一种利用自发异肽键进行蛋白共价自组装的肽链接头的组合的制作方法

1.本发明涉及蛋白质的自组装技术领域，具体地，涉及一种利用自发异肽键进行蛋白共价自组装的肽链接头的组合。


背景技术：

2.细胞功能依赖于大量可逆的非共价蛋白
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蛋白质相互作用，蛋白质在复合物中的精确排列影响和决定了它们的功能。而非共价的相互作用往往是比较脆弱的，在长周期或一些机械力等条件存在下，非共价的相互作用通常会中断。因此，设计共价蛋白质
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蛋白质相互作用的能力可以为基础研究、合成生物学和生物技术带来一系列新的机会。
3.共价蛋白质相互作用通常是通过二硫键介导的，二硫键是可逆的，并不适用于减少细胞间隔，而且可能干扰蛋白质折叠。肽标签因其分子量小，最小化了对蛋白质功能的干扰，是蛋白质分析和修饰的常用工具。肽标签很容易进行基因编码，因为其尺寸小，减少了生物合成成本和引入免疫原性的干扰。但是，由于肽标签和蛋白质之间的相互作用很少具有较高的亲和力，这限制了它们在形成稳定复合物中的效用。
4.目前，能够自发形成异肽键的蛋白质往往已被用于开发肽标签，以及与之对应的结合多肽(即两部分连接物)，它们相互共价结合，并提供不可逆转的相互作用。能够自发形成异肽键的蛋白质可以表达为两个片段：一个肽标签和一个多肽结合伙伴。这两个片段能够通过异肽键的形成达到共价重组，从而使得分别与肽标签及与其多肽结合伙伴连接的分子或组分进行融合。
5.异肽键是侧链羧基或侧链氨基之间形成的酰胺键，在典型的生物条件下，这种键在化学上是不可逆的，并且对大多数蛋白酶都有抗性。由于异肽键在化学性质上是共价的，它们能产生超强的蛋白质连接作用。在非共价相互作用会迅速解离的条件下，如高温，高压，苛刻的化学处理或长周期等，肽标签及其多肽结合伙伴形成的异肽键还是能稳定结合。
6.在一些革兰氏阳性细菌中存在一些蛋白能够拥有极强的相互作用。例如应用于治疗药物，生物材料和疫苗领域的化脓性链球菌的纤连蛋白结合蛋白(fbab)包含一个粘附素结构域(cnab2)，该结构域的第31位赖氨酸(k)和第117位天冬氨酸(d)在第77位谷氨酸(e)催化下能自发形成异肽键。之前的科学研究通过将化脓性链球fba b蛋白的cnab2分为13个残基的spytag肽和116个残基的spycatcher蛋白，建立了spytag/spycatcher系统，实现了遗传编码和肽与蛋白质的共价相互作用。spytag/spycatcher系统提供了一种简单，特定且可遗传编码的方法来创建多种生物材料，用于多种应用，包括生物材料、下一代测序、酶稳定和疫苗开发等。
7.虽然spytag/spycatcher技术已经被用于多种应用，但它们的反应速度和效率还是较低。为了改善这种状况，一方面可以通过对现行spytag/spycatcher序列进行修饰和优化，比如spytag003/spycatcher003系统。另一方面可以寻找其它细菌中能自发形成异肽键的蛋白质，从而建立更优的连接系统。


技术实现要素：

8.本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种利用自发异肽键进行蛋白共价自组装的肽链接头的组合。
9.本发明的第一个目的是提供一种利用自发异肽键进行蛋白共价自组装的肽链接头的组合。
10.本发明的第二个目的是提供一种重组和合成肽链。
11.本发明的第三个目的是提供一种核酸分子。
12.本发明的第四个目的是提供一种载体。
13.本发明的第五个目的是提供一种细胞。
14.本发明的第六个目的是提供任一所述的组合在通过异肽键自组装两个分子或组分的应用。
15.本发明的第七个目的是提供一种通过异肽键自组装两个分子或组分的方法。
16.本发明的第八个目的是提供一种通过异肽键自组装两个分子或组分的试剂盒。
17.本发明的第九个目的是提供所述的组合、所述的核酸分子、所述的载体、或所述的细胞中的一种或几种在制备自组装两个分子或组分的试剂盒，或通过异肽键自组装两个分子或组分中的应用。
18.为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
19.本发明以gvtag/sdcatcher(seq id no:11和seq id no:5)，pstag/sdcatcher(seq id no:13和seq id no:5)和satag/sdcatcher(seq id no:14和seq id no:5)建立了能自发形成异肽键的多肽与肽标签组合的连接系统，进一步gvtag肽标签n端进行了相应的氨基酸修饰优化，使得结合效率比spytag003/spycatcher003系统更强。
20.具体地，是通过与化脓性链球菌(streptococcus pyogenes)的cnab2序列比对，找到另外10个具有cnab2粘附素结构域序列的细菌。包括阴道加德纳杆菌(gardnerella vaginalis,gv)、颗粒链球菌(granulicatella balaenopterae,gb)、消化链球菌(peptostreptococcus sp,ps)、咽峡炎链球菌(streptococcus anginosus subsp,sa)、停乳链球菌(streptococcus dysgalactiae,sd)、哈利氏厌氧菌(anaerobutyricum hallii,ah)、产气荚膜梭菌(clostridium perfringens，cp)、瘤胃球菌(ruminococcus sp,rs)、星座链球菌(streptococcus constellatus,sco)和肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae,spn)。
21.本发明为了得到结合效率较高的异肽键系统，将相应的cnab2分解成tag肽和catcher蛋白，构建了十种不同的tag
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gfp和十种不同catcher
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hpf克隆，并在e.coli系统中表达并纯化。通过表达蛋白的产量情况，挑选出了消化链球菌，咽峡炎链球菌和停乳链球菌的catcher蛋白(pscatcher、sacatcher、sdcatcher)，并和上述的十种细菌的tag
