctaaaaccaacacaaacgagtttttaatcgacgtggataaaggcgaaaactactgtttcagcgtgcaagctgtgatcccctcccggaccgtgaataggaaaagcac
cgatagccccgttgagtgcatgggccaagaaaagggcgagttccgggag
[0728]
(人il-15)
[0729]
aactgggtgaacgtcatcagcgatttaaagaagatcgaagatttaattcagtccatgcatatcgacgccactttatacacagaatccgacgtgcacccctcttgtaaggtgaccgccatgaaatgttttttactggagctgcaagttatctctttagagagcggagacgctagcatccacgacaccgtggagaatttaatcattttagccaataactctttatccagcaacggcaacgtgacagagtccggctgcaaggagtgcgaagagctggaggagaagaacatcaaggagtttctgcaatcctttgtgcacattgtccagatgttcatcaatacctcc
[0730]
il-7/tf/il-15的嵌合多肽(包括前导序列)如下(seq id no:56)：
[0731]
(信号肽)
[0732]
mkwvtfisllflfssays
[0733]
(人il-7)
[0734]
dcdiegkdgkqyesvlmvsidqlldsmkeigsnclnnefnffkrhicdankegmflfraarklrqflkmnstgdfdlhllkvsegttillnctgqvkgrkpaalgeaqptksleenkslkeqkklndlcflkrllqeiktcwnkilmgtkeh
[0735]
(人组织因子219)
[0736]
sgttntvaaynltwkstnfktilewepkpvnqvytvqistksgdwkskcfyttdtecdltdeivkdvkqtylarvfsypagnvestgsageplyenspeftpyletnlgqptiqsfeqvgtkvnvtvedertlvrrnntflslrdvfgkdliytlyywkssssgkktaktntneflidvdkgenycfsvqavipsrtvnrkstdspvecmgqekgefre
[0737]
(人il-15)
[0738]
nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints
[0739]
il-7/tf/il-15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:57)：
[0740]
(信号肽)
[0741]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[0742]
(人il-7)
[0743]
gattgcgacatcgagggcaaggacggcaagcagtacgagagcgtgctgatggtgtccatcgaccagctgctggacagcatgaaggagatcggctccaactgcctcaacaacgagttcaacttcttcaagcggcacatctgcgacgccaacaaggagggcatgttcctgttcagggccgccaggaaactgcggcagttcctgaagatgaactccaccggcgacttcgacctgcacctgctgaaggtgtccgagggcaccaccatcctgctgaactgcaccggacaggtgaagggccggaaacctgctgctctgggagaggcccaacccaccaagagcctggaggagaacaagtccctgaaggagcagaagaagctgaacgacctgtgcttcctgaagaggctgctgcaggagatcaagacctgctggaacaagatcctgatgggcaccaaggagcat
[0744]
(人组织因子219)
[0745]
agcggcacaaccaacacagtcgctgcctataacctcacttggaagagcaccaacttcaaaaccatcctcgaatgggaacccaaacccgttaaccaagtttacaccgtgcagatcagcaccaagtccggcgactggaagtccaaatgtttctataccaccgacaccgagtgcgatctcaccgatgagatcgtgaaagatgtgaaacagacctacctcgcccgggtgtttagctaccccgccggcaatgtggagagcactggttccgctggcgagcctttatacgagaacagccccgaatttaccccttacctcgagaccaatttaggacagcccaccatccaaagctttgagcaagttggcacaaaggtgaatgtgacagtggaggacgagcggactttagtgcggcggaacaacacctttctcagcctccgggatgtgttcggcaaagatttaa
tctacacactgtattactggaagtcctcttcctccggcaagaagacagctaaaaccaacacaaacgagtttttaatcgacgtggataaaggcgaaaactactgtttcagcgtgcaagctgtgatcccctcccggaccgtgaataggaaaagcaccgatagccccgttgagtgcatgggccaagaaaagggcgagttccgggag
[0746]
(人il-15)
[0747]
aactgggtgaacgtcatcagcgatttaaagaagatcgaagatttaattcagtccatgcatatcgacgccactttatacacagaatccgacgtgcacccctcttgtaaggtgaccgccatgaaatgttttttactggagctgcaagttatctctttagagagcggagacgctagcatccacgacaccgtggagaatttaatcattttagccaataactctttatccagcaacggcaacgtgacagagtccggctgcaaggagtgcgaagagctggaggagaagaacatcaaggagtttctgcaatcctttgtgcacattgtccagatgttcatcaatacctcc
[0748]
il-7/tf/il-15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(seq id no:58)：
[0749]
(信号肽)
[0750]
mkwvtfisllflfssays
[0751]
(人il-7)
[0752]
dcdiegkdgkqyesvlmvsidqlldsmkeigsnclnnefnffkrhicdankegmflfraarklrqflkmnstgdfdlhllkvsegttillnctgqvkgrkpaalgeaqptksleenkslkeqkklndlcflkrllqeiktcwnkilmgtkeh
[0753]
(人组织因子219)
[0754]
sgttntvaaynltwkstnfktilewepkpvnqvytvqistksgdwkskcfyttdtecdltdeivkdvkqtylarvfsypagnvestgsageplyenspeftpyletnlgqptiqsfeqvgtkvnvtvedertlvrrnntflslrdvfgkdliytlyywkssssgkktaktntneflidvdkgenycfsvqavipsrtvnrkstdspvecmgqekgefre
[0755]
(人il-15)
[0756]
nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints
[0757]
抗-cd16sscfv/il-15rαsu/il-21构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:59)：
[0758]
(信号肽)
[0759]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[0760]
((抗人cd16scfv)
[0761]
tccgagctgacccaggaccctgctgtgtccgtggctctgggccagaccgtgaggatcacctgccagggcgactccctgaggtcctactacgcctcctggtaccagcagaagcccggccaggctcctgtgctggtgatctacggcaagaacaacaggccctccggcatccctgacaggttctccggatcctcctccggcaacaccgcctccctgaccatcacaggcgctcaggccgaggacgaggctgactactactgcaactccagggactcctccggcaaccatgtggtgttcggcggcggcaccaagctgaccgtgggccatggcggcggcggctccggaggcggcggcagcggcggaggaggatccgaggtgcagctggtggagtccggaggaggagtggtgaggcctggaggctccctgaggctgagctgtgctgcctccggcttcaccttcgacgactacggcatgtcctgggtgaggcaggctcctggaaagggcctggagtgggtgtccggcatcaactggaacggcggatccaccggctacgccgattccgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaacgccaagaactccctgtacctgcagatgaactccctgagggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggggcaggtccctgctgttcgactactggggacagggcaccctggtgaccgtgtccagg
[0762]
(人il-15rα寿司结构域)
[0763]
attacatgcccccctcccatgagcgtggagcacgccgacatctgggtgaagagctatagcctctacagccgggagaggtatatctgtaacagcggcttcaagaggaaggccggcaccagcagcctcaccgagtgcgtgctgaataaggctaccaacgtggctcactggacaacaccctctttaaagtgcatccgg
[0764]
(人il-21)
[0765]
cagggccaggacaggcacatgatccggatgaggcagctcatcgacatcgtcgaccagctgaagaactacgtgaacgacctggtgcccgagtttctgcctgcccccgaggacgtggagaccaactgcgagtggtccgccttctcctgctttcagaaggcccagctgaagtccgccaacaccggcaacaacgagcggatcatcaacgtgagcatcaagaagctgaagcggaagcctccctccacaaacgccggcaggaggcagaagcacaggctgacctgccccagctgtgactcctacgagaagaagccccccaaggagttcctggagaggttcaagtccctgctgcagaagatgatccatcagcacctgtcctccaggacccacggctccgaggactcc
[0766]
抗cd16scfv/il-15rαsu/il-21构建体(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(seq id no:60)：
[0767]
(信号肽)
[0768]
mkwvtfisllflfssays
[0769]
(抗人cd16scfv)
[0770]
seltqdpavsvalgqtvritcqgdslrsyyaswyqqkpgqapvlviygknnrpsgipdrfsgsssgntasltitgaqaedeadyycnsrdssgnhvvfgggtkltvghggggsggggsggggsevqlvesgggvvrpggslrlscaasgftfddygmswvrqapgkglewvsginwnggstgyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycargrsllfdywgqgtlvtvsr
[0771]
(人il-15rα寿司结构域)
[0772]
itcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcir
[0773]
(人il-21)
[0774]
qgqdrhmirmrqlidivdqlknyvndlvpeflpapedvetncewsafscfqkaqlksantgnneriinvsikklkrkppstnagrrqkhrltcpscdsyekkppkeflerfksllqkmihqhlssrthgseds
[0775]
两个tgfβ受体ii/tf/il-15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:61)：
[0776]
(信号肽)
[0777]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[0778]
(两个人tgfβ受体ii片段)
[0779]
