一种靶向VEGFR2的gRNA及其应用的制作方法

一种靶向vegfr2的grna及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种靶向vegfr2的grna及其应用。


背景技术：

2.目前，多种疾病例如增生性糖尿病视网膜病变、成熟性视网膜病变、与年龄相关的湿性黄斑变性、肿瘤、糖尿病肾病、类风湿性关节炎、牛皮癣皮肤、卵巢过度刺激综合征等，均与异常的血管生成有关，而血管生成由血管内皮生长因子(vegf)与许多受体结合进行调节。其中，年龄相关性黄斑变性(amd)导致不可逆转的视力损伤，已成为全球50岁以上老年人的首要致盲原因。amd分为干性或称萎缩性和新生血管性或称湿性，这之中10-15％为新生血管性年龄相关性黄斑变性(namd)，是引起视力丧失的最主要原因之一。研究已证实，namd的关键分子机制是视网膜色素上皮细胞(rpe)因遗传或外界压力刺激过量表达血管内皮生长因子(vegfa)，从而激活vegfa信号通路，促进新血管生成，造成视网膜渗血，严重损伤视力。
3.vegfr的常见亚型中，vegfr1调节造血干细胞募集以及单核细胞和巨噬细胞迁移，vegfr2调节血管内皮功能，vegfr3调节淋巴内皮细胞功能。其中，vegfr2仅在内皮细胞上表达，被称为激酶插入结构域受体，是vegf诱导的内皮细胞增殖、存活、迁移、肾小管形态发生和发芽的主要介质。vegfr2的细胞外结构域中包含七个免疫球蛋白样结构域、一个跨膜区域和一个酪氨酸激酶序列，成熟的vegfr2由细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域组成。与以高亲和力结合胎盘生长因子(plgf)和vegfr1不同，vegfr2仅以高亲和力结合vegf但不结合plgf。因此，现有技术已证实，靶向阻断vegfr2可抑制namd患者的的新血管生成，达到治疗的效果。
4.目前常规治疗手段，是向玻璃体注射vegfr2抗体药，虽能有效抑制视网膜和脉络膜新血管生成和中央视力损伤的恶化，但vegfr2抗体药均需每隔1-3个月进行玻璃体注射，过于频繁的玻璃体注射以及高昂费用，带给老年人难以承受的术后生活和经济压力。crispr-cas作为第三代基因编辑技术，使用和设计更加简单，能够高效且有目的性地编辑目标基因。然而，现有技术通过化脓性链球菌来源的crispr-spcas9技术对人、鼠vegfr2的3号外显子3’端区域、18号外显子进行敲除，敲除效率低，无法达到较好的治疗效果。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处，提供一种靶向vegfr2的grna。本发明的靶向vegfr2的grna，能够阻断vegfr2，从而有效抑制视网膜和脉络膜新血管生成和中央视力损伤的恶化。
6.为了达到上述目的，采用如下技术方案：
7.一种靶向vegfr2的grna，包括与该grna的靶向序列互补的多核苷酸序列，所述grna的靶向序列选自：vegfr2第3号外显子的5’端区域、第15号外显子、第17号外显子的正义链或反义链。
8.本发明采用crispr-cas系统进行基因编辑，通过构建grna以引导crispr-cas系统在vegfr2基因外显子区域进行编辑，降低vegfr2表达效率，进而治疗vegfr2过表达导致的疾病。并且，本发明选择vegfr2第3号外显子的5’端区域，在基因编辑后可消除第3-30号外显子翻译的蛋白功能，具有编辑效率显著的优势；选择vegfr2第15号外显子、第17号外显子，具有形成显性负调控且基因编辑效率高的优势，即保留vegfr2受体胞外段与vegfr配体如vegfa结合的功能，消除胞内信号传导功能，同时达到消耗vegfr配体和阻断vegfr配体的效果。
9.在其中一个实施例中，所述grna的靶向序列选自以下区域的正义链或反义链：vegfr2第3号外显子如seq id no:67所示的5’端区域、第15号外显子如seq id no:69所示区域、第17号外显子如seq id no:70所示区域。
10.可以理解的，上述区域为靶区域，表示grna与靶序列互补的序列落入该范围或切割位点落入该范围。
11.具体的，3号外显子5’端靶区域为：