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gfp进行了排列组合式的孵育。通过蛋白电泳和考马斯亮蓝，筛出了停乳链球菌的sdcatcher蛋白与gvtag
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gfp、pstag
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gfp和satag
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gfp三种结合能力比较高效的组合。
22.接着将这三种组合形式运用在sars
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cov
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2新型冠状病毒s蛋白的受体结合区(receptor binding domain,rbd)亚单位纳米疫苗系统上。结果显示gvtag
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rbd和sdcatcher
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hpf自行组装成球状二十四聚体纳米颗粒，在运用gvtag/sdcatcher、pstag/sdcatcher和satag/sdcatcher效的提高了原先spytag/spycatcher系统结合效率低的不
足，并且gvtag/sdcatcher系统时两者的蛋白结合效率最好。将gvtag序列进一步优化得到的gvtagopti/sdcatcher系统可以进一步提高结合效率。
23.将运用了gvtagopti/sdcatcher系统，pstag/sdcatcher系统和satag/sdcatcher连接系统得到的rbd
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ferritin亚单位二十四聚体纳米抗原颗粒免疫小鼠，可以克服rbd单体免疫原性不足的缺点，能够有效地引起更强的免疫反应，提高了抗体滴度。本发明的gvtagopti/sdcatcher系统，pstag/sdcatcher系统和satag/sdcatcher连接系统能显著的提高肽标签及其多肽融合的分子或组分的反应效率；而且本发明gvtagopti/sdcatcher系统，pstag/sdcatcher系统和satag/sdcatcher连接系统制备方法简单、蛋白表达量高。
24.因此本发明要求保护以下内容：
25.一种利用自发异肽键进行蛋白共价自组装的肽链接头的组合，包括肽链接头1(多肽)和肽链接头2(肽标签)：所述肽链接头1含有氨基酸序列如seq id no：5所示的肽链；所述肽链接头2含有氨基酸序列如seq id no:11、13、14所示肽链的任意一条或几条。
26.seq id no:5：
27.sgetgqsgnttieedstthvkfskrdingkelagamielrnlsgqtiqswvsdgtvkdfylmpgtyqfvetaapegyelaapitftidekgqiwvdstlivgddpi；
28.seq id no:11：ntivmvdklkevptp；
29.seq id no:13：ntivmvdklkktp；
30.seq id no:14：ntivmvdklkelppp。
31.优选地，肽链接头2含有氨基酸序列如seq id no:11所示的肽链。
32.更优选地，肽链接头2含有氨基酸序列如seq id no:46所示的肽链(seq id no:11所示的肽链的n端还有kvg三个氨基酸)。
33.seq id no：46：kvgntivmvdklkevptp。
34.本发明还要求保护一种重组和合成肽链，其包括权利要求1或2任一所述组合中的肽链接头1和/或肽链接头2中的一种或几种。
35.本发明还要求保护一种核酸分子，其包含编码任一所述组合中的肽链接头1和/或肽链接头2中的一种或几种的核苷酸序列。
36.本发明还要求保护一种载体，其包含所述的核酸分子。
37.本发明还要求保护一种细胞，其包含所述的核酸分子或所述的载体。
38.以及任一所述的组合在通过异肽键自组装两个分子或组分的应用，所述两个分子或组分分别连接有所述组合中的肽链接头1(多肽)和肽链接头2(肽标签)。
39.进一步本发明要求保护一种通过异肽键自组装两个分子或组分的方法，包括：
40.提供包含权利要求1或2所述组合中的肽链接头1的第一分子或组分；
41.提供包含权利要求1或2所述组合中的肽链接头2的第二分子或组分；
42.在使所述肽链接头1和肽链接头2之间自发形成异肽键的条件下，使所述第一和第二分子或组分接触，从而通过异肽键将所述第一分子或组分与所述第二分子或组分自组装以形成复合物。
43.更进一步本发明要求保护一种通过异肽键自组装两个分子或组分的试剂盒，包含：所述组合中的肽链接头1(多肽)和肽链接头2(肽标签)、编码所述组合中的肽链接头1和肽链接头2的核酸分子、或带有含有编码所述组合中的肽链接头1和肽链接头2的载体的细
胞中的一种。
44.所述的组合、所述的核酸分子、所述的载体、或所述的细胞中的一种或几种在制备自组装两个分子或组分的试剂盒，或通过异肽键自组装两个分子或组分中的应用，也属于本发明的保护范围。
45.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
46.本发明构建了新的基于异肽键的蛋白质自组装系统gvtag/sdcatcher、pstag/sdcatcher和satag/sdcatcher，其有效的解决了原先spytag/spycatcher系统结合效率低的不足的问题。能显著的提高肽标签及其多肽融合的分子或组分的反应效率，结合效率比spytag003/spycatcher003系统更强；而且本发明gvtagopti/sdcatcher系统，pstag/sdcatcher系统和satag/sdcatcher连接系统制备方法简单、蛋白表达量高。
附图说明
47.图1为不同细菌catcher多肽序列与spycatcher比对情况。
48.图2为不同细菌tag肽标签序列与spytag比对情况。
49.图3为tag
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gfp、catcher
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hpf、tag