atccccccccatgtgcaaaagagcgtgaacaacgatatgatcgtgaccgacaacaacggcgccgtgaagtttccccagctctgcaagttctgcgatgtcaggttcagcacctgcgataatcagaagtcctgcatgtccaactgcagcatcacctccatctgcgagaagccccaagaagtgtgcgtggccgtgtggcggaaaaatgacgagaacatcaccctggagaccgtgtgtcacgaccccaagctcccttatcacgacttcattctggaggacgctgcctcccccaaatgcatcatgaaggagaagaagaagcccggagagaccttctttatgtgttcctgtagcagcgacgagtgtaacgacaacatcatcttcagcgaagagtacaacaccagcaaccctgatggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagtattcctccccacgtgcagaagagcgtgaataatgacatgatcgtgaccgataacaatggcgccgtgaaatttccccagctgtgcaaattctgcgatgtgaggttttccacctgcgacaaccagaagtcctgtatgagcaactgctccatcacctccatctgtgagaagcctcaggaggtgtgcgtggctgtctggcggaagaatgacgagaatatcaccctggaaaccgtctgccacgatcccaagctgccctaccacgatttcatcctggaagacgccgccagccctaagtgcatcatgaaagagaaa
aagaagcctggcgagacctttttcatgtgctcctgcagcagcgacgaatgcaacgacaatatcatctttagcgaggaatacaataccagcaaccccgac
[0780]
(人组织因子219)
[0781]
agcggcacaaccaacacagtcgctgcctataacctcacttggaagagcaccaacttcaaaaccatcctcgaatgggaacccaaacccgttaaccaagtttacaccgtgcagatcagcaccaagtccggcgactggaagtccaaatgtttctataccaccgacaccgagtgcgatctcaccgatgagatcgtgaaagatgtgaaacagacctacctcgcccgggtgtttagctaccccgccggcaatgtggagagcactggttccgctggcgagcctttatacgagaacagccccgaatttaccccttacctcgagaccaatttaggacagcccaccatccaaagctttgagcaagttggcacaaaggtgaatgtgacagtggaggacgagcggactttagtgcggcggaacaacacctttctcagcctccgggatgtgttcggcaaagatttaatctacacactgtattactggaagtcctcttcctccggcaagaagacagctaaaaccaacacaaacgagtttttaatcgacgtggataaaggcgaaaactactgtttcagcgtgcaagctgtgatcccctcccggaccgtgaataggaaaagcaccgatagccccgttgagtgcatgggccaagaaaagggcgagttccgggag
[0782]
(人il-15)
[0783]
aactgggtgaacgtcatcagcgatttaaagaagatcgaagatttaattcagtccatgcatatcgacgccactttatacacagaatccgacgtgcacccctcttgtaaggtgaccgccatgaaatgttttttactggagctgcaagttatctctttagagagcggagacgctagcatccacgacaccgtggagaatttaatcattttagccaataactctttatccagcaacggcaacgtgacagagtccggctgcaaggagtgcgaagagctggaggagaagaacatcaaggagtttctgcaatcctttgtgcacattgtccagatgttcatcaatacctcc
[0784]
tgfβ受体ii/tf/il-15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(seq id no:62)：
[0785]
(信号肽)
[0786]
mkwvtfisllflfssays
[0787]
(人tgfβ受体ii)
[0788]
ipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpdggggsggggsggggsipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpd
[0789]
(人组织因子219)
[0790]
sgttntvaaynltwkstnfktilewepkpvnqvytvqistksgdwkskcfyttdtecdltdeivkdvkqtylarvfsypagnvestgsageplyenspeftpyletnlgqptiqsfeqvgtkvnvtvedertlvrrnntflslrdvfgkdliytlyywkssssgkktaktntneflidvdkgenycfsvqavipsrtvnrkstdspvecmgqekgefre
[0791]
(人il-15)
[0792]
nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints
[0793]
抗cd16scfv/il-15rαsu/il-21构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:63)：
[0794]
(信号肽)
[0795]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[0796]
(抗人cd16scfv)
[0797]
tccgagctgacccaggaccctgctgtgtccgtggctctgggccagaccgtgaggatcacctgccagggcgactccctgaggtcctactacgcctcctggtaccagcagaagcccggccaggctcctgtgctggtgatctacggcaagaacaacaggccctccggcatccctgacaggttctccggatcctcctccggcaacaccgcctccctgaccatcacaggcgctcaggccgaggacgaggctgactactactgcaactccagggactcctccggcaaccatgtggtgttcggcggcggcaccaagctgaccgtgggccatggcggcggcggctccggaggcggcggcagcggcggaggaggatccgaggtgcagctggtggagtccggaggaggagtggtgaggcctggaggctccctgaggctgagctgtgctgcctccggcttcaccttcgacgactacggcatgtcctgggtgaggcaggctcctggaaagggcctggagtgggtgtccggcatcaactggaacggcggatccaccggctacgccgattccgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaacgccaagaactccctgtacctgcagatgaactccctgagggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggggcaggtccctgctgttcgactactggggacagggcaccctggtgaccgtgtccagg
[0798]
(人il-15rα寿司结构域)
[0799]
attacatgcccccctcccatgagcgtggagcacgccgacatctgggtgaagagctatagcctctacagccgggagaggtatatctgtaacagcggcttcaagaggaaggccggcaccagcagcctcaccgagtgcgtgctgaataaggctaccaacgtggctcactggacaacaccctctttaaagtgcatccgg
[0800]
(人il-21)
[0801]
cagggccaggacaggcacatgatccggatgaggcagctcatcgacatcgtcgaccagctgaagaactacgtgaacgacctggtgcccgagtttctgcctgcccccgaggacgtggagaccaactgcgagtggtccgccttctcctgctttcagaaggcccagctgaagtccgccaacaccggcaacaacgagcggatcatcaacgtgagcatcaagaagctgaagcggaagcctccctccacaaacgccggcaggaggcagaagcacaggctgacctgccccagctgtgactcctacgagaagaagccccccaaggagttcctggagaggttcaagtccctgctgcagaagatgatccatcagcacctgtcctccaggacccacggctccgaggactcc
[0802]
抗cd16scfv/il-15rαsu/il-21构建体(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(seq id no:64)：
[0803]
(信号肽)
[0804]
mkwvtfisllflfssays
[0805]
(抗人cd16scfv)
[0806]
seltqdpavsvalgqtvritcqgdslrsyyaswyqqkpgqapvlviygknnrpsgipdrfsgsssgntasltitgaqaedeadyycnsrdssgnhvvfgggtkltvghggggsggggsggggsevqlvesgggvvrpggslrlscaasgftfddygmswvrqapgkglewvsginwnggstgyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycargrsllfdywgqgtlvtvsr
[0807]
(人il-15rα寿司结构域)
[0808]
itcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcir
[0809]
(人il-21)
[0810]
qgqdrhmirmrqlidivdqlknyvndlvpeflpapedvetncewsafscfqkaqlksantgnneriinvsikklkrkppstnagrrqkhrltcpscdsyekkppkeflerfksllqkmihqhlssrthgseds
[0811]
7t15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:65)：
[0812]
(信号肽)
[0813]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[0814]
(人il7)
[0815]
gattgcgacatcgagggcaaggacggcaagcagtacgagagcgtgctgatggtgtccatcgaccagctgctggacagcatgaaggagatcggctccaactgcctcaacaacgagttcaacttcttcaagcggcacatctgcgacgccaacaaggagggcatgttcctgttcagggccgccaggaaactgcggcagttcctgaagatgaactccaccggcgacttcgacctgcacctgctgaaggtgtccgagggcaccaccatcctgctgaactgcaccggacaggtgaagggccggaaacctgctgctctgggagaggcccaacccaccaagagcctggaggagaacaagtccctgaaggagcagaagaagctgaacgacctgtgcttcctgaagaggctgctgcaggagatcaagacctgctggaacaagatcctgatgggcaccaaggagcat
[0816]
(人组织因子219)
[0817]
agcggcacaaccaacacagtcgctgcctataacctcacttggaagagcaccaacttcaaaaccatcctcgaatgggaacccaaacccgttaaccaagtttacaccgtgcagatcagcaccaagtccggcgactggaagtccaaatgtttctataccaccgacaccgagtgcgatctcaccgatgagatcgtgaaagatgtgaaacagacctacctcgcccgggtgtttagctaccccgccggcaatgtggagagcactggttccgctggcgagcctttatacgagaacagccccgaatttaccccttacctcgagaccaatttaggacagcccaccatccaaagctttgagcaagttggcacaaaggtgaatgtgacagtggaggacgagcggactttagtgcggcggaacaacacctttctcagcctccgggatgtgttcggcaaagatttaatctacacactgtattactggaagtcctcttcctccggcaagaagacagctaaaaccaacacaaacgagtttttaatcgacgtggataaaggcgaaaactactgtttcagcgtgcaagctgtgatcccctcccggaccgtgaataggaaaagcaccgatagccccgttgagtgcatgggccaagaaaagggcgagttccgggag
[0818]
(人il-15)
[0819]
aactgggtgaacgtcatcagcgatttaaagaagatcgaagatttaattcagtccatgcatatcgacgccactttatacacagaatccgacgtgcacccctcttgtaaggtgaccgccatgaaatgttttttactggagctgcaagttatctctttagagagcggagacgctagcatccacgacaccgtggagaatttaatcattttagccaataactctttatccagcaacggcaacgtgacagagtccggctgcaaggagtgcgaagagctggaggagaagaacatcaaggagtttctgcaatcctttgtgcacattgtccagatgttcatcaatacctcc
