一种抗菌肽菌种培养基配方及其制备方法与流程

1.本发明涉及抗菌肽技术领域，尤其涉及一种抗菌肽菌种培养基配方及其制备方法。


背景技术：

2.抗菌肽原指昆虫体内经诱导而产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，分子量在2000～7000左右，由20～60个氨基酸残基组成，这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。
3.抗菌肽依其结构可分为多种类型，可将其分为5类：单链无半胱氨酸残基的α-螺旋，或由无规卷曲连接的两段α-螺旋组成的肽；富含某些氨基酸残基但不含半胱氨酸残基的抗菌肽；含1个二硫键的抗菌多肽；有2个或2个以上二硫键、具有β-折叠结构的抗菌肽；由其它已知功能的较大的多肽衍生而来的具有抗菌活性的肽。
4.按照抗菌肽的来源分类，可将其分为6类：昆虫抗菌肽；哺乳动物抗菌肽；两栖动物抗菌肽，两栖类动物裸露的具多种功能，在皮肤的分泌物中存在的大量皮肤活性肽具有多样的生物学活性，其中大多数多肽类物质均具有一定的抗微生物活性，在进化上是一类非常古老而有效的天然防御物质，往往归为抗菌肽；鱼类、软体动物、甲壳类动物来源的抗菌肽，目前，从鱼类分离得到49种以上抗菌肽；植物抗菌肽，植物中也存在一些结构上与昆虫、哺乳动物防御素结构相似的植物抗菌肽，称为植物防御素，大多数植物抗菌肽对植物病原具有良好活性，部分植物抗菌肽对革兰氏阳性菌、阴性菌、真菌、酵母及哺乳动物细胞均有毒性，细菌抗菌肽，细菌抗菌肽又称细菌素，包括阳离子肽和中性肽，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均可分泌。
5.目前，现有的抗菌肽的菌种培养基，在对抗菌肽菌种进行扩大培养时，往往因培养基原料的问题，导致抗菌肽菌种培养后的效价低，实用性低。


