一种具有二甲基二硫醚降解能力的假单胞菌GDUTAN12菌株及其应用的制作方法

isolated bacillus cereus gigan2and identification of transformation intermediates[j].bioresource technology，2015，175:563－568.doi:10.1016/j.biortech.2014.11.002.)。chen等通过在生物滴滤反应器内接种bacillus cereus gigan2和优化填料，提高了二甲基二硫醚的降解效率(chen x，liang z，an t，et al.comparative elimination of dimethyl disulfide by maifanite and ceramic-packed biotrickling filters and their response to microbial community[j].bioresource technology，2016，202:76－83.doi:10.1016/j.biortech.2015.11.081.)。为进一步提高二甲基二硫醚的降解效率，提高生物降解除臭的适用性，广泛筛选降解效率高的二甲基二硫醚降解菌，在治理恶臭有机含硫废水和废气净化方面具有非常重要的意义。


技术实现要素：

[0006]
本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种具有二甲基二硫醚降解能力的假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株及其应用。
[0007]
本发明的第一个目的是提供一种具有二甲基二硫醚降解能力的假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株。
[0008]
本发明的第二个目的是提供所述假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株或其菌液在降解环境中的二甲基二硫醚中的应用。
[0009]
本发明的第三个目的是提供所述假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株或其菌液在制备降解环境中的二甲基二硫醚的制剂中的应用。
[0010]
本发明的第四个目的是提供一种降解环境中的二甲基二硫醚的方法。
[0011]
本发明的第五个目的是提供一种修复由二甲基二硫醚引起的环境污染的制剂。
[0012]
本发明的第六个目的是提供所述假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株或其菌液在二甲基二硫醚废气处理中的应用。
[0013]
本发明的第七个目的是提供一种用于处理二甲基二硫醚废气的制剂。
[0014]
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
[0015]
本发明提供了一种具有二甲基二硫醚降解能力的假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株，所述菌株于2021年08月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号(武汉大学)，保藏编号为cctcc no：m20211019。所述假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株的16rdna的核苷酸序列如seq id no.1所示。所述假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株在na固体培养基培养24h后，形成圆形、白色、不透明且边缘整齐的菌落，菌落直径为0.5～1.0mm。
[0016]
本发明在对厨余垃圾处理厂的垃圾渗滤液中的微生物进行筛选、分离和纯化的过程中，得到了一种具有二甲基二硫醚降解能力的假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株。不同初始浓度的二甲基二硫醚降解实验表明，本发明所述假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株对二甲基二硫醚具有良好的降解效果。其在120h对浓度为20mg/l的二甲基二硫醚的降解率为99.3％，在120h对浓度低于15mg/l的二甲基二硫醚的降解率可达100％，降解率高。除环境介质中含有二甲基二硫醚外，二甲基二硫醚生产过程所产生的废气里，也含有二甲基二硫醚。因此，可将本发明所述假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株直接或
通过制备相应的制剂，用于降解气体，水体或土壤等环境介质中的二甲基二硫醚，进行环境修复，减轻环境污染，也可以用于二甲基二硫醚生产中生产废气的处理，应用前景广阔。
[0017]
因此，本发明申请保护假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株的以下应用：
[0018]
本发明申请保护假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株或其菌液在降解环境中的二甲基二硫醚中的应用。
[0019]
本发明还申请保护假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株或其菌液在制备降解环境中的二甲基二硫醚的制剂中的应用。
[0020]
具体地，所述环境为大气、水体或土壤。
[0021]
本发明还提供了一种降解环境中的二甲基二硫醚的方法，通过将假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株或其菌液施加到含二甲基二硫醚的待修复环境中进行降解修复。
[0022]
具体地，所述环境为大气、水体或土壤。
[0023]
本发明还提供了一种修复由二甲基二硫醚引起的环境污染的制剂，所述制剂中含有假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株或其菌液。
[0024]
本发明还申请保护假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株或其菌液在二甲基二硫醚废气处理中的应用。