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rbd融合蛋白结构示意图。
50.图4为表达sdcatcher
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hpf的质粒结构示意图。
51.图5为表达gvtag
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gfp的质粒结构示意图。
52.图6为不同细菌tag
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gfp和catcher
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hpf融合蛋白考染图和蛋白产量图。
53.图7为消化链球菌ps，咽峡炎链球菌sa和停乳链球菌sd的catcher
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hpf蛋白和十种细菌的tag
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gfp进行了排列组合式的孵育后结合蛋白考染图。
54.图8为表达gvtag
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rbd的质粒结构示意图
55.图9为gvtag/sdcatcher，pstag/sdcatcher和satag/sdcatcher三种组合连接系统与spytag/spycatcher和spytag003/spycatcher003连接系统，运用在新冠rbd纳米疫苗上结合蛋白连接效率的考染图。
56.图10为gvtag/sdcatcher、gvtag001/sdcatcher、gvtag002/sdcatcher和gvtagopti/sdcatcher系统结合蛋白连接效率的考染图。
57.图11为gvtagopti/sdcatcher和spytag003/spycatcher003系统蛋白结合效率的考染图。
58.图12为通过gvtagopti/sdcatcher系统、pstag/sdcatcher系统和satag/sdcatcher系统异肽键连接的rbd
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hpf蛋白纯化分子筛图。
59.图13为通过gvtagopti/sdcatcher系统、pstag/sdcatcher系统和satag/sdcatcher以及spytag003/spycatcher003系统异肽键连接的rbd
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hpf蛋白免疫小鼠两周后血清rbd抗体效价检测图。
具体实施方式
60.下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
61.实施例1具有cnab2粘附素结构域序列的细菌的获得
62.一、实验方法
63.通过与化脓性链球菌(streptococcus pyogenes)的cnab2序列比对，寻找具有cnab2粘附素结构域序列的细菌。
64.二、实验结果
65.不同细菌catcher多肽序列与spycatcher比对情况和tag肽标签序列与spytag比对情况以及tag
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gfp、catcher
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hpf融合蛋白结构示意图分别如图1和图2。通过与化脓性链球菌(streptococcus pyogenes)的cnab2序列比对，找到了另外10个具有cnab2粘附素结构域序列的细菌。包括阴道加德纳杆菌(gardnerella vaginalis，gv)、颗粒链球菌(granulicatella balaenopterae，gb)、消化链球菌(peptostreptococcus sp，ps)、咽峡炎链球菌(streptococcus anginosus subsp，sa)、停乳链球菌(streptococcus dysgalactiae，sd)、哈利氏厌氧菌(anaerobutyricum hallii，ah)、产气荚膜梭菌(clostridium perfringens，cp)、瘤胃球菌(ruminococcus sp，rs)、星座链球菌(streptococcus constellatus，sco)和肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae，spn)。
66.实施例2构建新型catcher
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hpf和新型tag
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gfp融和蛋白,筛选蛋白结合效率高的组合形式
67.一、实验方法
68.1、cnab2粘附素结构域序列的拆分
69.将10个细菌阴道加德纳杆菌(gardnerella vaginalis,gv)、颗粒链球菌(granulicatella balaenopterae,gb)、消化链球菌(peptostreptococcus sp,ps)、咽峡炎链球菌(streptococcus anginosus subsp,sa)、停乳链球菌(streptococcus dysgalactiae,sd)、哈利氏厌氧菌(anaerobutyricum hallii,ah)、产气荚膜梭菌(clostridium perfringens，cp)、瘤胃球菌(ruminococcus sp,rs)、星座链球菌(streptococcus constellatus，sco)和肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae，spn)的10个catcher多肽序列(其氨基酸序列分别为seq id no:1～10所示)和10个tag肽(其氨基酸序列为seq id no:11～20所示)。
70.seq id no:1(gvcatcher的氨基酸序列)
71.mvdklkevptstkvkfskkaltengedlkgatiqltkadgslvkkwvtdgtvtefelkdgkytftetsapakyqvataitfevkngkaivkgiavtgntiv；