12.gggacagagggacttggactggctttggcccaataatcagagtggcagtgagcaaagggtggaggtgactgagt(seq id no:67)；
13.15号外显子靶区域为：
14.tgggaaccggaacctcactatccgcagagtgaggaaggaggacgaaggc(seq id no:69)；
15.17号外显子靶区域为：
16.ccaggccaatggaggggaactgaagacaggctacttgtccatcgtcatggatccagatgaactcccattggatgaacattgtgaacgact(seq id no:70)。
17.在其中一个实施例中，所述vegfr2第3号外显子的5’端区域的序列为：ttggactggctttggcccaataatcagagtggcagtgagcaaagggt(seq id no：68)。
18.在其中一个实施例中，所述grna靶向序列选自以下序列的正义链或反义链：
19.seq id no：1-7、9-14、68-70、125、128-131及相似性≥90％的序列。
20.在其中一个实施例中，所述grna靶向序列选自seq id no：2、4、5、6、7、9、12、13、23-64及相似性≥90％的序列。选用上述特定grna，与靶向序列不同的其他grna相比，上述grna对vegfr2具有更强的编辑效率，能有效抑制vegfr2的表达。
21.在其中一个实施例中，所述grna靶向序列选自seq id no：5、6、9、12、13、23-36、44-64及相似性≥90％的序列。上述grna对vegfr2具有优异的编辑效率。
22.本发明还提供了一种表达所述grna的表达载体。所述表达载体为质粒载体、病毒载体。所述病毒载体是逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或单纯疱疹病毒载体。
23.本发明还提供了一种靶向vegfr2的crispr-cas系统，包括所述grna和cas核酸酶。所述crispr-cas系统经由一种递送系统引入细胞，所述递送系统包括病毒粒子、脂质体、脂质体纳米颗粒、电穿孔、显微注射或缀合。
24.在其中一个实施例中，所述cas核酸酶包括cas9和/或cas12。
25.在其中一个实施例中，所述cas核酸酶包括sacas9。
26.本发明还提供了所述grna、所述grna的表达载体或所述crispr-cas系统在制备作为预防或治疗vegfr2过表达疾病药物中的应用。
27.在其中一个实施例中，所述vegfr2过表达疾病包括癌症、糖尿病肾病、类风湿性关节炎、牛皮癣皮肤、卵巢过度刺激综合征、增生性糖尿病视网膜病变、糖尿病视网膜黄斑水肿、成熟性视网膜病变、与年龄相关的湿性黄斑变性。
28.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
29.本发明的一种靶向vegfr2的grna，采用crispr-cas系统进行基因编辑，通过构建grna以引导crispr-cas系统在vegfr2基因外显子区域进行编辑，降低vegfr2表达效率，进而治疗vegfr2过表达导致的疾病。并且，本发明选择vegfr2第3号外显子的5’端区域、第15号外显子、第17号外显子作为编辑目标区域，具有高效消除vegfr2基因转录或翻译产物功能的优势。
30.并且，本发明筛选出来的grna，打靶效率更高，即对vegfr2的编辑效率更高，可采用非病毒载体，对患者更加安全，避免后期诱导癌症的风险。
31.采用本发明的grna，针对vegfr2进行基因编辑，能有效抑制vegfr2的表达，对vegfr2过表达而导致的疾病，如癌症、与年龄相关的湿性黄斑变性、糖尿病肾病、类风湿性关节炎、牛皮癣皮肤、卵巢过度刺激综合征、增生性糖尿病视网膜病变、成熟性视网膜病变等有更好的治疗效果。
附图说明
32.图1为grna#1、3在基因组上的位置(图片从左到右对应于基因组从5’端到3’端)；
33.图2为grna#2、4、5在基因组上的位置(图片从左到右对应于基因组从5’端到3’端)；
34.图3为grna#6、7在基因组上的位置(图片从左到右对应于基因组从5’端到3’端)；
35.图4为grna#8在基因组上的位置(图片从左到右对应于基因组从5’端到3’端)
