一种能够快速产酸的菌种组合、包含其的冻干菌粉及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，涉及一种能够快速产酸的菌种组合、包含其的冻干菌粉及其应用。


背景技术：

2.乳酸菌饮料是指以乳或乳制品为原料，经乳酸菌发酵制得的乳液中加入水，以及食糖和(或)甜味剂、酸味剂、果汁、茶、咖啡、植物提取液等的一种或几种调制而成的饮料。根据其是否经过杀菌处理而区分为杀菌(非活菌)型和未杀菌(活菌)型。随着人们对膳食均衡和肠道健康的重视，乳酸菌饮料越来越受到消费者亲睐。近年来，乳酸菌饮料市场发展快速，并维持较高的增长态势，为进一步提高生产效率，从业人员致力于研究如何在保证产品质量的同时降低生产成本。
3.乳酸菌饮料的生产成本跟生产工艺直接相关，一般乳酸菌饮料的生产过程如下：配置乳基料(脱脂奶粉加水复原)
→
均质
→
杀菌
→
接种乳酸菌菌种发酵
→
按照1份乳基料加入3-4份糖水(加甜味剂、酸味剂、果汁、香精等混合)比例二次调配
→
杀菌或不杀菌
→
罐装(成品酸度约为60-70
°
t)。其中，接种乳酸菌菌种后的发酵时间对生产成本有直接影响，发酵时间越长，意味着生产乳酸菌饮料时投入的人工、能耗、设备折旧等成本越高。发酵时间跟乳酸菌的产酸特性密切相关，接种产酸速度快的乳酸菌可以缩减发酵时间，从而降低生产成本。
4.乳酸菌不能直接利用外源蛋白质和无机氮源，必须通过水解外源蛋白质或肽，提供菌体正常生长代谢对氨基酸对需要，蛋白水解力的强弱与菌株的酶系相关，影响菌体的生长性能。目前，生产短时发酵的乳酸菌饮料所用的发酵菌株以嗜热链球菌为与保加利亚乳杆菌(又名德氏乳杆菌保加利亚亚种)为主，能使乳基料在较短的时间内(6h)达到较低的ph(≤4.6)和较高的酸度(≥70
°
t)。然而，由于嗜热链球菌耐酸性较差，而保加利亚乳杆菌生长缓慢，导致想要在此基础上继续提高乳基料的酸度变得十分困难，通常将4.0％蛋白的乳基料发酵达到100-120
°
t至少需要发酵10h，如果继续延长发酵时间，酸度也将不再增加。这是因为，环境ph下降，导致菌种的蛋白水解酶活性降低，导致乳基料中小分子肽和氨基酸等营养素的不足，因此导致嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌耐酸和产酸能力下降。为获得更高的酸度，有些企业在二次调配的过程中补充大量的酸味剂来弥补因缩短发酵时间导致的产酸不足，但是这种工艺会影响饮料的口感，因为额外补充的酸味剂远不如发酵产生的酸味丰富、柔和。
5.因此，如何提供一种能够快速产酸的菌剂，将其用于制备乳酸菌饮料，以缩短发酵周期，从而降低生产成本和提升产品口感，成为了本领域目前迫切需要解决的问题。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种能够快速产酸的菌种组合、包含其的冻干菌粉及其应用。
7.本发明所述快速产酸是指：以蛋白含量为4.0％的乳基料(脱脂乳粉与水的混合物)为例，接种所述菌种组合或冻干菌粉，接种量为60000亿cfu/吨，在43℃条件下发酵，发酵至乳基料酸度为100
°
t以上仅需要6h，如果继续发酵至12h，乳基料酸度可达到180
°
t以上。
8.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
9.第一方面，本发明提供一种能够快速产酸的菌种组合，所述能够快速产酸的菌种组合包括嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和干酪乳杆菌；
10.所述干酪乳杆菌命名为干酪乳杆菌(lactobacillus casei)lc16菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24110，保藏日期为2021年12月15日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
11.优选地，所述干酪乳杆菌、嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌的活菌数之比为(5-10):(5-10):(1-5)。
12.上述(5-10)中的具体数值例如5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10等。
13.上述(1-5)中的具体数值例如1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5等。
14.优选地，所述能够快速产酸的菌种组合还包括瑞士乳杆菌，所述瑞士乳杆菌命名为瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)lh76菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.18796，保藏日期为2019年11月04日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