72.seq id no:2(gbcatcher的氨基酸序列)
73.vvtdgysshdiniskadidgneiagakivltdkagkqidswtstkelhkvslkpgtyifketlapegfevvtditftvnvdgtitvndkqakvnndgvl；
74.seq id no:3(pscatcher的氨基酸序列)
75.ektkvkfskkaltangeelkgatikltkengtvikewvtdgkltefeledgsytfteisapdkyqvataitfevkagkvlvtgtevkgntiv；
76.seq id no:4(sacatcher的氨基酸序列)
77.stpstkvkfskkaltengeelkgatirltkedgslvkewvtdgtvkefelkdgkytfteisapdkyqvataitfevkngkvivkgievtgntiv；
78.seq id no:5(sdcatcher的氨基酸序列)：
79.sgetgqsgnttieedstthvkfskrdingkelagamielrnlsgqtiqswvsdgtvkdfylmpgtyqfvetaapegyelaapitftidekgqiwvdstlivgddpi；
80.seq id no:6(ahcatcher的氨基酸序列)
81.itdketgediylvkddvtrvsvkkmditgqkevagarlllkdkegnvieswmsttearvfeqkliagetytltevtapsgyevaaditftvnkdgtvsvdgkavd；
82.seq id no:7(cpcatcher的氨基酸序列)
83.nnqksevlklniiddlpkevlfskhdiagnelagatielsnkadgkvidtwvsdgqgahtfnlkpgnyvftekaapegyevatainftvnpdgtvtsddv；
84.seq id no:8(rscatcher的氨基酸序列)
85.tftidktgkvlvngedvngqvtmydaalgdvviskravngteelegaslkitdadgktvaewvsdstpktiqldagtytlteetapdgytvaesiefvvdaag；
86.seq id no:9(scocatcher的氨基酸序列)
87.tvedtsevqkvemkddvtkvqisktdisgkelpgakltildkdgktveswtseekphyiemlpigeytlreetapdgylvaedvkftvkdtgeiqkvvmkdevkptatpt；
88.seq id no:10(spncatcher的氨基酸序列)：
89.gntivmvdklkelppppstpptkvkfskkaltengeelkgatirltkedgslveewvtdgtvkefelkdgkytfteisapakyqvataitfevkngkaivkgiev；
90.seq id no:11(gvtag的氨基酸序列)：ntivmvdklkevptp；
91.seq id no:12(gbtag的氨基酸序列)：tniefvdgnkphk；
92.seq id no:13(pstag的氨基酸序列)：ntivmvdklkktp；
93.seq id no:14(satag的氨基酸序列)：ntivmvdklkelppp；
94.seq id no:15(sdtag的氨基酸序列)：dpivmidndkpit；
95.seq id no:16(ahtag的氨基酸序列)：neivmkdettpvg；
96.seq id no:17(cptag的氨基酸序列)：nhvvmvdgyapke；
97.seq id no:18(rstag的氨基酸序列)：dqivmvdvakttt；
98.seq id no:19(scotag的氨基酸序列)：qkvvmkdevkpta；
99.seq id no:20(spntag的氨基酸序列)：ntivmvdklkelp.。
100.2、catcher
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hpf融合蛋白克隆和tag
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gfp融合蛋白克隆及重组载体的构建
101.将以上十种不同catcher蛋白和幽门螺旋杆菌铁蛋白(helicobacter pylori_ferritin,hpf)按照图3的示意图构建10种catcher
‑
hpf融合蛋白(氨基酸序列如seq id no:21～30所示)，将编码catcher
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hpf融合蛋白的核苷酸序列克隆到表达载体pet28a的nco i和xho i的酶切位点之间，得到重组质粒。pet28a载体xhoi酶切位点下游自带6xhis tag和终止密码子，其中之一的表达载体pet28a
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sdcatcher
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hpf如图4所示。
102.seq id no:21(融合蛋白gvcatcher
‑
hpf的氨基酸序列)：
103.mvdklkevptstkvkfskkaltengedlkgatiqltkadgslvkkwvtdgtvtefelkdgkytftetsapakyqvataitfevkngkaivkgiavtgntivgsgdiikllneqvnkemqssnlymsmsswcythsldgaglflfdhaaeeyehakkliiflnennvpvqltsisapehkfegltqifqkayeheqhisesinnivdhaikskdhatfnflqwyvaeqheeevlfkdildkielignenhglyladqyvkgiaksrks；
104.seq id no:22(融合蛋白gbcatcher
‑
hpf的氨基酸序列)：
105.vvtdgysshdiniskadidgneiagakivltdkagkqidswtstkelhkvslkpgtyifketlapegfevvtditftvnvdgtitvndkqakvnndgvlgsgdiikllneqvnkemqssnlymsmsswcythsldgaglflfdhaaeeyehakkliiflnennvpvqltsisapehkfegltqifqkayeheqhisesinnivdhaikskdhatfnflqwyvaeqheeevlfkdildkielignenhglyladqyvkgiaksrks；