技术实现要素：

6.基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种抗菌肽菌种培养基配方及其制备方法。
7.本发明提出的一种抗菌肽菌种培养基配方，包括以下质量份数的原料：葡萄糖5-13份，酵母膏10-15份，蛋白胨10-20份，牛肉膏 10-20份，氯化钠3-5份，磷酸二氢钾3-5份，磷酸氢二钾3-5份，余量为蒸馏水。
8.优选地，包括以下质量份数的原料：葡萄糖5-9份，酵母膏10 份，蛋白胨15份，牛肉膏15份，氯化钠3份，磷酸二氢钾3份，磷酸氢二钾3份，余量为蒸馏水。
9.优选地，包括以下质量份数的原料：葡萄糖10-13份，酵母膏 10份，蛋白胨15份，牛肉膏15份，氯化钠3份，磷酸二氢钾3份，磷酸氢二钾3份，余量为蒸馏水。
10.一种抗菌肽菌种培养基的制备方法，包括以下步骤：
11.s1：取适量的蒸馏水放进250ml烧杯a中，用玻璃棒少量多次的蘸取牛肉膏放在硫
酸纸上进行称量，称量完成后，将牛肉膏和硫酸纸混合放进容器中，用玻璃棒搅拌，使得牛肉膏溶于蒸馏水中，用镊子取出硫酸纸；
12.s2：称取适量的酵母膏、葡萄糖、蛋白胨、氯化钠、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，分别加入烧杯a中，再向烧杯a中加入适量的蒸馏水，得到混合溶液；
13.s3：将烧杯a放在磁力搅拌器上，一边加热一边进行搅拌，使得所有成分完全混合并溶解于蒸馏水中，自然晾凉，得到培养基原液；
14.s4：向培养基原液中缓慢滴入5％浓度的氢氧化钠溶液，调节培养基原液ph值为7.5-7.7；
15.s5：取干净的250ml烧杯b，用于盛装混合溶液滤纸过滤后的滤清液；
16.s6：取足量的培养皿，将滤清液均匀的装进培养皿中，并盖上皿盖；
17.s7：将分装好的培养皿依次放进灭菌锅中，进行高压蒸汽灭菌，灭菌完成后，趁热取出并进行自然降温，得到培养基。
18.优选地，所述步骤s3中加热温度为80℃～90℃。
19.优选地，所述步骤s7中灭菌温度为100℃～120℃，压强为 1.5mpa～1.8mpa，灭菌时间为40min～60min。
20.本发明的有益效果：
21.本发明通过酵母膏、蛋白胨、牛肉膏和葡萄糖作为培养基的原料，原料易得，成本低，同时能够为抗菌肽菌种提供充足的发酵所需的营养物质，将培养基的ph值调节至弱碱性，有利于抗菌肽生长，同时提高了经发酵培养过后的抗菌肽菌种的效价，且萌发率高，提高了实用性。
具体实施方式
22.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
23.实施例1：一种抗菌肽菌种培养基配方，包括以下质量份数的原料：葡萄糖6份，酵母膏10份，蛋白胨15份，牛肉膏15份，氯化钠3份，磷酸二氢钾3份，磷酸氢二钾3份，余量为蒸馏水。
24.一种抗菌肽菌种培养基的制备方法，包括以下步骤：
25.s1：取适量的蒸馏水放进250ml烧杯a中，用玻璃棒少量多次的蘸取牛肉膏放在硫酸纸上进行称量，称量完成后，将牛肉膏和硫酸纸混合放进容器中，用玻璃棒搅拌，使得牛肉膏溶于蒸馏水中，用镊子取出硫酸纸；
26.s2：称取适量的酵母膏、葡萄糖、蛋白胨和氯化钠，分别加入烧杯a中，再向烧杯a中加入适量的蒸馏水，得到混合溶液；
27.s3：将烧杯a放在磁力搅拌器上，一边加热一边进行搅拌，使得所有成分完全混合并溶解于蒸馏水中，自然晾凉，得到培养基原液，加热温度为80℃～90℃；
28.s4：向培养基原液中缓慢滴入5％浓度的氢氧化钠溶液，调节培养基原液ph值为7.5-7.7；
29.s5：取干净的250ml烧杯b，用于盛装混合溶液滤纸过滤后的滤清液；
30.s6：取足量的培养皿，将滤清液均匀的装进培养皿中，并盖上皿盖；
31.s7：将分装好的培养皿依次放进灭菌锅中，进行高压蒸汽灭菌，灭菌完成后，趁热取出并进行自然降温，得到培养基，灭菌温度为 100℃～120℃，压强为1.5mpa～1.8mpa，灭菌时间为40min～60min。
32.实施例2：一种抗菌肽菌种培养基配方，包括以下质量份数的原料：葡萄糖7份，酵母膏10份，蛋白胨15份，牛肉膏15份，氯化钠3份，磷酸二氢钾3份，磷酸氢二钾3份，余量为蒸馏水。
33.一种抗菌肽菌种培养基的制备方法，包括以下步骤：
34.s1：取适量的蒸馏水放进250ml烧杯a中，用玻璃棒少量多次的蘸取牛肉膏放在硫酸纸上进行称量，称量完成后，将牛肉膏和硫酸纸混合放进容器中，用玻璃棒搅拌，使得牛肉膏溶于蒸馏水中，用镊子取出硫酸纸；
35.s2：称取适量的酵母膏、葡萄糖、蛋白胨和氯化钠，分别加入烧杯a中，再向烧杯a中加入适量的蒸馏水，得到混合溶液；