[0820]
7t15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(seq id no:66)：
[0821]
(信号肽)
[0822]
mkwvtfisllflfssays
[0823]
(人il7)
[0824]
dcdiegkdgkqyesvlmvsidqlldsmkeigsnclnnefnffkrhicdankegmflfraarklrqflkmnstgdfdlhllkvsegttillnctgqvkgrkpaalgeaqptksleenkslkeqkklndlcflkrllqeiktcwnkilmgtkeh
[0825]
(人组织因子219)
[0826]
sgttntvaaynltwkstnfktilewepkpvnqvytvqistksgdwkskcfyttdtecdltdeivkdvkqtylarvfsypagnvestgsageplyenspeftpyletnlgqptiqsfeqvgtkvnvtvedertlvrrnntflslrdvfgkdliytlyywkssssgkktaktntneflidvdkgenycfsvqavipsrtvnrkstdspvecmgqekgefre
[0827]
(人il-15)
[0828]
nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints
[0829]
7s构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:67)：
[0830]
(信号肽)
[0831]
atgggagtgaaagttctttttgcccttatttgtattgctgtggccgaggcc
[0832]
(人il7)
[0833]
gattgtgatattgaaggtaaagatggcaaacaatatgagagtgttctaatggtcagcatcgatcaattattggacagcatgaaagaaattggtagcaattgcctgaataatgaatttaacttttttaaaagacatatctgtgatgctaataaggaaggtatgtttttattccgtgctgctcgcaagttgaggcaatttcttaaaatgaatagcactggtgattttgatctccacttattaaaagtttcagaaggcacaacaatactgttgaactgcactggccaggttaaaggaagaaaaccagctgccctgggtgaagcccaaccaacaaagagtttggaagaaaataaatctttaaaggaacagaaaaaactgaatgacttgtgtttcctaaagagactattacaagagataaaaacttgttggaataaaattttgatgggcactaaagaacac
[0834]
(人il-15rα寿司结构域)
[0835]
atcacgtgccctccccccatgtccgtggaacacgcagacatctgggtcaagagctacagcttgtactccagggagcggtacatttgtaactctggtttcaagcgtaaagccggcacgtccagcctgacggagtgcgtgttgaacaaggccacgaatgtcgcccactggacaacccccagtctcaaatgcattaga
[0836]
7s融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(seq id no:68)：
[0837]
(信号肽)
[0838]
mgvkvlfaliciavaea
[0839]
(人il7)
[0840]
dcdiegkdgkqyesvlmvsidqlldsmkeigsnclnnefnffkrhicdankegmflfraarklrqflkmnstgdfdlhllkvsegttillnctgqvkgrkpaalgeaqptksleenkslkeqkklndlcflkrllqeiktcwnkilmgtkeh
[0841]
(人il-15rα寿司结构域)
[0842]
itcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcir
[0843]
两个tgfβ受体ii/tf/il-15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:69)：
[0844]
(信号肽)
[0845]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[0846]
(两个人tgfβ受体ii片段)
[0847]
atccccccccatgtgcaaaagagcgtgaacaacgatatgatcgtgaccgacaacaacggcgccgtgaagtttccccagctctgcaagttctgcgatgtcaggttcagcacctgcgataatcagaagtcctgcatgtccaactgcagcatcacctccatctgcgagaagccccaagaagtgtgcgtggccgtgtggcggaaaaatgacgagaacatcaccctggagaccgtgtgtcacgaccccaagctcccttatcacgacttcattctggaggacgctgcctcccccaaatgcatcatgaaggagaagaagaagcccggagagaccttctttatgtgttcctgtagcagcgacgagtgtaacgacaacatcatcttcagcgaagagtacaacaccagcaaccctgatggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagtattcctccccacgtgcagaagagcgtgaataatgacatgatcgtgaccgataacaatggcgccgtgaaatttccccagctgtgcaaattctgcgatgtgaggttttccacctgcgacaaccagaagtcctgtatgagcaactgctccatcacctccatctgtgagaagcctcaggaggtgtgcgtggctgtctggcggaagaatgacgagaatatcaccctggaaaccgtctgccacgatcccaagctgccctaccacgatttcatcctggaagacgccgccagccctaagtgcatcatgaaagagaaaaagaagcctggcgagacctttttcatgtgctcctgcagcagcgacgaatgcaacgacaatatcatctttagcgaggaatacaataccagcaaccccgac
[0848]
(人组织因子219)
[0849]
agcggcacaaccaacacagtcgctgcctataacctcacttggaagagcaccaacttcaaaaccatcctcgaatgggaacccaaacccgttaaccaagtttacaccgtgcagatcagcaccaagtccggcgactggaagtccaaatgtttctataccaccgacaccgagtgcgatctcaccgatgagatcgtgaaagatgtgaaacagacctacctcgcccgggtgtttagctaccccgccggcaatgtggagagcactggttccgctggcgagcctttatacgagaacagccccgaatttaccccttacctcgagaccaatttaggacagcccaccatccaaagctttgagcaagttggcacaaaggtgaatgtgacagtggaggacgagcggactttagtgcggcggaacaacacctttctcagcctccgggatgtgttcggcaaagatttaatctacacactgtattactggaagtcctcttcctccggcaagaagacagctaaaaccaacacaaacgagtttttaatcgacgtggataaaggcgaaaactactgtttcagcgtgcaagctgtgatcccctcccggaccgtgaataggaaaagcaccgatagccccgttgagtgcatgggccaagaaaagggcgagttccgggag
[0850]
(人il-15)
[0851]
aactgggtgaacgtcatcagcgatttaaagaagatcgaagatttaattcagtccatgcatatcgacgccactttatacacagaatccgacgtgcacccctcttgtaaggtgaccgccatgaaatgttttttactggagctgcaagttatctctttagagagcggagacgctagcatccacgacaccgtggagaatttaatcattttagccaataactctttatccagcaacggcaacgtgacagagtccggctgcaaggagtgcgaagagctggaggagaagaacatcaaggagtttctgcaatcctttgtgcacattgtccagatgttcatcaatacctcc
[0852]
tgfβ受体ii/tf/il-15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(seq id no:70)：
[0853]
(信号肽)
[0854]
mkwvtfisllflfssays
[0855]
(人tgfβ受体ii)
[0856]
ipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpdggggsggggsggggsipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpd
[0857]
(人组织因子219)
[0858]
sgttntvaaynltwkstnfktilewepkpvnqvytvqistksgdwkskcfyttdtecdltdeivkdvkqtylarvfsypagnvestgsageplyenspeftpyletnlgqptiqsfeqvgtkvnvtvedertlvrrnntflslrdvfgkdliytlyywkssssgkktaktntneflidvdkgenycfsvqavipsrtvnrkstdspvecmgqekgefre
[0859]
(人il-15)
[0860]
nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints
[0861]
tgfβ受体ii/il-15rαsu构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:71)：
[0862]
(信号肽)
[0863]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[0864]
(两个人tgfβ受体ii片段)
[0865]
atccccccccatgtgcaaaagagcgtgaacaacgatatgatcgtgaccgacaacaacggcgccgtgaagtttccccagctctgcaagttctgcgatgtcaggttcagcacctgcgataatcagaagtcctgcatgtccaactgcag
catcacctccatctgcgagaagccccaagaagtgtgcgtggccgtgtggcggaaaaatgacgagaacatcaccctggagaccgtgtgtcacgaccccaagctcccttatcacgacttcattctggaggacgctgcctcccccaaatgcatcatgaaggagaagaagaagcccggagagaccttctttatgtgttcctgtagcagcgacgagtgtaacgacaacatcatcttcagcgaagagtacaacaccagcaaccctgatggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagtattcctccccacgtgcagaagagcgtgaataatgacatgatcgtgaccgataacaatggcgccgtgaaatttccccagctgtgcaaattctgcgatgtgaggttttccacctgcgacaaccagaagtcctgtatgagcaactgctccatcacctccatctgtgagaagcctcaggaggtgtgcgtggctgtctggcggaagaatgacgagaatatcaccctggaaaccgtctgccacgatcccaagctgccctaccacgatttcatcctggaagacgccgccagccctaagtgcatcatgaaagagaaaaagaagcctggcgagacctttttcatgtgctcctgcagcagcgacgaatgcaacgacaatatcatctttagcgaggaatacaataccagcaaccccgac
[0866]
(人il-15rα寿司结构域)
[0867]
attacatgcccccctcccatgagcgtggagcacgccgacatctgggtgaagagctatagcctctacagccgggagaggtatatctgtaacagcggcttcaagaggaaggccggcaccagcagcctcaccgagtgcgtgctgaataaggctaccaacgtggctcactggacaacaccctctttaaagtgcatccgg
[0868]
两个tgfβ受体ii/il-15rαsu构建体(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(seq id no:72)：
[0869]
(信号肽)
[0870]
mkwvtfisllflfssays
[0871]
(两个人tgfβ受体ii细胞外结构域)