106.seq id no:23(融合蛋白pscatcher
‑
hpf的氨基酸序列)：
107.ektkvkfskkaltangeelkgatikltkengtvikewvtdgkltefeledgsytfteisapdkyqvataitfevkagkvlvtgtevkgntivgsgdiikllneqvnkemqssnlymsmsswcythsldgaglflfdhaaeeyehakkliiflnennvpvqltsisapehkfegltqifqkayeheqhisesinnivdhaikskdhatfnflqwyvaeqheeevlfkdildkielignenhglyladqyvkgiaksrks；
108.seq id no:24(融合蛋白sacatcher
‑
hpf的氨基酸序列)：
109.stpstkvkfskkaltengeelkgatirltkedgslvkewvtdgtvkefelkdgkytfteisapdkyqvataitfevkngkvivkgievtgntivgsgdiikllneqvnkemqssnlymsmsswcythsldgaglflfdhaaeeyehakkliiflnennvpvqltsisapehkfegltqifqkayeheqhisesinnivdhaikskdhatfnflqwyvaeqheeevlfkdildkielignenhglyladqyvkgiaksrks；
110.seq id no:25(融合蛋白sdcatcher
‑
hpf的氨基酸序列)：
111.sgetgqsgnttieedstthvkfskrdingkelagamielrnlsgqtiqswvsdgtvkdfylmpgtyqfvetaapegyelaapitftidekgqiwvdstlivgddpigsgdiikllneqvnkemqssnlymsmsswcythsldgaglflfdhaaeeyehakkliiflnennvpvqltsisapehkfegltqifqkayeheqhisesinnivdhaikskdhatfnflqwyvaeqheeevlfkdildkielignenhglyladqyvkgiaksrks；
112.seq id no:26(融合蛋白ahcatcher
‑
hpf的氨基酸序列):itdketgediylvkddvtrvsvkkmditgqkevagarlllkdkegnvieswmsttearvfeqkliagetytltevtapsgyevaaditftvnkdgtvsvdgkavdgsgdiikllneqvnkemqssnlymsmsswcythsldgaglflfdhaaeeyehakkliiflnennvpvqltsisapehkfegltqifqkayeheqhisesinnivdhaikskdhatfnflqwyvaeqheeevlfkdildkielignenhglyladqyvkgiaksrks；
113.seq id no:27(融合蛋白cpcatcher
‑
hpf的氨基酸序列):nnqksevlklniiddlpkevlfskhdiagnelagatielsnkadgkvidtwvsdgqgahtfnlkpgnyvftekaapegyevatainftvnpdgtvtsddvgsgdiikllneqvnkemqssnlymsmsswcythsldgaglflfdhaaeeyehakkliiflnennvpvqltsisapehkfegltqifqkayeheqhisesinnivdhaikskdhatfnflqwyvaeqheeevlfkdildkielignenhglyladqyvkgiaksrks；
114.seq id no:28(融合蛋白rscatcher
‑
hpf的氨基酸序列):tftidktgkvlvngedvngqvtmydaalgdvviskravngteelegaslkitdadgktvaewvsdstpktiqldagtytlteetapdgytvaesiefvvdaaggsgdiikllneqvnkemqssnlymsmsswcythsldgaglflfdhaaeeyehakkliiflnennvpvqltsisapehkfegltqifqkayeheqhisesinnivdhaikskdhatfnflqwyvaeqheeevlfkdildkielignenhglyladqyvkgiaksrks；
115.seq id no:29(融合蛋白scocatcher
‑
hpf的氨基酸序列):tvedtsevqkvemkddvtkvqisktdisgkelpgakltildkdgktveswtseekphyiemlpigeytlreetapdgylvaedvkftvkdtgeiqkvvmkdevkptatptgsgdiikllneqvnkemqssnlymsmsswcythsldgaglflfdhaaeeyehakkliiflnennvpvqltsisapehkfegltqifqkayeheqhisesinnivdhaikskdhatfnflqwyvaeqheeevlfkdildkielignenhglyladqyvkgiaksrks；
116.seq id no:30(融合蛋白spncatcher
‑
hpf的氨基酸序列):gntivmvdklkelppppstpptkvkfskkaltengeelkgatirltkedgslveewvtdgtvkefelkdgkytfteisapakyqvataitfevkngkaivkgievgsgdiikllneqvnkemqssnlymsmsswcythsldgaglflfdhaaeeyehakkliiflnennvpvqltsisapehkfegltqifqkayeheqhisesinnivdhaikskdhatfnflqwyvaeqheeevlfkdildkielignenhglyladqyvkgiaksrks。
117.将十种不同tag蛋白和绿色荧光蛋白(gfp)按照图3的示意图构建十种tag
‑
gfp融合蛋白克隆(氨基酸序列如seq id no:31～40所示)，将编码tag
‑
gfp融合蛋白的核苷酸序列克隆到表达载体pet28a的nco i和xho i的酶切位点之间，得到重组质粒。其中之一的表达载体pet28a
‑
gvtag
‑
gfp如图5所示。
118.seq id no:31(融合蛋白gvtag
‑
gfp的氨基酸序列)：
119.ntivmvdklkevptpgsgmvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk；