36.s3：将烧杯a放在磁力搅拌器上，一边加热一边进行搅拌，使得所有成分完全混合并溶解于蒸馏水中，自然晾凉，得到培养基原液，加热温度为80℃～90℃；
37.s4：向培养基原液中缓慢滴入5％浓度的氢氧化钠溶液，调节培养基原液ph值为7.5-7.7；
38.s5：取干净的250ml烧杯b，用于盛装混合溶液滤纸过滤后的滤清液；
39.s6：取足量的培养皿，将滤清液均匀的装进培养皿中，并盖上皿盖；
40.s7：将分装好的培养皿依次放进灭菌锅中，进行高压蒸汽灭菌，灭菌完成后，趁热取出并进行自然降温，得到培养基，灭菌温度为 100℃～120℃，压强为1.5mpa～1.8mpa，灭菌时间为40min～60min。
41.实施例3：一种抗菌肽菌种培养基配方，包括以下质量份数的原料：葡萄糖11份，酵母膏10份，蛋白胨15份，牛肉膏15份，氯化钠3份，磷酸二氢钾3份，磷酸氢二钾3份，余量为蒸馏水。
42.一种抗菌肽菌种培养基的制备方法，包括以下步骤：
43.s1：取适量的蒸馏水放进250ml烧杯a中，用玻璃棒少量多次的蘸取牛肉膏放在硫酸纸上进行称量，称量完成后，将牛肉膏和硫酸纸混合放进容器中，用玻璃棒搅拌，使得牛肉膏溶于蒸馏水中，用镊子取出硫酸纸；
44.s2：称取适量的酵母膏、葡萄糖、蛋白胨和氯化钠，分别加入烧杯a中，再向烧杯a中加入适量的蒸馏水，得到混合溶液；
45.s3：将烧杯a放在磁力搅拌器上，一边加热一边进行搅拌，使得所有成分完全混合并溶解于蒸馏水中，自然晾凉，得到培养基原液，加热温度为80℃～90℃；
46.s4：向培养基原液中缓慢滴入5％浓度的氢氧化钠溶液，调节培养基原液ph值为7.5-7.7；
47.s5：取干净的250ml烧杯b，用于盛装混合溶液滤纸过滤后的滤清液；
48.s6：取足量的培养皿，将滤清液均匀的装进培养皿中，并盖上皿盖；
49.s7：将分装好的培养皿依次放进灭菌锅中，进行高压蒸汽灭菌，灭菌完成后，趁热取出并进行自然降温，得到培养基，灭菌温度为100℃～120℃，压强为1.5mpa～1.8mpa，灭菌时间为40min～60min。
50.实施例4：一种抗菌肽菌种培养基配方，包括以下质量份数的原料：葡萄糖12份，酵母膏10份，蛋白胨15份，牛肉膏15份，氯化钠3份，磷酸二氢钾3份，磷酸氢二钾3份，余量为蒸馏水。
51.一种抗菌肽菌种培养基的制备方法，包括以下步骤：
52.s1：取适量的蒸馏水放进250ml烧杯a中，用玻璃棒少量多次的蘸取牛肉膏放在硫酸纸上进行称量，称量完成后，将牛肉膏和硫酸纸混合放进容器中，用玻璃棒搅拌，使得牛肉膏溶于蒸馏水中，用镊子取出硫酸纸；
53.s2：称取适量的酵母膏、葡萄糖、蛋白胨和氯化钠，分别加入烧杯a中，再向烧杯a中加入适量的蒸馏水，得到混合溶液；
54.s3：将烧杯a放在磁力搅拌器上，一边加热一边进行搅拌，使得所有成分完全混合并溶解于蒸馏水中，自然晾凉，得到培养基原液，加热温度为80℃～90℃；
55.s4：向培养基原液中缓慢滴入5％浓度的氢氧化钠溶液，调节培养基原液ph值为7.5-7.7；
56.s5：取干净的250ml烧杯b，用于盛装混合溶液滤纸过滤后的滤清液；
57.s6：取足量的培养皿，将滤清液均匀的装进培养皿中，并盖上皿盖；
58.s7：将分装好的培养皿依次放进灭菌锅中，进行高压蒸汽灭菌，灭菌完成后，趁热取出并进行自然降温，得到培养基，灭菌温度为 100℃～120℃，压强为1.5mpa～1.8mpa，灭菌时间为40min～60min。
59.效价测定试验
60.取实施例1、实施例2、实施例3和实施例4的培养基各两份，高压灭菌后待培养基冷却至35℃时，接入抗菌肽菌种，30℃恒温条件下培养24h～48h，观察并记录萌发率，随后利用打孔器进行打孔，孔径2.7mm，取外径2.7mm的培养基，另一份实施例1、实施例2、实施例3和实施例4的培养基待温度冷却至55℃时，接入大肠杆菌菌种，37℃恒温条件下培养24h～48h，随后利用打孔器打孔，将接入抗菌肽菌种的培养基放入接种大肠杆菌菌种的培养基上2.7mm的孔中，37℃条件下培养24h，测定抑菌圈直径(mm)，按照下列公式进行计算：
61.杀菌效价(iu/ml)＝2
x
×
1000，其中x＝(抑菌圈直径-2.7mm)
ꢀ÷
2.1
62.经计算得出，试验结果如表1。
63.表1效价试验结果
[0064] 实施例1实施例2实施例3实施例4萌发率(％)96.597.398.998.9效价(iu/ml)5773586259635946
[0065] 综上所述，葡萄糖11份，酵母膏10份，蛋白胨15份，牛肉膏15份，氯化钠3份，磷酸二氢钾3份，磷酸氢二钾3份的培养基为本发明的最佳培养基。
[0066]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。