[0872]
ipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpdggggsggggsggggsipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpd
[0873]
(人il-15rα寿司结构域)
[0874]
itcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcir
[0875]
7t15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:73)：
[0876]
(信号肽)
[0877]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[0878]
(人il7)
[0879]
gattgcgacatcgagggcaaggacggcaagcagtacgagagcgtgctgatggtgtccatcgaccagctgctggacagcatgaaggagatcggctccaactgcctcaacaacgagttcaacttcttcaagcggcacatctgcgacgccaacaaggagggcatgttcctgttcagggccgccaggaaactgcggcagttcctgaagatgaactccaccggcgacttcgacctgcacctgctgaaggtgtccgagggcaccaccatcctgctgaactgcaccggacaggtgaagggccggaaacctgctgctctgggagaggcccaacccaccaagagcctggaggagaacaagtccctgaaggagcagaagaagctgaacgacctgtgcttcctgaagaggctgctgcaggagatcaagacctgctggaacaagatcctgatgggcaccaaggagcat
[0880]
(人组织因子219)
[0881]
agcggcacaaccaacacagtcgctgcctataacctcacttggaagagcaccaacttcaaaaccatcctcgaatgggaacccaaacccgttaaccaagtttacaccgtgcagatcagcaccaagtccggcgactggaagtccaaatg
tttctataccaccgacaccgagtgcgatctcaccgatgagatcgtgaaagatgtgaaacagacctacctcgcccgggtgtttagctaccccgccggcaatgtggagagcactggttccgctggcgagcctttatacgagaacagccccgaatttaccccttacctcgagaccaatttaggacagcccaccatccaaagctttgagcaagttggcacaaaggtgaatgtgacagtggaggacgagcggactttagtgcggcggaacaacacctttctcagcctccgggatgtgttcggcaaagatttaatctacacactgtattactggaagtcctcttcctccggcaagaagacagctaaaaccaacacaaacgagtttttaatcgacgtggataaaggcgaaaactactgtttcagcgtgcaagctgtgatcccctcccggaccgtgaataggaaaagcaccgatagccccgttgagtgcatgggccaagaaaagggcgagttccgggag
[0882]
(人il-15)
[0883]
aactgggtgaacgtcatcagcgatttaaagaagatcgaagatttaattcagtccatgcatatcgacgccactttatacacagaatccgacgtgcacccctcttgtaaggtgaccgccatgaaatgttttttactggagctgcaagttatctctttagagagcggagacgctagcatccacgacaccgtggagaatttaatcattttagccaataactctttatccagcaacggcaacgtgacagagtccggctgcaaggagtgcgaagagctggaggagaagaacatcaaggagtttctgcaatcctttgtgcacattgtccagatgttcatcaatacctcc
[0884]
7t15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(seq id no:74)：
[0885]
(信号肽)
[0886]
mkwvtfisllflfssays
[0887]
(人il7)
[0888]
dcdiegkdgkqyesvlmvsidqlldsmkeigsnclnnefnffkrhicdankegmflfraarklrqflkmnstgdfdlhllkvsegttillnctgqvkgrkpaalgeaqptksleenkslkeqkklndlcflkrllqeiktcwnkilmgtkeh
[0889]
(人组织因子219)
[0890]
sgttntvaaynltwkstnfktilewepkpvnqvytvqistksgdwkskcfyttdtecdltdeivkdvkqtylarvfsypagnvestgsageplyenspeftpyletnlgqptiqsfeqvgtkvnvtvedertlvrrnntflslrdvfgkdliytlyywkssssgkktaktntneflidvdkgenycfsvqavipsrtvnrkstdspvecmgqekgefre
[0891]
(人il-15)
[0892]
nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints
[0893]
以下显示21s137l的核酸和蛋白质序列。21s137l构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:75)：
[0894]
(信号肽)
[0895]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[0896]
(人il-21)
[0897]
cagggccaggacaggcacatgatccggatgaggcagctcatcgacatcgtcgaccagctgaagaactacgtgaacgacctggtgcccgagtttctgcctgcccccgaggacgtggagaccaactgcgagtggtccgccttctcctgctttcagaaggcccagctgaagtccgccaacaccggcaacaacgagcggatcatcaacgtgagcatcaagaagctgaagcggaagcctccctccacaaacgccggcaggaggcagaagcacaggctgacctgccccagctgtgactcctacgagaagaagccccccaaggagttcctggagaggttcaagtccctgctgcagaagatgatccatcagcacctgtcctccaggacccacggctccgaggactcc
[0898]
(人il-15rα寿司结构域)
[0899]
attacatgcccccctcccatgagcgtggagcacgccgacatctgggtgaagagctatagcctctacagccgggagaggtatatctgtaacagcggcttcaagaggaaggccggcaccagcagcctcaccgagtgcgtgctgaataaggctaccaacgtggctcactggacaacaccctctttaaagtgcatccgg
[0900]
((g4s)3接头)
[0901]
ggcggtggaggatccggaggaggtggctccggcggcggaggatct
[0902]
(人cd137l)
[0903]
cgcgagggtcccgagctttcgcccgacgatcccgccggcctcttggacctgcggcagggcatgtttgcgcagctggtggcccaaaatgttctgctgatcgatgggcccctgagctggtacagtgacccaggcctggcaggcgtgtccctgacggggggcctgagctacaaagaggacacgaaggagctggtggtggccaaggctggagtctactatgtcttctttcaactagagctgcggcgcgtggtggccggcgagggctcaggctccgtttcacttgcgctgcacctgcagccactgcgctctgctgctggggccgccgccctggctttgaccgtggacctgccacccgcctcctccgaggctcggaactcggccttcggtttccagggccgcttgctgcacctgagtgccggccagcgcctgggcgtccatcttcacactgaggccagggcacgccatgcctggcagcttacccagggcgccacagtcttgggactcttccgggtgacccccgaaatcccagccggactcccttcaccgaggtcggaa
[0904]
21s137l融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(seq id no:76)：
[0905]
(信号肽)
[0906]
mkwvtfisllflfssays
[0907]
(人il-21)
[0908]
qgqdrhmirmrqlidivdqlknyvndlvpeflpapedvetncewsafscfqkaqlksantgnneriinvsikklkrkppstnagrrqkhrltcpscdsyekkppkeflerfksllqkmihqhlssrthgseds
[0909]
(人il-15rα寿司结构域)
[0910]
itcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcir
[0911]
((g4s)3接头)
[0912]
ggggsggggsggggs
[0913]
(人cd137l)
[0914]
regpelspddpaglldlrqgmfaqlvaqnvllidgplswysdpglagvsltgglsykedtkelvvakagvyyvffqlelrrvvagegsgsvslalhlqplrsaagaaalaltvdlppassearnsafgfqgrllhlsagqrlgvhlhteararhawqltqgatvlglfrvtpeipaglpsprse
[0915]
7t15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:77)：
[0916]
(信号肽)
[0917]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[0918]
(人il7)
[0919]
gattgcgacatcgagggcaaggacggcaagcagtacgagagcgtgctgatggtgtccatcgaccagctgctggacagcatgaaggagatcggctccaactgcctcaacaacgagttcaacttcttcaagcggcacatctgcgacgccaacaaggagggcatgttcctgttcagggccgccaggaaactgcggcagttcctgaagatgaactccaccggcgacttcgacctgcacctgctgaaggtgtccgagggcaccaccatcctgctgaactgcaccggacaggtgaagggccggaaacctgctgctctgggagaggcccaacccaccaagagcctggaggagaacaagtccctgaaggagcagaagaagctgaacgacctgtgcttcctgaagaggctgctgcaggagatcaagacctgctggaacaagatcctgatgggcaccaaggagcat
[0920]
(人组织因子219)
[0921]
agcggcacaaccaacacagtcgctgcctataacctcacttggaagagcaccaacttcaaaaccatcctcgaatgggaacccaaacccgttaaccaagtttacaccgtgcagatcagcaccaagtccggcgactggaagtccaaatgtttctataccaccgacaccgagtgcgatctcaccgatgagatcgtgaaagatgtgaaacagacctacctcgcccgggtgtttagctaccccgccggcaatgtggagagcactggttccgctggcgagcctttatacgagaacagccccgaatttaccccttacctcgagaccaatttaggacagcccaccatccaaagctttgagcaagttggcacaaaggtgaatgtgacagtggaggacgagcggactttagtgcggcggaacaacacctttctcagcctccgggatgtgttcggcaaagatttaatctacacactgtattactggaagtcctcttcctccggcaagaagacagctaaaaccaacacaaacgagtttttaatcgacgtggataaaggcgaaaactactgtttcagcgtgcaagctgtgatcccctcccggaccgtgaataggaaaagcaccgatagccccgttgagtgcatgggccaagaaaagggcgagttccgggag
[0922]
(人il-15)
[0923]
aactgggtgaacgtcatcagcgatttaaagaagatcgaagatttaattcagtccatgcatatcgacgccactttatacacagaatccgacgtgcacccctcttgtaaggtgaccgccatgaaatgttttttactggagctgcaagttatctctttagagagcggagacgctagcatccacgacaccgtggagaatttaatcattttagccaataactctttatccagcaacggcaacgtgacagagtccggctgcaaggagtgcgaagagctggaggagaagaacatcaaggagtttctgcaatcctttgtgcacattgtccagatgttcatcaatacctcc