120.seq id no:32(融合蛋白gbtag
‑
gfp的氨基酸序列)：
121.tniefvdgnkphkgsgmvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk；
122.seq id no:33(融合蛋白pstag
‑
gfp的氨基酸序列)：
123.ntivmvdklkktpgsgmvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk；
124.seq id no:34(融合蛋白satag
‑
gfp的氨基酸序列)：
125.ntivmvdklkelpppgsgmvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk；
126.seq id no:35(融合蛋白sdtag
‑
gfp的氨基酸序列)：
127.dpivmidndkpitgsgmvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk。
128.seq id no:36(融合蛋白ahtag
‑
gfp的氨基酸序列)：
129.neivmkdettpvggsgmvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk；
130.seq id no:37(融合蛋白cptag
‑
gfp的氨基酸序列)：
131.nhvvmvdgyapkegsgmvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk；
132.seq id no:38(融合蛋白rstag
‑
gfp的氨基酸序列)：
133.dqivmvdvaktttgsgmvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk；
134.seq id no:39(融合蛋白scotag
‑
gfp的氨基酸序列)：
135.qkvvmkdevkptagsgmvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk；
136.seq id no:40(融合蛋白spntag
‑
gfp的氨基酸序列)：
137.ntivmvdklkelpgsgmvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk。
138.具体各序列信息见表1所示。
139.表1：
[0140][0141]
3、catcher
‑
hpf融合蛋白和tag
‑
gfp融合蛋白的表达
[0142]
将制备得到20个重组质粒转化dh5α感受态细胞，37℃过夜培养，筛选和pcr鉴定出阳性克隆。将阳性克隆送测序，结果正确后提取质粒。
[0143]
将20个重组质粒的测序正确的质粒分别转染bl21(de3)得到重组菌株，以进行原
核蛋白表达，用抗性为卡那霉素的lb扩大培养重组菌株，37℃220rpm/min培养至od
600
约为0.6(约4h)，之后加入终浓度1mm iptg，16℃、220rpm/min诱导蛋白表达。在诱导后18h，通过超声溶解破碎菌体，离心弃沉淀。
[0144]
上清液用ni
‑
nta琼脂糖(gehealthcare)孵育，以富集his标记的catcher
‑
hpf和tag
‑
gfp，然后用含咪唑的tris缓冲液洗脱蛋白质。纯化后的蛋白浓缩，再用ph＝7.5 20mm tri
‑
hcl 50mm nacl缓冲液置换。用bca法测定蛋白的浓度，采用考马斯蓝染色，检测各蛋白的表达情况。哈利氏厌氧菌(anaerobutyricum hallii，ah)、产气荚膜梭菌(clostridium perfringens，cp)、瘤胃球菌(ruminococcus sp，rs)、星座链球菌(streptococcus constellatus，sco)和肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae，spn)
[0145]
4、tag
‑
gfp与catcher
‑
hpf的孵育
[0146]
纯化得到的各种tag
‑
gfp与各种catcher
‑
hpf分别进行孵育。tag
‑
gfp与catcher
‑
hpf在ph＝7.5 20mm tri
‑
hcl 50mm nacl tris缓冲液中按照物质的量1:1孵育：在1ml的缓冲液中投入5nmol tag
‑
gfp和5nmol catcher
‑
hpf进行室温1小时孵育。
[0147]
二、实验结果
[0148]
考马斯蓝染色结果如图6所示，消化链球菌ps，咽峡炎链球菌sa和停乳链球菌sd的catcher蛋白表达量高，用于和上述的五种细菌的tag
‑
gfp进行了排列组合式的孵育。
[0149]
孵育结果如图7所示，catcher
‑
hpf和tag
‑
gfp两者结合后的蛋白大小为65kda。结显示，停乳链球菌的sdcatcher蛋白与gvtag
‑
gfp(seq id no:31)、pstag
‑
gfp(seq id no:33)和satag
‑
gfp(seq id no:34)三种结合能力比较高效的组合。从而筛选出了gvtag/sdcatcher(seq id no:11和seq id no:5)，pstag/sdcatcher(seq id no:13和seq id no:5)和satag/sdcatcher(seq id no:14和seq id no:5)三种结合组合系统。
[0150]
实施例3三种结合组合系统在sars
‑
cov
‑
2新型冠状病毒s蛋白的受体结合区(rbd)亚单位纳米疫苗系统上的应用
[0151]
一、实验方法
[0152]
将实施例2选得到的gvtag/sdcatcher，pstag/sdcatcher和satag/sdcatcher三种结合组合系统运用在sars
‑
cov
‑
2新型冠状病毒s蛋白的受体结合区(receptor binding domain,rbd)亚单位纳米疫苗系统上。
[0153]
1、重组质粒的构建
[0154]
将gvtag、pstag和satag分别与rbd按照图3的示意图构建3种tag
‑
rbd融合蛋白克隆，将tag
‑
rbd核苷酸序列5’加上分泌肽sp的编码序列，tag和rbd之间用linker gsg隔开，3’端加上6xhis和翻译终止密码子，分别得到sp
‑
gvtag
‑
rbd
‑
his、sp
‑
pstag
‑
rbd
‑
his和sp
‑