36.图5为grna#9、10、11、12、13、14在基因组上的位置(图片从左到右对应于基因组从5’端到3’端)；
37.图6为grna#15在基因组上的位置(图片从左到右对应于基因组从5’端到3’端)；
38.图7构建的代表性重组vegfr2-sacas9-grna质粒的sanger测序dna峰图；
39.图8在hek293t细胞中检测通过crispr/sacas9-grna对vegfr2外显子进行基因编辑效率；
40.图9在hek293t细胞中检测(同一靶位点)不同长度靶向序列的crispr/cas9-grna对vegfr2的基因编辑效率；
41.图10不同grna基因编辑介导vegfr2 mrna相关位点的变化比例。
具体实施方式
42.为了便于理解本发明，下面将结合附图和实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
43.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关
的所列项目的任意的和所有的组合。
44.定义：
45.本发明所述的grna分子包含与vegfr2基因dna序列互补的靶向结构域，以及固定序列结构域(骨架序列)。本发明所述的grna分子可在任意核苷酸上进行化学修饰。
46.本发明所述的“cas酶”指crispr相关核酸酶，包括crispr相关核酸酶分子或其融合蛋白，包括但不限于typeⅱ、
ⅴ
、ⅵ核酸酶，如各种类型的野生型cas9、cas12，pam特异性改变的工程化crispr-cas9和cas12核酸酶，以及它们的融合蛋白。
47.试剂来源：
48.以下实施例所涉及的限制性内切酶购于neb公司；小量质粒dna提取试剂盒与2
×
accurate taq master mix、基因组dna提取试剂盒、核酸纯化试剂盒、逆转录试剂盒、2xgreen pro taq hs premix购自湖南艾科瑞生物工程有限公司(accurate biotech)；opti-mem、t4 dna连接酶以及lipofectamine 2000转染试剂购自thermo公司；stbl3感受态细菌购自深圳康体生命科技有限公司；grna、pcr与测序所用的引物均由上海生工生物公司合成。
49.本实施例所用试剂、材料如无特殊说明，均为市售来源；实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。
50.实施例1
51.靶向破坏vegfr2基因的grna筛选。
52.1、重组质粒的构建
53.(1)确定grna靶向结构域，根据人vegfr2基因外显子区域设计靶向结构域长度为17-24nt的grna，例如第1-30号外显子，在本实施例中，具体采用第3号外显子、跨膜区附近的第15和16号外显子、激酶结构域附近的第17、18号外显子。
54.同时设计阳性对照grna-k12，构建针对细菌lacz基因组的grna作为阴性对照，所设计grna的靶向序列具体如下表所示。grna包含指导序列、tracr结构域(包括tracr序列、tracr配对序列)，所述指导序列与vegfr2基因的靶向序列互补。上述grna#1-15在基因组上的位置如图1-6所示。
55.表1 grna及其靶向序列列表
56.57.58.[0059][0060]
(2)通过常规方法合成得到grna靶序列对应的dna序列正义链和反义链，正义链的5
’‑
端加caccg，在反义链的5
’‑
端加aaac，反义链的3
’‑
端加c。
[0061]
(3)按照下表中的退火反应体系，将上述grna靶序列对应的dna序列正义链(oligo-f)和反义链(oligo-r)分别取2μl混合，加入2μl neb 10x cuttersmart缓冲液，14μl h2o在pcr仪内95℃孵育5分钟，立刻取出并在冰上孵育5分钟，退火形成含粘性末端的双链dna。
[0062]
表2退火反应体系
[0063]
[0064][0065]
(4)采用限制性内切酶内切酶bsa i切割px601质粒(含sacas9及对应grna骨架序列)，酶切后切胶回收线性化px601，因此按照下表中的t4连接体系依次加入酶切后质粒及退火引物(含粘性末端的双链dna)，及dna ligation kit ver.2.1在pcr仪内16℃孵育1小时，使退火产物与线性化的骨架完成连接，得到的t4连接的反应产物，即vegfr2-sacas9-grna质粒。