[0924]
7t15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(seq id no:78)：
[0925]
(信号肽)
[0926]
mkwvtfisllflfssays
[0927]
(人il7)
[0928]
dcdiegkdgkqyesvlmvsidqlldsmkeigsnclnnefnffkrhicdankegmflfraarklrqflkmnstgdfdlhllkvsegttillnctgqvkgrkpaalgeaqptksleenkslkeqkklndlcflkrllqeiktcwnkilmgtkeh
[0929]
(人组织因子219)
[0930]
sgttntvaaynltwkstnfktilewepkpvnqvytvqistksgdwkskcfyttdtecdltdeivkdvkqtylarvfsypagnvestgsageplyenspeftpyletnlgqptiqsfeqvgtkvnvtvedertlvrrnntflslrdvfgkdliytlyywkssssgkktaktntneflidvdkgenycfsvqavipsrtvnrkstdspvecmgqekgefre
[0931]
(人il-15)
[0932]
nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints
[0933]
以下显示21s137l(短版)的核酸和蛋白质序列。21s137l(短版)构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:79)：
[0934]
(信号肽)
[0935]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[0936]
(人il-21)
[0937]
cagggccaggacaggcacatgatccggatgaggcagctcatcgacatcgtcgaccagctgaagaactacgtgaacgacctggtgcccgagtttctgcctgcccccgaggacgtggagaccaactgcgagtggtccgccttctcctgctttcagaaggcccagctgaagtccgccaacaccggcaacaacgagcggatcatcaacgtgagcatcaagaagctgaagcggaagcctccctccacaaacgccggcaggaggcagaagcacaggctgacctgccccagctgtgactcctacgag
aagaagccccccaaggagttcctggagaggttcaagtccctgctgcagaagatgatccatcagcacctgtcctccaggacccacggctccgaggactcc
[0938]
(人il-15rα寿司结构域)
[0939]
attacatgcccccctcccatgagcgtggagcacgccgacatctgggtgaagagctatagcctctacagccgggagaggtatatctgtaacagcggcttcaagaggaaggccggcaccagcagcctcaccgagtgcgtgctgaataaggctaccaacgtggctcactggacaacaccctctttaaagtgcatccgg
[0940]
((g4s)3接头)
[0941]
ggcggtggaggatccggaggaggtggctccggcggcggaggatct
[0942]
(人cd137配体短版)
[0943]
gatcccgccggcctcttggacctgcggcagggcatgtttgcgcagctggtggcccaaaatgttctgctgatcgatgggcccctgagctggtacagtgacccaggcctggcaggcgtgtccctgacggggggcctgagctacaaagaggacacgaaggagctggtggtggccaaggctggagtctactatgtcttctttcaactagagctgcggcgcgtggtggccggcgagggctcaggctccgtttcacttgcgctgcacctgcagccactgcgctctgctgctggggccgccgccctggctttgaccgtggacctgccacccgcctcctccgaggctcggaactcggccttcggtttccagggccgcttgctgcacctgagtgccggccagcgcctgggcgtccatcttcacactgaggccagggcacgccatgcctggcagcttacccagggcgccacagtcttgggactcttccgggtgacccccgaaatc
[0944]
21s137l(短版)构建体(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(seq id no:80)：
[0945]
(信号肽)
[0946]
mkwvtfisllflfssays
[0947]
(人il-21)
[0948]
qgqdrhmirmrqlidivdqlknyvndlvpeflpapedvetncewsafscfqkaqlksantgnneriinvsikklkrkppstnagrrqkhrltcpscdsyekkppkeflerfksllqkmihqhlssrthgseds
[0949]
(人il-15rα寿司结构域)
[0950]
itcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcir
[0951]
((g4s)3接头)
[0952]
ggggsggggsggggs
[0953]
(人cd137配体短版)
[0954]
dpaglldlrqgmfaqlvaqnvllidgplswysdpglagvsltgglsykedtkelvvakagvyyvffqlelrrvvagegsgsvslalhlqplrsaagaaalaltvdlppassearnsafgfqgrllhlsagqrlgvhlhteararhawqltqgatvlglfrvtpei
[0955]
7t15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:81)：
[0956]
(信号肽)
[0957]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[0958]
(人il7)
[0959]
gattgcgacatcgagggcaaggacggcaagcagtacgagagcgtgctgatggtgtccatcgaccagctgctggacagcatgaaggagatcggctccaactgcctcaacaacgagttcaacttcttcaagcggcacatctgcgacgccaacaaggagggcatgttcctgttcagggccgccaggaaactgcggcagttcctgaagatgaactccaccggcgacttcgacctgcacctgctgaaggtgtccgagggcaccaccatcctgctgaactgcaccggacaggtgaagggccggaaacctgctgctctgggagaggcccaacccaccaagagcctggaggagaacaagtccctgaaggagcagaagaagctgaa
cgacctgtgcttcctgaagaggctgctgcaggagatcaagacctgctggaacaagatcctgatgggcaccaaggagcat
[0960]
(人组织因子219)
[0961]
agcggcacaaccaacacagtcgctgcctataacctcacttggaagagcaccaacttcaaaaccatcctcgaatgggaacccaaacccgttaaccaagtttacaccgtgcagatcagcaccaagtccggcgactggaagtccaaatgtttctataccaccgacaccgagtgcgatctcaccgatgagatcgtgaaagatgtgaaacagacctacctcgcccgggtgtttagctaccccgccggcaatgtggagagcactggttccgctggcgagcctttatacgagaacagccccgaatttaccccttacctcgagaccaatttaggacagcccaccatccaaagctttgagcaagttggcacaaaggtgaatgtgacagtggaggacgagcggactttagtgcggcggaacaacacctttctcagcctccgggatgtgttcggcaaagatttaatctacacactgtattactggaagtcctcttcctccggcaagaagacagctaaaaccaacacaaacgagtttttaatcgacgtggataaaggcgaaaactactgtttcagcgtgcaagctgtgatcccctcccggaccgtgaataggaaaagcaccgatagccccgttgagtgcatgggccaagaaaagggcgagttccgggag
[0962]
(人il-15)
[0963]
aactgggtgaacgtcatcagcgatttaaagaagatcgaagatttaattcagtccatgcatatcgacgccactttatacacagaatccgacgtgcacccctcttgtaaggtgaccgccatgaaatgttttttactggagctgcaagttatctctttagagagcggagacgctagcatccacgacaccgtggagaatttaatcattttagccaataactctttatccagcaacggcaacgtgacagagtccggctgcaaggagtgcgaagagctggaggagaagaacatcaaggagtttctgcaatcctttgtgcacattgtccagatgttcatcaatacctcc
[0964]
7t15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(seq id no:82)：
[0965]
(信号肽)
[0966]
mkwvtfisllflfssays
[0967]
(人il7)
[0968]
dcdiegkdgkqyesvlmvsidqlldsmkeigsnclnnefnffkrhicdankegmflfraarklrqflkmnstgdfdlhllkvsegttillnctgqvkgrkpaalgeaqptksleenkslkeqkklndlcflkrllqeiktcwnkilmgtkeh
[0969]
(人组织因子219)
[0970]
sgttntvaaynltwkstnfktilewepkpvnqvytvqistksgdwkskcfyttdtecdltdeivkdvkqtylarvfsypagnvestgsageplyenspeftpyletnlgqptiqsfeqvgtkvnvtvedertlvrrnntflslrdvfgkdliytlyywkssssgkktaktntneflidvdkgenycfsvqavipsrtvnrkstdspvecmgqekgefre
[0971]
(人il-15)
[0972]
nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints
[0973]
tgfrs构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:83)：
[0974]
(信号肽)
[0975]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[0976]
(人tgfβ受体ii片段)
[0977]
atccccccccatgtgcaaaagagcgtgaacaacgatatgatcgtgaccgacaacaacggcgccgtgaagtttccccagctctgcaagttctgcgatgtcaggttcagcacctgcgataatcagaagtcctgcatgtccaactgcagcatcacctccatctgcgagaagccccaagaagtgtgcgtggccgtgtggcggaaaaatgacgagaacatcaccctgg
agaccgtgtgtcacgaccccaagctcccttatcacgacttcattctggaggacgctgcctcccccaaatgcatcatgaaggagaagaagaagcccggagagaccttctttatgtgttcctgtagcagcgacgagtgtaacgacaacatcatcttcagcgaagagtacaacaccagcaaccctgatggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagtattcctccccacgtgcagaagagcgtgaataatgacatgatcgtgaccgataacaatggcgccgtgaaatttccccagctgtgcaaattctgcgatgtgaggttttccacctgcgacaaccagaagtcctgtatgagcaactgctccatcacctccatctgtgagaagcctcaggaggtgtgcgtggctgtctggcggaagaatgacgagaatatcaccctggaaaccgtctgccacgatcccaagctgccctaccacgatttcatcctggaagacgccgccagccctaagtgcatcatgaaagagaaaaagaagcctggcgagacctttttcatgtgctcctgcagcagcgacgaatgcaacgacaatatcatctttagcgaggaatacaataccagcaaccccgac
[0978]
(人il-15rα寿司结构域)