satag
‑
rbd
‑
his(其编码的氨基酸序列分别如seq id no:41～43所示)，分别将其克隆到添加了intron以及wpre增强表达的表达载体(pcdna3.1
‑
intron
‑
wpre)(如图8所示)的xho i和xba i酶切位点之间，构建表达载体pcdna3.1
‑
intron
‑
sp
‑
tag
‑
rbd
‑
ires
‑
gfp
‑
wpre。其中之一的表达载体pcdna3.1
‑
intron
‑
sp
‑
gvtag
‑
rbd
‑
his
‑
ires
‑
gfp
‑
wpre如图8示。
[0155]
seq id no:41(融合蛋白sp
‑
gvtag
‑
rbd
‑
his的氨基酸序列)：
[0156]
mgilpspgmp allslvsllsvllmgcvagsgntivmvdklkevptpgsgrvqptesivrfpnitnlcpfg evfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfn
cyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellh apatvcgpkk stnlvknkcv nfhhhhhh；
[0157]
seq id no:42(融合蛋白sp
‑
pstag
‑
rbd
‑
his的氨基酸序列)：
[0158]
mgilpspgmpallslvsllsvllmgcvagsgntivmvdklkktpgsgrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfhhhhhh；
[0159]
seq id no:43(融合蛋白sp
‑
satag
‑
rbd
‑
his的氨基酸序列)：
[0160]
mgilpspgmpallslvsllsvllmgcvagsgntivmvdklkelpppgsgrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfhhhhhh。
[0161]
2、重组蛋白的表达及纯化
[0162]
将制备得到的重组质粒转化dh5α感受态细胞，37℃过夜培养，筛选和pcr鉴定出阳性克隆。提取去内毒素的质粒，通过脂质体转染的方案转染hek293f细胞，转染5天后经离心收获细胞上清，进行目的蛋白纯化。
[0163]
上清液用ni
‑
nta琼脂糖(gehealthcare)孵育，富集his标记的tag
‑
rbd然后用含咪唑的tris缓冲液进行蛋白质洗脱。纯化后的蛋白浓缩，用ph＝7.5 20mm tri
‑
hcl 50mm nacl缓冲液置换。用bca法测定蛋白的浓度，采用考马斯蓝染色，
[0164]
3、二十四聚体纳米颗粒的ferritin的自组装
[0165]
5nmol纯化好的tag
‑
rbd蛋白与实施例3的原核表达纯化的5nmol的sdcatcher
‑
hpf蛋白在1ml ph＝7.5 20mm tri
‑
hcl 50mm nacl的缓冲体系中室温孵育1小时。两者结合后的单体蛋白大小为70kda。
[0166]
二、实验结果
[0167]
结果如图9所示rbd和自行组装成球状二十四聚体纳米颗粒的ferritin，在运用gvtag/sdcatcher、pstag/sdcatcher和satag/sdcatcher效的提高了原先spytag/spycatcher系统结合效率低的不足，并且gvtag/sdcatcher系统时两者的蛋白结合效率最好，但结合效率不如优化的spytag003/spycatcher003系统。
[0168]
实施例4优化后的gvtag/sdcatcher系统在sars
‑
cov
‑
2新型冠状病毒s蛋白的受体结合区(rbd)亚单位纳米疫苗系统上的应用
[0169]
一、实验方法
[0170]
将gvtag序列的n端添加rvg三个氨基酸，构成18个氨基酸的gvtag001肽标签(氨基酸序列为seq id no:44所示：rvgntivmvdklkevptp)，将gvtag序列的n端添加kkvg三个氨基酸，构成19个氨基酸的gvtag002肽标签(氨基酸序列为seq id no：45所示：kkvgntivmvdklkevptp)，将gvtag序列的n端添加kvg三个氨基酸，构成18个氨基酸的gvtagopti肽标签(氨基酸序列为seq id no：46所示：kvgntivmvdklkevptp)得到3种人工改造的gvtag(氨基酸序列分别为seq id no：44到46所示)。
[0171]
将3种人工改造的gvtag(氨基酸序列分别为seq id no：44到46所示)分别与rbd按照图3示意图构建gvtag001
‑
rbd，gvtag002
‑
rbd和gvtagopti
‑
rbd融合蛋白克隆，将gvtag001
‑
rbd，gvtag002
‑
rbd和gvtagopti
‑
rbd核苷酸序列的5’端加上分泌肽sp的编码序
列，3’端加上翻译终止密码子，得到sp
‑
gvtag001
‑
rbd
‑
his，sp
‑
gvtag002
‑
rbd
‑
his和sp
‑
gvtagopti
‑
rbd
‑
his，其编码的氨基酸序列分别如seq id no：47到49所示，后克隆到添加intron以及wpre增强表达的表达载体(pcdna3.1
‑
intron
‑
wpre)的xho i和xba i酶切位点之间，分别构建表达载pcdna3.1
‑
intron
‑
sp
‑
gvtag001
‑
rbd
‑
his
‑
ires
‑
gfp
‑
wpr、pcdna3.1
‑
intron
‑
sp
‑
gvtag002
‑
rbd
‑
his
‑
ires
‑
gfp
‑
wpr、和pcdna3.1
‑
intron
‑
sp
‑
gvtagopti
‑
rbd
‑
his
‑
ires
‑
gfp
‑
wpre。
[0172]
seq id no:47(融合蛋白sp
‑
gvtag001
‑
rbd
‑
his的氨基酸序列)：
[0173]
mgilpspgmpallslvsllsvllmgcvagsgrvgntivmvdklkevptpgsgrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfhhhhhh；
[0174]
seq id no:48(融合蛋白sp
‑
gvtag002
‑
rbd
‑
his的氨基酸序列)：
[0175]
mgilpspgmpallslvsllsvllmgcvagsgkkvgntivmvdklkevptpgsgrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfhhhhhh；