[0066]
在本实施例中，针对sacas9核酸酶，所用grna骨架序列为gttttagtactctggaaacagaatctactaaaacaaggcaaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagattttt(seq id no:157)，即以grna#1为例，grna#1序列为gtgtcatttccgatcactttgttttagtactctggaaacagaatctactaaaacaaggcaaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagattttt(seq id no:158)。可以理解的，本领域技术人员可根据所用cas酶系不同等，选用常规骨架序列与本实施例中靶向结构域或邻近区域的、pam适用调整后的靶向结构域相连接，均能实现本发明目的。
[0067]
表3t4连接体系
[0068]
反应总体积6μl2x solutionⅰ3μl退火引物2μl线性化px6011μl
[0069]
2、质粒转化
[0070]
在超净台内，将全部t4连接的反应产物迅速加入到1管(50微升)大肠杆菌stbl3感受态细胞内，然后将其放冰上孵育30分钟。将孵育后的感受态细胞浸入42℃水浴锅中热击90秒，再放回冰上孵育2分钟。然后在超净台内，向菌液加入400μl不含抗生素的lb培养基，随后将其放到细菌摇床内，37℃下200rpm培养复苏45分钟。复苏期间，开启生化培养箱，将含适量氨苄青霉素的lb琼脂平板放入使其干燥。菌液室温12000rpm离心1分钟，吸取移除大部分上清液，保留约50μl后充分重悬沉淀。吸取菌液滴到含氨苄青霉素lb琼脂平板的边缘，使用移液器吸头在平板上划线。随后将平板倒置放入生化培养箱中，继续培养16-18小时。
[0071]
3、阳性克隆鉴定
[0072]
在超净台内使用1-10μl移液器吸头分别挑取7个单克隆到50μl含氨苄青霉素lb培养基中，吹打数次使菌体与lb培养基混匀。吸取2μl菌液加入到菌落pcr反应液(如下表所示)中，混合均匀后瞬时离心使液体聚集于管底，随后进行pcr反应。剩余菌液置于生化培养箱中继续培养。引物px601-r序列为gctggcaagtgtagcggtca(seq id no:159)。
[0073]
表4 pcr扩增反应体系1
[0074]
反应总体积30μl2x accurate taq master mix15μlgrna-f(每条grna特异性正向引物)1μlpx601-r引物(序列为gctggcaagtgtagcggtca)1μldna模板1μl
去离子水12μl
[0075]
将pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，选取电泳条带大小正确、单一、亮度正常的克隆视为阳性克隆。取10μl菌液送sanger测序。剩余菌液用于质粒提取，操作流程按照accurate质粒提取试剂盒的说明书，最后用50μl elution buffer洗脱。按qubit4 fluorometer的操作方法，用qubit dsdna br assay kit测定浓度。每个质粒选取一个阳性克隆，提供5-10μl用于sanger测序，测序引物选用通用的u6-promoter-f(acgatacaaggctgttagag，seq id no:160)。图7示例性地给出了部分vegfr2-sacas9-grna质粒测序结果图。
[0076]
4、检测通过crispr/sacas9基因编辑方法破坏vegfr2基因外显子区域的编辑效率
[0077]
(1)按照life tech公司lipofectamine 2000试剂使用步骤，转染hek293t细胞。转染前一天，将状态良好的hek293t细胞按1
×
105/孔接种至24孔板。转染当天，分别取相应体积的重组vegfr2-sacas9-grna质粒500ng加入50μl opti-mem，各取1μl lipofactamine2000加入50μl opti-mem培养基，混匀后室温静置5mins，然后将稀释后的质粒dna与lipofactamine2000混匀，室温静置15分钟，接着将100μl质粒dna复合物加入24孔板的每孔细胞中，轻轻晃动培养板混匀。放置37℃培养72小时。