[0979]
attacatgcccccctcccatgagcgtggagcacgccgacatctgggtgaagagctatagcctctacagccgggagaggtatatctgtaacagcggcttcaagaggaaggccggcaccagcagcctcaccgagtgcgtgctgaataaggctaccaacgtggctcactggacaacaccctctttaaagtgcatccgg
[0980]
tgfrs融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(seq id no:84)：
[0981]
(信号肽)
[0982]
mkwvtfisllflfssays
[0983]
(人tgfβ受体ii)
[0984]
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[0985]
(人il-15rα寿司结构域)
[0986]
itcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcir
[0987]
tgfrt15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:85)：
[0988]
(信号肽)
[0989]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[0990]
(人tgfβ受体ii片段)
[0991]
atccccccccatgtgcaaaagagcgtgaacaacgatatgatcgtgaccgacaacaacggcgccgtgaagtttccccagctctgcaagttctgcgatgtcaggttcagcacctgcgataatcagaagtcctgcatgtccaactgcagcatcacctccatctgcgagaagccccaagaagtgtgcgtggccgtgtggcggaaaaatgacgagaacatcaccctggagaccgtgtgtcacgaccccaagctcccttatcacgacttcattctggaggacgctgcctcccccaaatgcatcatgaaggagaagaagaagcccggagagaccttctttatgtgttcctgtagcagcgacgagtgtaacgacaacatcatcttcagcgaagagtacaacaccagcaaccctgatggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagtattcctccccacgtgcagaagagcgtgaataatgacatgatcgtgaccgataacaatggcgccgtgaaatttccccagctgtgcaaattctgcgatgtgaggttttccacctgcgacaaccagaagtcctgtatgagcaactgctccatcacctccatctgtgagaagcctcaggaggtgtgcgtggctgtctggcggaagaatgacgagaatatcaccctggaaaccgtctgccacgatcccaagctgccctaccacgatttcatcctggaagacgccgccagccctaagtgcatcatgaaagagaaaaagaagcctggcgagacctttttcatgtgctcctgcagcagcgacgaatgcaacgacaatatcatctttagcgaggaatacaataccagcaaccccgac
[0992]
(人组织因子219)
[0993]
agcggcacaaccaacacagtcgctgcctataacctcacttggaagagcaccaacttcaaaaccatcctcgaatgggaacccaaacccgttaaccaagtttacaccgtgcagatcagcaccaagtccggcgactggaagtccaaatgtttctataccaccgacaccgagtgcgatctcaccgatgagatcgtgaaagatgtgaaacagacctacctcgcccgggtgtttagctaccccgccggcaatgtggagagcactggttccgctggcgagcctttatacgagaacagccccgaatttaccccttacctcgagaccaatttaggacagcccaccatccaaagctttgagcaagttggcacaaaggtgaatgtgacagtggaggacgagcggactttagtgcggcggaacaacacctttctcagcctccgggatgtgttcggcaaagatttaatctacacactgtattactggaagtcctcttcctccggcaagaagacagctaaaaccaacacaaacgagtttttaatcgacgtggataaaggcgaaaactactgtttcagcgtgcaagctgtgatcccctcccggaccgtgaataggaaaagcaccgatagccccgttgagtgcatgggccaagaaaagggcgagttccgggag
[0994]
(人il-15)
[0995]
aactgggtgaacgtcatcagcgatttaaagaagatcgaagatttaattcagtccatgcatatcgacgccactttatacacagaatccgacgtgcacccctcttgtaaggtgaccgccatgaaatgttttttactggagctgcaagttatctctttagagagcggagacgctagcatccacgacaccgtggagaatttaatcattttagccaataactctttatccagcaacggcaacgtgacagagtccggctgcaaggagtgcgaagagctggaggagaagaacatcaaggagtttctgcaatcctttgtgcacattgtccagatgttcatcaatacctcc
[0996]
tgfrt15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(seq id no:86)：
[0997]
(信号肽)
[0998]
mkwvtfisllflfssays
[0999]
(人tgfβ受体ii)
[1000]
ipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpdggggsggggsggggsipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpd
[1001]
(人组织因子219)
[1002]
sgttntvaaynltwkstnfktilewepkpvnqvytvqistksgdwkskcfyttdtecdltdeivkdvkqtylarvfsypagnvestgsageplyenspeftpyletnlgqptiqsfeqvgtkvnvtvedertlvrrnntflslrdvfgkdliytlyywkssssgkktaktntneflidvdkgenycfsvqavipsrtvnrkstdspvecmgqekgefre
[1003]
(人il-15)
[1004]
nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints
[1005]
以下显示21s137l的核酸和蛋白质序列。21s137l构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:87)：
[1006]
(信号肽)
[1007]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[1008]
(人il-21)
[1009]
cagggccaggacaggcacatgatccggatgaggcagctcatcgacatcgtcgaccagctgaagaactacgtgaacgacctggtgcccgagtttctgcctgcccccgaggacgtggagaccaactgcgagtggtccgccttctcctgctttcagaaggcccagctgaagtccgccaacaccggcaacaacgagcggatcatcaacgtgagcatcaagaagctga
agcggaagcctccctccacaaacgccggcaggaggcagaagcacaggctgacctgccccagctgtgactcctacgagaagaagccccccaaggagttcctggagaggttcaagtccctgctgcagaagatgatccatcagcacctgtcctccaggacccacggctccgaggactcc
[1010]
(人il-15rα寿司结构域)
[1011]
attacatgcccccctcccatgagcgtggagcacgccgacatctgggtgaagagctatagcctctacagccgggagaggtatatctgtaacagcggcttcaagaggaaggccggcaccagcagcctcaccgagtgcgtgctgaataaggctaccaacgtggctcactggacaacaccctctttaaagtgcatccgg
[1012]
((g4s)3接头)
[1013]
ggcggtggaggatccggaggaggtggctccggcggcggaggatct
[1014]
(人cd137l)
[1015]
cgcgagggtcccgagctttcgcccgacgatcccgccggcctcttggacctgcggcagggcatgtttgcgcagctggtggcccaaaatgttctgctgatcgatgggcccctgagctggtacagtgacccaggcctggcaggcgtgtccctgacggggggcctgagctacaaagaggacacgaaggagctggtggtggccaaggctggagtctactatgtcttctttcaactagagctgcggcgcgtggtggccggcgagggctcaggctccgtttcacttgcgctgcacctgcagccactgcgctctgctgctggggccgccgccctggctttgaccgtggacctgccacccgcctcctccgaggctcggaactcggccttcggtttccagggccgcttgctgcacctgagtgccggccagcgcctgggcgtccatcttcacactgaggccagggcacgccatgcctggcagcttacccagggcgccacagtcttgggactcttccgggtgacccccgaaatcccagccggactcccttcaccgaggtcggaa
[1016]
21s137l融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(seq id no:88)：
[1017]
(信号肽)
[1018]
mkwvtfisllflfssays
[1019]
(人il-21)
[1020]
qgqdrhmirmrqlidivdqlknyvndlvpeflpapedvetncewsafscfqkaqlksantgnneriinvsikklkrkppstnagrrqkhrltcpscdsyekkppkeflerfksllqkmihqhlssrthgseds
[1021]
(人il-15rα寿司结构域)
[1022]
itcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcir
[1023]
((g4s)3接头)
[1024]
ggggsggggsggggs
[1025]
(人cd137l)
[1026]
regpelspddpaglldlrqgmfaqlvaqnvllidgplswysdpglagvsltgglsykedtkelvvakagvyyvffqlelrrvvagegsgsvslalhlqplrsaagaaalaltvdlppassearnsafgfqgrllhlsagqrlgvhlhteararhawqltqgatvlglfrvtpeipaglpsprse
[1027]
tgfrt15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:89)：
[1028]
(信号肽)
[1029]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[1030]
(人tgfβ受体ii片段)
[1031]
atccccccccatgtgcaaaagagcgtgaacaacgatatgatcgtgaccgacaacaacggcgccgtgaagtttccccagctctgcaagttctgcgatgtcaggttcagcacctgcgataatcagaagtcctgcatgtccaactgcagcatcacctccatctgcgagaagccccaagaagtgtgcgtggccgtgtggcggaaaaatgacgagaacatcaccctgg
agaccgtgtgtcacgaccccaagctcccttatcacgacttcattctggaggacgctgcctcccccaaatgcatcatgaaggagaagaagaagcccggagagaccttctttatgtgttcctgtagcagcgacgagtgtaacgacaacatcatcttcagcgaagagtacaacaccagcaaccctgatggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagtattcctccccacgtgcagaagagcgtgaataatgacatgatcgtgaccgataacaatggcgccgtgaaatttccccagctgtgcaaattctgcgatgtgaggttttccacctgcgacaaccagaagtcctgtatgagcaactgctccatcacctccatctgtgagaagcctcaggaggtgtgcgtggctgtctggcggaagaatgacgagaatatcaccctggaaaccgtctgccacgatcccaagctgccctaccacgatttcatcctggaagacgccgccagccctaagtgcatcatgaaagagaaaaagaagcctggcgagacctttttcatgtgctcctgcagcagcgacgaatgcaacgacaatatcatctttagcgaggaatacaataccagcaaccccgac