15.优选地，所述瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌的活菌数之比为(1-5):(5-10):(5-10):(1-5)。
16.第二方面，本发明提供一种能够快速产酸的冻干菌粉，所述能够快速产酸的冻干菌粉中包括如第一方面所述的能够快速产酸的菌种组合。
17.优选地，在所述冻干菌粉中，干酪乳杆菌的活菌数为500-1000亿cfu/g，例如500亿cfu/g、600亿cfu/g、700亿cfu/g、800亿cfu/g、900亿cfu/g、1000亿cfu/g等。
18.第三方面，本发明提供如第一方面所述的能够快速产酸的菌种组合或如第二方面所述的能够快速产酸的冻干菌粉在制备发酵食品中的应用。
19.所述发酵食品包括谷物发酵制品(米酒、米醋等)、豆类发酵制品(豆乳等)和乳类发酵制品(例如乳酸菌饮料等)。
20.第四方面，本发明提供一种乳酸菌饮料，所述乳酸菌饮料的制备原料包括发酵菌剂、脱脂乳粉、水和添加剂；
21.所述发酵菌剂包括如第一方面所述的能够快速产酸的菌种组合和/或如第二方面所述的能够快速产酸的冻干菌粉。
22.优选地，所述添加剂包括甜味剂、酸味剂、白砂糖、水果汁、蔬菜汁或香精中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如白砂糖与水果汁的组合、白砂糖与蔬菜汁的组合、甜味剂与水果汁的组合等，其他任意的组合方式均可。
23.所述甜味剂例如阿斯巴甜、甜菊糖、木糖醇等。
24.所述酸味剂例如柠檬酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸钠等。
25.第五方面，本发明提供一种如第四方面所述的乳酸菌饮料的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
26.(1)将脱脂乳粉与水混合，杀菌，得乳基料；
27.(2)将发酵菌剂接种入乳基料中，发酵，与添加剂混合，即得。
28.优选地，步骤(2)所述发酵的温度为40-45℃，所述发酵的时间为4-12h。
29.上述40-45℃中的具体数值例如40℃、40.5℃、41℃、41.5℃、42℃、42.5℃、43℃、43.5℃、44℃、44.5℃、45℃等。
30.上述4-12h中的具体数值例如4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h等。
31.优选地，步骤(1)所述混合的温度为45-65℃，所述混合的时间为20-40min。
32.上述45-65℃中的具体数值例如45℃、47℃、49℃、51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、61℃、63℃、65℃等。
33.上述20-40min中的具体数值例如20min、22min、24min、26min、28min、30min、32min、34min、36min、38min、40min等。
34.优选地，所述杀菌为巴氏杀菌。
35.优选地，所述杀菌在90-98℃下进行3-8min。
36.上述90-98℃中的具体数值例如90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃等。
37.上述3-8min中的具体数值例如3min、4min、5min、6min、7min、8min、等。
38.优选地，所述乳基料中的蛋白质的质量百分含量为3％-5％，例如3％、3.2％、3.4％、3.6％、3.8％、4％、4.2％、4.4％、4.6％、4.8％、5％等。
39.优选地，发酵菌剂在乳基料中的接种量为5-100g/t，例如5g/t、10g/t、20g/t、30g/t、40g/t、50g/t、60g/t、70g/t、80g/t、90g/t、100g/t等。
40.优选地，所述乳酸菌饮料包括短时发酵的杀菌型或活菌型的乳酸菌饮料。所述短时发酵是指发酵时间为4-9h，例如4h、5h、6h、7h、8h、9h等。
41.本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
42.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