[0176]
seq id no:49(融合蛋白sp
‑
gvtagopti
‑
rbd
‑
his的氨基酸序列)：
[0177]
mgilpspgmpallslvsllsvllmgcvagsgkvgntivmvdklkevptpgsgrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfhhhhhh。
[0178]
按实施例3的方法表达分别纯化gvtag001
‑
rbd、gvtag002
‑
rbd和gvtagopti
‑
rbd蛋白。将5nmol纯化好的gvtag001
‑
rbd、gvtag002
‑
rbd和gvtagopti
‑
rbd蛋白分别与实施例3原核表达的5nmol的sdcatcher
‑
hpf蛋白在1ml ph＝7.5 20mm tri
‑
hcl 50mm nacl的缓冲体系中室温孵育1小时。
[0179]
二、实验结果
[0180]
结果如图10所示。用本实施例的gvtagopti/sdcatcher(seq id no：46和seq id no:5)系统得到的gvtag003
‑
rbd
‑
sdcatcher
‑
hpf多聚体抗原蛋白比用实施例3的gvtag/sdcatcher系统、本实施例的gvtag001/sdcatcher(seq id no：44和seq id no:5)系统和本实施例的gvtag002/sdcatcher(seq id no：44和seq id no:5)系统得到的结合多聚体抗原蛋白要多。
[0181]
实施例5gvtagopti/sdcatcher系统和spytag003/spycatcher003系统的结合效率的比较
[0182]
一、实验方法
[0183]
将5nmol实施例4得到的gvtagopti
‑
rbd蛋白与5nmol实施例3的sdcatcher
‑
hpf结合后的蛋白，用ph＝7.5 20mm tri
‑
hcl 50mm nacl缓冲液进行稀释，稀释的比例为1：2、1：5和1：10。具体的操作步骤：将5nmol实施例4得到的gvtagopti
‑
rbd蛋白与5nmol实施例3的sdcatcher
‑
hpf在1ml 20mm tri
‑
hcl 50mm nacl缓冲体系中室温孵育结合1h得到a液，随后将50μl的结合a液加到50μl的20mm tri
‑
hcl 50mm nacl缓冲液中(1:2稀释)得到b液，将40μ
l的结合b液加到60μl的20mm tri
‑
hcl 50mm nacl缓冲液中(1:5稀释)得到c液，将50μl的结合c液加到50μl的20mm tri
‑
hcl 50mm nacl缓冲液中(1:10稀释)得到d液。随后用枪头各吸20μl的b液，c液和d液到3个1.5ml ep管中，各加5μl 5
×
loading进行100度蛋白煮样。煮5分钟后每个样本上20μl进行蛋白电泳和考马斯亮蓝验证。
[0184]
同样的将5nmol的spytag003
‑
rbd蛋白与5nmol的spycatcher003
‑
hpf结合后的蛋白用ph＝7.5 20mm tri
‑
hcl 50mm nacl缓冲液进行稀释，稀释的比例为1：2、1：5和1：10。具体的操作步骤同上。将结合稀释后的蛋白依次进行比较。
[0185]
二、实验结果
[0186]
结果如图11所示，在sars
‑
cov
‑
2新型冠状病毒rbd亚单位纳米疫苗系统上实施例4的gvtagopti/sdcatcher(seq id no：46和seq id no：5)系统结合效率比spytag003/spycatcher003系统更强。
[0187]
实施例6
[0188]
一、实验方法
[0189]
将实施例4得到的纯化好的gvtagopti
‑
rbd
‑
sdcatcher
‑
hpf多聚体抗原，实施例3得到的纯化好的pstag
‑
rbd
‑
sdcatcher
‑
hpf多聚体抗原和satag
‑
rbd
‑
sdcatcher
‑
hpf，使用siperose6 increase10/300gl柱子(ge)进行分子筛层析进行纯化，获得二十四聚体rbd
‑
hpf蛋白(如图12所示)，分子筛层析的缓冲液是：ph＝7.5，20mm tri
‑
hcl 50mm nacl。目的蛋白浓缩后，按照表2用ph＝7.5 20mm tri
‑
hcl 50mm nacl至100μl，并与等体积alum佐剂进行分组乳化。
[0190]
表2：
[0191]
抗原/对照抗原含量佐剂动物数量(只)pbs0alum5spytag003
‑
rbd(单体)0.2nmalum5gvtagopti
‑
rbd
‑
sdcatcher
‑
hpf(实施例4)0.2nmalum5pstag
‑
rbd
‑
sdcatcher
‑
hpf(实施例3)0.2nmalum5satag
‑
rbd
‑
sdcatcher
‑
hpf(实施例3)0.2nmalum5spytag003
‑
rbd
‑
spycatcher003
‑
hpf0.2nmalum5
[0192]
然后对6～8周龄的balb/c小鼠进行分组免疫。通过皮下注射的方式，每只小鼠200μl的接种体积。第14天，对小鼠进行眼眶取血。小鼠血清在静置一段时间待血清析出后，通过4℃，2800rpm离心15分钟获得，立刻用于anti
‑
rbd igg elisa检测实验。
[0193]
二、实验结果
[0194]
结果如图13所示，本发明通过gvtagopti/sdcatcher系统(seq id no：46和seq id no:5)，pstag/sdcatcher系统(seq id no:13和seq id no:5)，satag/sdcatcher(seq id no:14和seq id no:5)和spytag003/spycatcher003系统异肽键连接的rbd
‑
hpf蛋白分别与alum佐剂乳化后，经一次免疫14天即可激发小鼠体液免疫，与没有应用异肽键连接系统的rbd单体相比，通过gvtagopti/sdcatcher系统，pstag/sdcatcher系统，satag/sdcatcher和spytag003/spycatcher003系统异肽键连接的rbd
‑
hpf蛋白产生了高滴度的anti
‑
rbd igg，免疫原性远高于rbd单体。
[0195]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保
护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。