[1032]
(人组织因子219)
[1033]
agcggcacaaccaacacagtcgctgcctataacctcacttggaagagcaccaacttcaaaaccatcctcgaatgggaacccaaacccgttaaccaagtttacaccgtgcagatcagcaccaagtccggcgactggaagtccaaatgtttctataccaccgacaccgagtgcgatctcaccgatgagatcgtgaaagatgtgaaacagacctacctcgcccgggtgtttagctaccccgccggcaatgtggagagcactggttccgctggcgagcctttatacgagaacagccccgaatttaccccttacctcgagaccaatttaggacagcccaccatccaaagctttgagcaagttggcacaaaggtgaatgtgacagtggaggacgagcggactttagtgcggcggaacaacacctttctcagcctccgggatgtgttcggcaaagatttaatctacacactgtattactggaagtcctcttcctccggcaagaagacagctaaaaccaacacaaacgagtttttaatcgacgtggataaaggcgaaaactactgtttcagcgtgcaagctgtgatcccctcccggaccgtgaataggaaaagcaccgatagccccgttgagtgcatgggccaagaaaagggcgagttccgggag
[1034]
(人il-15)
[1035]
aactgggtgaacgtcatcagcgatttaaagaagatcgaagatttaattcagtccatgcatatcgacgccactttatacacagaatccgacgtgcacccctcttgtaaggtgaccgccatgaaatgttttttactggagctgcaagttatctctttagagagcggagacgctagcatccacgacaccgtggagaatttaatcattttagccaataactctttatccagcaacggcaacgtgacagagtccggctgcaaggagtgcgaagagctggaggagaagaacatcaaggagtttctgcaatcctttgtgcacattgtccagatgttcatcaatacctcc
[1036]
tgfrt15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(seq id no:90)：
[1037]
(信号肽)
[1038]
mkwvtfisllflfssays
[1039]
(人tgfβ受体ii)
[1040]
ipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpdggggsggggsggggsipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpd
[1041]
(人组织因子219)
[1042]
sgttntvaaynltwkstnfktilewepkpvnqvytvqistksgdwkskcfyttdtecdltdeivkdvkqtylarvfsypagnvestgsageplyenspeftpyletnlgqptiqsfeqvgtkvnvtvedertlvrrnntflslrdvfgkdliytlyywkssssgkktaktntneflidvdkgenycfsvqavipsrtvnrkstdspvecmgqekgefre
[1043]
(人il-15)
[1044]
nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliil
annslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints
[1045]
tgfrs21构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:91)：
[1046]
(信号肽)
[1047]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[1048]
(人tgfβ受体ii片段)
[1049]
atccccccccatgtgcaaaagagcgtgaacaacgatatgatcgtgaccgacaacaacggcgccgtgaagtttccccagctctgcaagttctgcgatgtcaggttcagcacctgcgataatcagaagtcctgcatgtccaactgcagcatcacctccatctgcgagaagccccaagaagtgtgcgtggccgtgtggcggaaaaatgacgagaacatcaccctggagaccgtgtgtcacgaccccaagctcccttatcacgacttcattctggaggacgctgcctcccccaaatgcatcatgaaggagaagaagaagcccggagagaccttctttatgtgttcctgtagcagcgacgagtgtaacgacaacatcatcttcagcgaagagtacaacaccagcaaccctgatggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagtattcctccccacgtgcagaagagcgtgaataatgacatgatcgtgaccgataacaatggcgccgtgaaatttccccagctgtgcaaattctgcgatgtgaggttttccacctgcgacaaccagaagtcctgtatgagcaactgctccatcacctccatctgtgagaagcctcaggaggtgtgcgtggctgtctggcggaagaatgacgagaatatcaccctggaaaccgtctgccacgatcccaagctgccctaccacgatttcatcctggaagacgccgccagccctaagtgcatcatgaaagagaaaaagaagcctggcgagacctttttcatgtgctcctgcagcagcgacgaatgcaacgacaatatcatctttagcgaggaatacaataccagcaaccccgac
[1050]
(人il-15rα寿司结构域)
[1051]
attacatgcccccctcccatgagcgtggagcacgccgacatctgggtgaagagctatagcctctacagccgggagaggtatatctgtaacagcggcttcaagaggaaggccggcaccagcagcctcaccgagtgcgtgctgaataaggctaccaacgtggctcactggacaacaccctctttaaagtgcatccgg
[1052]
(人il-21)
[1053]
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[1054]
tgfrs21融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(seq id no:92)：
[1055]
(信号肽)
[1056]
mkwvtfisllflfssays
[1057]
(人tgfβ受体ii)
[1058]
ipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpdggggsggggsggggsipphvqksvnndmivtdnngavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpd
[1059]
(人il-15rα寿司结构域)
[1060]
itcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcir
[1061]
(人il-21)
[1062]
qgqdrhmirmrqlidivdqlknyvndlvpeflpapedvetncewsafscfqkaqlksantgnneriinvsikklkrkppstnagrrqkhrltcpscdsyekkppkeflerfksllqkmihqhlssrthgseds
[1063]
tgfrt15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:93)：
[1064]
(信号肽)
[1065]
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
[1066]
(人tgfβ受体ii片段)
[1067]
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[1068]
(人组织因子219)
[1069]
agcggcacaaccaacacagtcgctgcctataacctcacttggaagagcaccaacttcaaaaccatcctcgaatgggaacccaaacccgttaaccaagtttacaccgtgcagatcagcaccaagtccggcgactggaagtccaaatgtttctataccaccgacaccgagtgcgatctcaccgatgagatcgtgaaagatgtgaaacagacctacctcgcccgggtgtttagctaccccgccggcaatgtggagagcactggttccgctggcgagcctttatacgagaacagccccgaatttaccccttacctcgagaccaatttaggacagcccaccatccaaagctttgagcaagttggcacaaaggtgaatgtgacagtggaggacgagcggactttagtgcggcggaacaacacctttctcagcctccgggatgtgttcggcaaagatttaatctacacactgtattactggaagtcctcttcctccggcaagaagacagctaaaaccaacacaaacgagtttttaatcgacgtggataaaggcgaaaactactgtttcagcgtgcaagctgtgatcccctcccggaccgtgaataggaaaagcaccgatagccccgttgagtgcatgggccaagaaaagggcgagttccgggag
[1070]
(人il-15)
[1071]
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[1072]
tgfrt15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(seq id no:94)：
[1073]
(信号肽)
[1074]
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[1075]
(人tgfβ受体ii)
[1076]
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[1077]
(人组织因子219)
[1078]
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[1079]
(人il-15)
[1080]
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[1081]
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[1082]
(信号肽)
[1083]
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[1084]
(人tgfβ受体ii片段)
[1085]
atccccccccatgtgcaaaagagcgtgaacaacgatatgatcgtgaccgacaacaacggcgccgtgaagtttccccagctctgcaagttctgcgatgtcaggttcagcacctgcgataatcagaagtcctgcatgtccaactgcagcatcacctccatctgcgagaagccccaagaagtgtgcgtggccgtgtggcggaaaaatgacgagaacatcaccctggagaccgtgtgtcacgaccccaagctcccttatcacgacttcattctggaggacgctgcctcccccaaatgcatcatgaaggagaagaagaagcccggagagaccttctttatgtgttcctgtagcagcgacgagtgtaacgacaacatcatcttcagcgaagagtacaacaccagcaaccctgatggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagtattcctccccacgtgcagaagagcgtgaataatgacatgatcgtgaccgataacaatggcgccgtgaaatttccccagctgtgcaaattctgcgatgtgaggttttccacctgcgacaaccagaagtcctgtatgagcaactgctccatcacctccatctgtgagaagcctcaggaggtgtgcgtggctgtctggcggaagaatgacgagaatatcaccctggaaaccgtctgccacgatcccaagctgccctaccacgatttcatcctggaagacgccgccagccctaagtgcatcatgaaagagaaaaagaagcctggcgagacctttttcatgtgctcctgcagcagcgacgaatgcaacgacaatatcatctttagcgaggaatacaataccagcaaccccgac