[0025]
本发明还提供了一种用于处理二甲基二硫醚废气的制剂，所述制剂中含有所假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株或其菌液。
[0026]
本发明具有以下有益效果：
[0027]
本发明在对厨余垃圾处理场的垃圾渗滤液中的微生物进行筛选、分离和纯化的过程中，得到了一株具有二甲基二硫醚降解能力的细菌。鉴定结果表明，本发明所得细菌为假单胞菌(pseudomonas sp.)，故将其命名为假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株，并于2021年08月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号(武汉大学)，保藏编号为cctcc no：m20211019。所述假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株对二甲基二硫醚具有良好的降解效果，在120h对20mg/l二甲基二硫醚的降解率为99.3％，在120h对浓度低于15mg/l的二甲基二硫醚的降解率可达100％，可将本发明所述假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株用于环境修复，降解气体，水体或土壤等环境介质中二甲基二硫醚，减轻环境污染，也可以用于二甲基二硫醚生产废气的处理，应用前景广阔。
附图说明
[0028]
图1为本发明所述假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株在电子扫描显微镜下的形态图。
具体实施方式
[0029]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0030]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0031]
实施例1菌株的分离培养
[0032]
本发明所述假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株是对厨余垃圾处理场的垃圾渗滤液中的微生物进行筛选、分离和纯化得到的。具体的筛选、分离和纯化步骤如下所示：
[0033]
(1)配制无机盐培养基(无机盐培养基中含有：k2hpo4·
3h2o 0.12g，kh2po
4 0.12g，nh4cl 0.04g，mgso4·
7h2o 0.02g，feso4·
7h2o 0.001g，cacl2·
2h2o 0.2g/l，mnso4·
4h2o 0.2g/l，cuso4·
2h2o 0.01g/l，znso4·
7h2o 0.2g/l，cocl2·
6h2o 0.09g/l，na2moo4·
2h2o 0.12g/l，h3bo
3 0.006g/l)，在无机盐培养基中添加一定量的二甲基二硫醚作为驯化底物，用于筛选具有二甲基二硫醚降解能力的菌株；
[0034]
(2)取10ml垃圾渗滤液，加入含二甲基二硫醚的无机盐培养基(dmds终浓度为5mg/l)中，37℃条件下驯化5天后，以10％的接种量移入下一浓度中接着驯化，以此类推，逐步提高浓度进行驯化。用于驯化的培养基中，驯化底物(dmds)的浓度依次为5mg/l、8mg/l、10mg/l、15mg/l、20mg/l和25mg/l；
[0035]
(3)驯化结束后，将驯化所得菌液稀释10-1
～10-7
倍，分别取稀释倍数为10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
的稀释菌液各0.2ml，将菌液均匀涂布在以二甲基二硫醚为碳源的固体培养基中，挑选生长状态良好的单菌落富集培养后进行降解实验，将具有二甲基二硫醚降解效果，且降解效果最好的单菌落进行保存并做菌种鉴定。
[0036]
实施例2菌种鉴定
[0037]
本发明对实施例1中筛选分离得到的菌株分别进行了生理生化鉴定和分子鉴定。
[0038]
1、生理生化鉴定
[0039]
本发明利用电子显微镜对菌体的形态进行了观察，结果如图1所示。由图1可知，本发明筛选分离所得菌株的菌体为长杆状，有鞭毛。
[0040]
本发明通过在na固体培养基(牛肉粉3g/l、蛋白胨10g/l、nacl 5g/l)上培养筛选分离所得菌株，观察其菌落形态发现，所述菌株在培养基上的菌落为圆形，边缘整齐，白色，不透明，菌落直径为0.5～1.0mm。
[0041]
本发明参照《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版，对所得菌株的生理生化指标进行了检测，检测指标即结果如表1所示：
[0042]
表1生理生化检测指标及结果
[0043][0044]
注：反应状态分为阳性和阴性，阳性形状编码为“ ”，阴性形状编码为
“‑”
。
[0045]
2、分子鉴定
[0046]
本发明利用细菌dna提取试剂盒提取了筛选所得菌株的基因组dna，以该基因组dna为模板，利用细菌的16s rdna通用引物27f(5'-agtttgatcmtggctcag-3')和1492r(5'-ggttaccttgttacgactt-3')扩增得到了所述菌株的16s rdna。将所得pcr产物送公司测序，测序结果如下(seq id no.1)所示，此序列即为该菌株的16s rdna序列。
[0047]
seq id no.1：
[0048]