[0078]
转染后72小时收集细胞，按照accurate通用型基因组dna提取试剂盒标准方法提取基因组dna。用特异性引物扩增grna结合位点上下游约500bp的序列。不同grna对应的引物不同。序列下表所示：
[0079]
表5 pcr扩增引物表
[0080][0081][0082]
(2)配制总体积50μl的pcr反应体系2，如下表所示：
[0083]
表6 pcr扩增反应体系2
[0084]
反应总体积50μl2x taq master mix25μlr2-pcr-f1μlr2-pcr-r1μl
dna模板1μl去离子水22μl
[0085]
(3)1％琼脂糖电泳检测pcr产物，pcr产物进行sanger测序。测序结果导入tide分析网站。所有重组质粒转染hek293t细胞实验，重复三次。最终获取平均编辑效率，结果如下表和图8所示。其中，grna#lacz和grna#k12的平均编辑效率分别为0％和45％。
[0086]
表7 grna#1-15及k12对vegfr2基因组的平均编辑效率
[0087]
grna编号靶向序列编号靶序列位置平均编辑效率(％)grna#1seq id no:1外显子#31.66grna#2seq id no:2外显子#315.33grna#3seq id no:3外显子#30grna#4seq id no:4外显子#37grna#5seq id no:5外显子#378.66grna#6seq id no:6外显子#1567grna#7seq id no:7外显子#1511grna#8seq id no:8外显子#161grna#9seq id no:9外显子#1756grna#10seq id no:10外显子#1711grna#12seq id no:12外显子#1770.66grna#13seq id no:13外显子#1757.3grna#15seq id no:15外显子#180
[0088]
上述结果显示：grna#5、6、9、12、13对vegfr2基因编辑效果最好，rna#2、4、7、10(对照)对vegfr2基因编辑效果次之，grna#1(对照)、3、8、15、lacz几乎没有编辑效率。
[0089]
其中，grna#1-5虽然均靶向vegfr2基因组3号外显子，但靶向3号外显子3’末端的grna#1和3编辑效率极低甚至没有，而靶向3号外显子5’区域的grna#2、4、5都具有较好的编辑效率，特别是grna#5的编辑效率显著，高达78.66％，与编辑效率仅为45％的对照组grna k12相比，本发明中的grna#5编辑效率显著提高。
[0090]
grna#6和7均靶向vegfr2基因组第15号外显子，而grna#6具有更显著的编辑效率。grna#8靶向16号外显子，编辑效率偏低。grna#9、10、12、13均靶向vegfr2基因组17号外显子，其中grna#9、12和13效果最好，grna#10具有一定的编辑效率。grna#15靶向vegfr2基因组18号外显子，也没有基因编辑效率。
[0091]
实施例2
[0092]
不同长度靶向序列编辑效率考察。
[0093]
1、grna设计
[0094]
本发明进一步针对实施例1中效果最优的grna#5、#6、#9、#12、#13的pam位点(vegfr2基因组中pam定位相同)分别设计了靶向序列长度为17-24nt的grna(如下表)。
[0095]
表8不同靶向结构域长度的grna列表
[0096]
[0097][0098]
2、vegfr2-sacas9-grna质粒制备
[0099]
根据实施例1所述方法，合成grna靶序列对应的dna序列正义链和反义链(正义链的5
’‑
端加caccg，在反义链的5
’‑
端加aaac，反义链的3
’‑
端加c)，退火形成含粘性末端的双链dna。采用限制性内切酶bsa i，将含粘性末端的双链dna酶切连接整合入px601质粒中，电泳、切胶回收、转化获得vegfr2-sacas9-grna质粒。
[0100]
3、编辑效率测定
[0101]