43.本发明创造性地将具有强蛋白水解能力的干酪乳杆菌lc16与嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌组合，形成的菌种组合用于制备乳酸菌饮料等发酵食品时，能够快速产酸，从而缩短达到指定酸度需要的时间或在同样的发酵时间内达到更高的酸度，进而降低生产成本，同时还可显著提升产品口感。具体地，以蛋白含量为4.0％的脱脂乳基料(脱脂乳粉与水的混合物)为例，在43℃条件下发酵，在接种量相同的前提下，采用市售的用于乳酸菌饮料发酵的菌剂(一般为嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的组合)发酵至100-120
°
t通常需要12h，而采用本发明提供的复配酪乳杆菌lc16的菌种组合，发酵至100-120
°
t仅需要6h，如果继续发酵至12h，其乳基料酸度可达到180-200
°
t，可以达到减少或不使用酸味剂的目的，从而给最终的乳酸菌饮料产品带来更柔和的口感。
44.此外，本发明还发现，干酪乳杆菌lc16、嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌的组合中添加同样具有强蛋白水解能力的瑞士乳杆菌lh76，得到的菌种组合具有更好的快速产酸能力及改善发酵产品综合质量的能力，这可能是因为干酪乳杆菌lc16、瑞士乳杆菌lh76能够相互促进生长与代谢，具有协同增效的作用。
具体实施方式
45.为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
46.以下实施例中，若无特殊说明，所以的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
47.实施例1-测试菌种的蛋白水解能力
48.本实施例对70株乳杆菌的蛋白水解能力进行对比测试。
49.(1)从菌种资源库中选取分离自传统发酵乳制品的菌株共70株，包括10株植物乳杆菌、10株鼠李糖乳杆菌、15株干酪乳杆菌、10株副干酪乳杆菌、10株罗伊氏乳杆菌、5株发酵乳杆菌和10株瑞士乳杆菌。菌种资源库为微康益生菌股份有限公司自行筹建，所有菌株均置于甘油管或冻干管中，于-80℃保存。
50.(2)将甘油管保存的菌种按3％比例接种于mrs液体培养基中，37℃静置培养16-24h，活化2代。将活化好的种子以3％接种到mrs液体培养基中，37℃培养10h，将菌液6000r/min离心15min，弃去上清液，收集菌泥，加入灭菌生理盐水重悬，控制菌浓度为109cfu/ml左右，得菌悬液。
51.(3)将脱脂乳粉与水混合(12％，w/v)，55℃下水合30min，巴氏杀菌(95℃，5min)，冷却至40℃，接种步骤(2)得到的菌悬液，接种量为1％(v/v)，40℃恒温发酵10h得发酵乳基料。
52.(4)酪氨酸标准曲线制作：以蒸馏水为溶剂，准确配制质量浓度分别为0、200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml的酪氨酸溶液。用移液枪分别移取150μl不同质量浓度的酪氨酸溶液，加入3ml邻苯二甲醛(o-phthal-dialdehyde，opa)试剂，混匀后室温(25℃)条件下反应2min，在波长340nm处测定吸光度值。平行3次取平均值，以酪氨酸的质量浓度(x)为横坐标，吸光度值(y)为纵坐标，制作标准曲线。
53.样品测定：吸取2.5ml的发酵乳基料于试管中，加入0.5ml蒸馏水，再加入0.75mol/l的三氯乙酸5ml，混匀，室温静置10min后，4000r/min离心5min。取上清液测定吸光度值，查标准曲线计算相当于酪氨酸的含量，酪氨酸产量越高代表菌种水解蛋白的能力越强。
54.测试结果见表1。
55.表1
56.[0057][0058]
结果显示，干酪乳杆菌lc16(酪氨酸含量663.2mg/l)、副干酪乳杆菌lc003(酪氨酸含量582.1mg/l)和瑞士乳杆菌lh76(酪氨酸含量680.1mg/l)的蛋白水解能力显著强于其他测试菌株，可作为用于短时发酵的候选菌株。
[0059]
实施例2-测试菌种组合的快速产酸能力
[0060]
分别将上述干酪乳杆菌lc16、副干酪乳杆菌lc003和瑞士乳杆菌lh76与嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌组合成为含有三种菌的菌种组合，测试菌种组合的快速产酸能力，具体步骤如下：
[0061]
(1)分别将甘油管保存的菌种(干酪乳杆菌lc16、副干酪乳杆菌lc003和瑞士乳杆菌lh76)按2％比例接种于mrs液体培养基中，37℃静置培养，活化2代。将活化好的种子以2％接种到mrs液体培养基中，37℃培养12h，将菌液8000r/min离心10min，弃去上清液，收集菌泥，按照菌泥:保护剂＝1:2的质量比加入冻干保护剂(15％海藻糖水溶液)，经过乳化后，进行真空冷冻干燥，分别得到活菌数大于1000亿cfu/g的干酪乳杆菌lc16冻干菌粉、副干酪乳杆菌lc003冻干菌粉和瑞士乳杆菌lh76冻干菌粉。
[0062]
嗜热链球菌冻干粉购自科汉森嗜热链球菌型号。
[0063]
保加利亚乳杆菌冻干粉购自润盈生物工程(上海)有限公司lb-g40型号。