tgaatcctccgtggtaccgtccccccgaaggttagactagctacttctggagcaacccactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgtgacattctgattcacgattactagcgattccgacttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccggactacgatcggttttatgggattagctccacctcgcggcttggcaaccctttgtaccgaccattgtagcacgtgtgtagcccaggccgtaagggccatgatgacttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctccttagagtgcccaccttaacgtgctggtaactaaggacaagggttgcgctcgttacgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtgtcagagttcccgaaggcaccaatccatctctggaaagttctctgcatgtcaaggcctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcatttgagttttaaccttgcggccgtactccccaggcggtcgacttaatgcgttagctgcgccactaagatctcaaggatcccaacggctagtcgacatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcacctcagtgtcagtattagcccaggtggtcgccttcgccactggtgttccttcctatatctacgcatttcaccgctacacaggaaattccaccaccctctgccatactctagctcgccagttttggatgcagttcccaggttgagcccggggctttcacatccaacttaacgaaccacctacgcgcgctttacgcccagtaattccgattaacgcttgcacccttcgtattaccgcggctgctggcacgaagttagccggtgcttattctgttggtaacgtcaaaacagcaaggtattaacttactgcccttcctcccaacttaaagtgctttacaatccgaagaccttcttcacacacgcggcatggctggatcaggctttcgcccattgtccaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctggaccgtgtctcagttccagtgtgactgatcatcctctcagaccagttacggatcgtcgccttggtgagcctttacctcaccaactagctaatccgacctaggctcatctgatagcgtgaggtccgaagatcccccactttctcccgtaggacgtat
gcggtattagcgttcctttcgaaacgttgtcccccactaccaggcagattcctaggcattactcacccgtccgccgctgaatcatggagcaagctccactcatccgctcgacttgcatgtgttaaggcctgcccgccagcgttcaatctgagcatggaaccaaactaaagtagg
[0049]
将测序结果进行比对发现，本发明所得菌株的16s rrna基因序列与genbank中已登录的pseudomonas stutzeri strain mn1的最为相似，相似度为99.73％。综合生理生化鉴定结果和分子鉴定结果可知，本发明筛选分离所得菌株为革兰氏阴性菌，属假单胞菌(pseudomonas sp.)，故将该菌株命名为假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株。该菌株已于2021年8月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号(武汉大学)，菌株保藏编号为cctcc no：m20211019。
[0050]
实施例3二甲基二硫醚降解能力测定
[0051]
本发明对筛选得到的假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株对二甲基二硫醚的降解能力进行了测定。
[0052]
在顶空瓶中配制无机盐培养基(无机盐培养基配方同实施例1)，121℃高压灭菌20min；将筛选到的假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株在营养肉汤培养基(na液体培养基)中进行富集增菌培养，培养24h后离心收集菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤三次；以10％接种量将所得菌体悬浮在装有100ml无机盐培养基的血清瓶中，在瓶中分别加入二甲基二硫醚溶液，使二甲基二硫醚的终浓度分别为5mg/l、8mg/l、10mg/l、15mg/l、20mg/l、25mg/l，加盖密封；在温度为37℃，振动频率为150r/min的摇床中培养进行降解试验；定期取样测定气相中二甲基二硫醚的浓度，并利用亨利定律来检测其在液相中的降解率。
[0053]
检测条件为：含氢焰离子化检测器(fid)gc9800气相色谱仪(at.se-54毛细管柱，30m
×
0.25mm
×
0.25μm)，检测器温度200℃，进样口气化室温度150℃，柱炉温度120℃。采用agilent 500μl气密针进样，进样量为500μl，不分流模式。
[0054]
假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株对二甲基二硫醚的降解率测定结果如表2所示：
[0055]
表2不同初始浓度的二甲基二硫醚的降解率
[0056]
二甲基二硫醚浓度降解率5mg/l100％8mg/l100％10mg/l100％15mg/l100％20mg/l99.3％25mg/l50.8％
[0057]
从假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株对不同初始浓度的二甲基二硫醚的降解率(表2)数据中可以看出，本发明经筛选、分离和纯化得到的假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株具有良好的二甲基二硫醚降解能力。其在120h对浓度为20mg/l的二甲基二硫醚的降解率为99.3％，在120h对浓度为15mg/l、10mg/l、8mg/l、5mg/l的二甲基二硫醚的降解率可达100％，表明本发明所述菌株对二甲基二硫醚的降解效率高，降解能力良好。因此，可将本发明所述假单胞菌(pseudomonas sp.)gdutan12菌株用于环境修复，降解气体，水体或土壤等环境介质中二甲基二硫醚，减轻环境污染，也可以用于二甲基二硫醚生产
废气的处理，应用前景广阔。
[0058]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。