选择长度端值17nt和24nt的grna对应的vegfr2-sacas9-grna质粒，如vegfr2-sacas9-grna#5-1(17nt)、vegfr2-sacas9-grna#5-7(24nt)(以vegfr2-sacas9-grna#5为对照组)，vegfr2-sacas9-grna#6-1(17nt)、vegfr2-sacas9-grna#6-7(24nt)(以vegfr2-sacas9-grna#6为对照组)，vegfr2-sacas9-grna#9-1(17nt)、vegfr2-sacas9-grna#9-7(24nt)(以vegfr2-sacas9-grna#9为对照组)，vegfr2-sacas9-grna#12-1(17nt)、vegfr2-sacas9-grna#12-7(24nt)(以vegfr2-sacas9-grna#12为对照组)，vegfr2-sacas9-grna#13-1(17nt)、vegfr2-sacas9-grna#13-7(24nt)(以vegfr2-sacas9-grna#13为对照组)。
[0102]
通过lipofectamine 2000脂质体转染hek293t细胞(每个实验组设置3个复孔)，转染后72小时候后收集不同vegfr2-sacas9-grna转染组的hek293t细胞基因组，用grna#5、6、9、12、13的特异性引物(见表5)pcr扩增grna结合位点上下游约800bp的序列，电泳回收并进行sanger测序，测序结果导入tide分析网站分析编辑效率，获取每个实验组的3个复孔编辑效率的平均值，结果如下表和图9所示。
[0103]
表9靶向序列长度不同的grna的编辑效率
[0104]
靶向序列编号grna编号靶序列位置平均编辑效率(％)seq id no:5grna#5外显子#376.22seq id no:23grna#5-1外显子#355.33
seq id no:29grna#5-7外显子#353seq id no:6grna#6外显子#1565.67seq id no:30grna#6-1外显子#1557.11seq id no:36grna#6-7外显子#1551seq id no:9grna#9外显子#1751seq id no:44grna#9-1外显子#1749.66seq id no:50grna#9-7外显子#1748.66seq id no:12grna#12外显子#1771.89seq id no:51grna#12-1外显子#1758.33seq id no:57grna#12-7外显子#1763.16seq id no:13grna#13外显子#1759.33seq id no:58grna#13-1外显子#1756.33seq id no:64grna#13-7外显子#1753
[0105]
实验结果显示：vegfr2-sacas9-grna#5-1(17nt)、vegfr2-sacas9-grna#5-7(24nt)与对照组vegfr2-sacas9-grna#5对vegfr2的基因编辑效果相似；vegfr2-sacas9-grna#6-1(17nt)、vegfr2-sacas9-grna#6-7(24nt)与对照组vegfr2-sacas9-grna#6对vegfr2的基因编辑效果效果差异不大；vegfr2-sacas9-grna#9-1(17nt)、vegfr2-sacas9-grna#9-7(24nt)与对照组vegfr2-sacas9-grna#9对vegfr2的基因编辑效果差异不大；vegfr2-sacas9-grna#12-1(17nt)、vegfr2-sacas9-grna#12-7(24nt)与vegfr2-sacas9-grna#12对vegfr2的基因编辑效果相似；vegfr2-sacas9-grna#13-1(17nt)、vegfr2-sacas9-grna#13-7(24nt)与vegfr2-sacas9-grna#13对vegfr2的基因编辑效果相似。
[0106]
由此可推知，vegfr2-sacas9-grna#5-1～7与对照组vegfr2-sacas9-grna#5、vegfr2-sacas9-grna#6-1～7与对照组vegfr2-sacas9-grna#6、vegfr2-sacas9-grna#9-1～7与对照组vegfr2-sacas9-grna#9、vegfr2-sacas9-grna#12-1～7与对照组vegfr2-sacas9-grna#12、vegfr2-sacas9-grna#13-1～7与对照组vegfr2-sacas9-grna#13对vegfr2基因的编辑效率非常高。