[0064]
(2)分别将干酪乳杆菌lc16冻干菌粉、副干酪乳杆菌lc003冻干菌粉、瑞士乳杆菌lh76冻干菌粉与嗜热链球菌冻干粉和保加利亚乳杆菌冻干粉复配，具体方案见表2。
[0065]
表2
[0066][0067]
(3)将脱脂乳粉与水混合(12％，w/v)，55℃下水合30min，巴氏杀菌(95℃，5min)，冷却至43℃，分别接种步骤(2)得到的各冻干菌粉组合以及三种市售菌剂(市场上公开销售的用于短时发酵乳酸菌饮料的菌剂，总活菌数为2000亿cfu/g)，接种量为30g/t，43℃恒温发酵12h，得发酵乳基料，并取样跟踪发酵过程中的滴定酸度。结果见表3。
[0068]
表3
[0069][0070]
结果显示：组合1(嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌二者复配)与市售菌剂的发酵产酸速度比较接近，相比之下，组合2-14(在嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的基础上进一步复配干酪乳杆菌lc16、副干酪乳杆菌lc003或瑞士乳杆菌lh76)的产酸速度显著加快。
[0071]
由组合2、5、6的对比结果可知，在配比一致的前提下，复配干酪乳杆菌lc16的菌种组合产酸速度(6h可以达到101
°
t，12h可以达到180
°
t)显著快于其他组合。
[0072]
由组合2、7、8、9、10的对比结果可知，要达到最快的产酸效果，3种菌种需要维持一定的比例，在干酪乳杆菌lc16的接种量一定的情况下，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌如果接种量过低或过高，都会影响产酸速度，这可能是因为3种菌株之间在发酵过程中存在某种代谢平衡。当干酪乳杆菌lc16、嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌的活菌数之比在(5-10):(5-10):(1-5)的范围内时，菌种组合能够达到较快的产酸速度。
[0073]
由组合2、6、11、14的对比结果可知，将瑞士乳杆菌lh76、干酪乳杆菌lc16、嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌进行复配，得到的菌种组合具有更好的快速产酸能力，这可能是因为干酪乳杆菌lc16、瑞士乳杆菌lh76能够相互促进生长与代谢，具有协同增效的作用。
[0074]
实施例4-乳酸菌饮料的口感测试
[0075]
将实施例3中发酵12h后得到的各组发酵乳基料，按照可公开查阅的常规的乳酸菌饮料调制工艺，调配成蛋白含量1.0％、酸度60
°
t、白砂糖含量10％的杀菌型乳酸菌饮料。
[0076]
选取20名感官评定人员对调配后的乳酸菌饮料进行感官评定，评定标准如表4所示(总分100分)。
[0077]
表4
[0078][0079][0080]
评定结果(取平均值，取整数)见表5。
[0081]
表5
[0082]
菌种类型气味滋味质地/色泽口感合计组合12320181273组合22428191889组合32527181888组合42427181887组合52321191578组合62423181479组合72423181378组合82223181477组合92219171371组合102322181578组合112629191993组合122629181891组合132728191892组合142526181786市售菌剂12421181073市售菌剂22520191377市售菌剂32619181578
[0083]
结果显示：组合2、3、4制得的乳酸菌饮料的感官评分显著高于组合1、组合5-10以及市售菌剂，说明将干酪乳杆菌lc16、嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌进行合理复配得到的菌种组合，在提高发酵产酸速度的同时，也显著改善了了了发酵得到的乳酸菌饮料的综合
质量，提升了感官体验。
[0084]
组合11-13制得的乳酸菌饮料的感官评分相较于组合2-4又有了进一步提升，说明将瑞士乳杆菌lh76、干酪乳杆菌lc16、嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌进行复配，得到的菌种组合进一步改善了发酵得到的乳酸菌饮料的综合质量，提升了感官体验。
[0085]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种能够快速产酸的菌种组合、包含其的冻干菌粉及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0086]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。