[1086]
(人il-15rα寿司结构域)
[1087]
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[1088]
(抗人cd16scfv)
[1089]
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[1090]
tgfrs16融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(seq id no:96)：
[1091]
(信号肽)
[1092]
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[1093]
(人tgfβ受体ii)
[1094]
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[1095]
(人il-15rα寿司结构域)
[1096]
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[1097]
(抗人cd16scfv)
[1098]
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[1099]
tgfrt15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(seq id no:97)：
[1100]
(信号肽)
[1101]
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[1102]
(人tgfβ受体ii片段)
[1103]
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[1104]
(人组织因子219)
[1105]
agcggcacaaccaacacagtcgctgcctataacctcacttggaagagcaccaacttcaaaaccatcctcgaatgggaacccaaacccgttaaccaagtttacaccgtgcagatcagcaccaagtccggcgactggaagtccaaatgtttctataccaccgacaccgagtgcgatctcaccgatgagatcgtgaaagatgtgaaacagacctacctcgcccgggtgtttagctaccccgccggcaatgtggagagcactggttccgctggcgagcctttatacgagaacagccccgaatttaccccttacctcgagaccaatttaggacagcccaccatccaaagctttgagcaagttggcacaaaggtgaatgtgac
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[1106]
(人il-15)
[1107]
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[1108]
tgfrt15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(seq id no:98)：
[1109]
(信号肽)
[1110]
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[1111]
(人tgfβ受体ii)
[1112]
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[1113]
(人组织因子219)
[1114]
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[1115]
(人il-15)
[1116]
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[1117]
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[1118]
(信号肽)
[1119]
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[1120]
(人tgfβ受体ii片段)
[1121]
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aagaagcctggcgagacctttttcatgtgctcctgcagcagcgacgaatgcaacgacaatatcatctttagcgaggaatacaataccagcaaccccgac
[1122]
(人il-15rα寿司结构域)
[1123]
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[1124]
((g4s)3接头)
[1125]
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[1126]
(人cd137l)
[1127]
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[1128]
tgfrs137l融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(seq id no:100)：
[1129]
(信号肽)
[1130]
mkwvtfisllflfssays
[1131]
(人tgfβ受体ii)
[1132]
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[1133]
(人il-15rα寿司结构域)
[1134]
itcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcir
[1135]
((g4s)3接头)
[1136]
ggggsggggsggggs
[1137]
(人cd137l)
[1138]
regpelspddpaglldlrqgmfaqlvaqnvllidgplswysdpglagvsltgglsykedtkelvvakagvyyvffqlelrrvvagegsgsvslalhlqplrsaagaaalaltvdlppassearnsafgfqgrllhlsagqrlgvhlhteararhawqltqgatvlglfrvtpeipaglpsprse
[1139]
组合物/试剂盒
[1140]
本文还提供包括本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的组合物。本文还提供包括本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的色谱柱。本文还提供包括本文描述的亲和色谱树脂或色谱柱中的任一种的试剂盒。本文描述的试剂盒中的任一种的一些实施例另外包括用于执行本文描述的方法中的任一种的说明书。
[1141]
实例
[1142]
实例1：cnbr活化的琼脂糖凝胶与nhs琼脂糖凝胶的比较
[1143]
用于偶联蛋白质的固体载体材料可含有不同的活化基团或使用不同的化学反应。因此，评估用于抗组织因子抗体偶联的两种不同固体载体材料，以查看哪一种是用于高产量回收含有人组织因子(tf)的蛋白质(例如，本文描述的单链或多链嵌合蛋白中的任一种)的更好的基础树脂。
[1144]
使用来自通用电气医疗集团(ge healthcare)的nhs活化的琼脂糖凝胶4fast flow树脂和cnbr活化的琼脂糖凝胶4fast flow树脂产生两种抗组织因子亲和柱。这些实验中使用的抗组织因子包括包含seq id no:7的重链可变结构域和包含seq id no:8的轻链可变结构域。
[1145]
对于相同量的每种树脂，根据制造商的说明书在相同条件下缀合相同量的抗组织因子抗体。然后将两种抗组织因子亲和色谱树脂装入两个柱中，并且使用18t15-12s收获物来评估产量回收和性能。当将相同量的18t15-12s装载到每个抗组织因子亲和色谱柱上时，与抗组织因子-nhs琼脂糖凝胶柱(nb#07，pg#08-09)相比，抗组织因子cnbr-琼脂糖凝胶柱在洗脱峰中产生的18t15-12s高出50％(6mg对4mg)(参见表1)。
[1146]
表1.cnbr活化的琼脂糖凝胶与nhs琼脂糖凝胶的比较
[1147][1148]
实例2：洗脱条件
[1149]
来自1.6cm
×
3.4cm(6.83ml cv)抗组织因子cnbr-琼脂糖凝胶亲和柱的18t15-12s洗脱曲线在图2中示出，所述柱用5cv磷酸盐缓冲盐水平衡、用18t15-12s装载、用7cv磷酸盐缓冲盐水洗涤并且用ph为2.9的6cv的0.1m乙酸洗脱。图2中的所得色谱图示出使用0.1m乙酸的洗脱产生具有最小拖尾的尖锐蛋白质峰。鉴于这些数据，选择0.1m乙酸作为抗组织因子亲和色谱树脂的有用洗脱缓冲液。
[1150]
实例3：靶蛋白质的偶联密度和结合能力
[1151]
为了评估抗组织因子亲和柱的结合能力，使用cnbr-琼脂糖凝胶制备含有不同偶联密度的抗组织因子的树脂，并且然后装载18t15-12s以生成产量回收数据。图3表示来自许多不同树脂制备批次的历史数据，其示出结合能力随着与cnbr活化的琼脂糖凝胶树脂缀合的抗组织因子的量增加而增加。这种增加的结合能力在大约9mg抗组织因子/ml cnbr活化的琼脂糖凝胶树脂时开始趋于平稳。
[1152]
实例4：偶联时间和混合方法
[1153]
针对抗组织因子偶联条件评估不同的混合方法和缀合时间。2-4小时对过夜缀合时间的偶联没有观察到差异。数据在下表2中表示。此外，摇杆对叶轮混合方法没有观察到差异。
[1154]
表2.历史树脂制备数据
naoh、1m nacl不再用作卫生溶液。还测试ph为5.0的120mm磷酸、167mm乙酸、2.2％苯甲醇的商业溶液作为可以的消毒缓冲液。尽管ph为5.0的120mm磷酸、167mm乙酸、2.2％苯甲醇产生良好的柱稳定性，但由于其与塑料容器的相互作用而被放弃作为消毒策略。然后，将ph为5.0的50mm柠檬酸盐、2％苯甲醇以15分钟接触时间评估为卫生溶液。结果指示柱结合能力没有损失。因此，选择ph为5.0的50mm柠檬酸盐、2％苯甲醇作为抗组织因子亲和色谱柱的卫生溶液。
[1166]
还执行研究以确定是否发生从一次运行到下一次运行的装载产品的产品携带。这是通过以下来完成的：用5cv磷酸盐缓冲盐水平衡2.6cm
×
9.5cm(50.41ml cv)抗组织因子-cnbr琼脂糖凝胶柱、将18t15-12s装载到柱上、用5cv的pbs洗涤、用ph为5.0的5cv的0.1m柠檬酸盐洗涤、用ph为2.9的0.1m乙酸洗脱、用ph为2.5的4cv的0.1m甘氨酸汽提、用4cv的磷酸盐缓冲盐水中和并且用7cv的20％乙醇储存。然后重复相同的过程，但不是装载18t15-12s，而是用磷酸盐缓冲盐水装载柱，并且通过elisa分析洗脱池中残留的18t15-12s在下一次运行的洗脱中检测到最小量-1.162μg/ml 18t15-12s。
[1167]
使用上面列出的相同纯化过程，通过elisa测试来自过程演示运行的洗脱液的残留抗组织因子抗体，以评估柱的稳定性，并且验证在处理期间从柱中浸出到洗脱池的抗体量最小。在洗脱液中检测到的量可忽略不计，即17ppm。
[1168]
实例8：tf融合蛋白和tf融合蛋白复合物的实例
[1169]
已使用本文提供的抗组织因子cnbr琼脂糖凝胶亲和色谱树脂成功纯化包括可溶性组织因子结构域的各种不同的单链和多链嵌合多肽。已使用本文提供的抗组织因子cnbr琼脂糖凝胶亲和色谱树脂成功纯化的多链嵌合多肽包括18t15-12s、7t15-21s、tgfrt15-tgfrs、7t15-21s137l、21t15-tgfrs、tgfrt15-21s137l、tgfrt15-tgfrs137l、tgfrt15-tgfrs21、tgfrt15-tgfrs16、7t15-tgfrs、21t15-7s、18t15-12s16、7t15-16s21、tgfrt15-16s21和7t15-7s。已使用本文描述的抗组织因子cnbr琼脂糖凝胶亲和色谱树脂成功纯化的单链嵌合多肽为2t2、3t28和15t15。
[1170]
对通过抗组织因子-cnbr琼脂糖凝胶柱纯化的18t15-12s融合蛋白产品执行初步稳定性研究，并且然后执行后续的单元操作(如图1中所概述)。所得制造的18t15-12s稳定长达5周(表4)。
[1171]
表4.在2-8℃、25℃和37℃下孵育的18t15-12s的稳定性数据，并且然后通过hplc-sec分析1周至长达5周的时间点。
[1172][1173]
实例9：tgfrt15-tgfrs和2t2的纯化
[1174]
使用如本文描述的亲和色谱树脂(抗组织因子cnbr琼脂糖凝胶亲和色谱树脂)纯
化tgfrt15-tgfrs和2t2的条件。通常，抗组织因子cnbr琼脂糖凝胶亲和色谱树脂如先前所述制备。然后将抗组织因子cnbr琼脂糖凝胶亲和色谱树脂装入柱中，并且将含有tgfrt15-tgfrs或2t2的澄清细胞收获物装载到已用4柱体积(cv)的pbs平衡的柱上。在样品装载后，用5cv的pbs和ph为5.0的5cv的0.1m柠檬酸钠洗涤柱。然后用ph为2.9的3-4cv的0.1m乙酸洗脱靶蛋白质(tgfrt15-tgfrs或2t2)。如果蛋白质材料用于研究目的，那么用1m tris将tgfrt15-tgfrs或2t2的洗脱蛋白质峰调节至中性ph(7-8)，如果蛋白质材料用于临床研究，那么用1m柠檬酸调节至ph 3.6，随后在室温下在此低ph下孵育1小时。低ph孵育用于灭活细胞培养收获物中可潜在存在的病毒。在低ph孵育后，然后添加1m tris以将tgfrt15-tgfrs的ph调节至6.0，或将2t2的ph调节至5.0，随后进行深层过滤以去除或减少与产品或过程相关的蛋白质污染物。在蛋白质洗脱后，如实例7中所述将柱汽提并且储存。
[1175]
图9和图10中分别示出了示出tgfrt15-tgfrs和2t2的洗脱的色谱图。