[0107]
因此，本领域技术人员可以合理预测，(同一靶位点)不同长度靶向序列的vegfr2-sacas9-grna对vegfr2基因应具有类似的编辑效率。如下表所示与grna#2、7分别同一pam位点、靶向序列长度不同(即seq id no：16-22、37-43)对应的grna，可引导vegfr2-sacas9对vegfr2基因组进行有效的基因编辑。
[0108]
表10与grna#2、7分别同一pam位点、靶向序列长度不同的grna列表
[0109]
grna编号靶向序列编号靶向序列(5'
→3’
)靶序列位置grna#2-1seq id no:16ggctttggcccaataat外显子#3grna#2-2seq id no:17tggctttggcccaataat外显子#3grna#2-3seq id no:18ctggctttggcccaataat外显子#3grna#2-4seq id no:19gactggctttggcccaataat外显子#3grna#2-5seq id no:20ggactggctttggcccaataat外显子#3grna#2-6seq id no:21tggactggctttggcccaataat外显子#3grna#2-7seq id no:22ttggactggctttggcccaataat外显子#3
grna#7-1seq id no:37tcctccttcctcactct外显子#15grna#7-2seq id no:38gtcctccttcctcactct外显子#15grna#7-3seq id no:39cgtcctccttcctcactct外显子#15grna#7-4seq id no:40ttcgtcctccttcctcactct外显子#15grna#7-5seq id no:41cttcgtcctccttcctcactct外显子#15grna#7-6seq id no:42ccttcgtcctccttcctcactct外显子#15grna#7-7seq id no:43gccttcgtcctccttcctcactct外显子#15
[0110]
实施例3
[0111]
vegfr2-cas9-grna体系调控hek293t细胞中vegfr2基因转录水平实验
[0112]
1、细胞转染
[0113]
参照实施例1中质粒转染细胞的步骤，将重组质粒(包括对照质粒)转染hek293t细胞。转染前一天，将状态良好的hek293t细胞按1
×
105/孔接种至24孔板。转染当天，分别取相应体积的重组grna 500ng加入50μl opti-mem，各取1μl lipofactamine 2000加入50μlopti-mem培养基，混匀后室温静置5mins，之后将稀释后的质粒dna与lipofactamine 2000混匀，室温静置15mins，接着将100μl质粒dna复合物加入24孔板的每孔细胞中，轻轻晃动培养板混匀。培养72h之后收集细胞提取rna。
[0114]
2、检测转录水平的改变
[0115]
(1)提取total rna并且反转为cdna
[0116]
选取所有高编辑效率的重组质粒转染hek293t细胞72h之后，收集细胞，使用steadypure universal rna extraction kit提取rna，用qubit
tm rna br assay kit试剂盒测定rna浓度，然后使用evo m-mlv rt kit with grna clean for qpcrⅱ去除基因组gdna并且逆转录反应，合成cdna.
[0117]
(2)qpcr检测sacas9-grna和sacas9-grna调控vegfr2基因的转录水平
[0118]
使用accurate sybr green pro taq hs相对实时定量qpcr检测vegfr2 mrna的相对表达量变化，以gapdh为内参。引物序列如表11所示，qpcr反应体系如表12所示。针对每个外显子区域grna设计特异性引物，只能扩增野生型的序列，而编辑后的mrna不能被扩增出来。lacz组用所有grnas特异性引物qpcr检测基因编辑的vegfr2 mrna的相对表达量变化，并且作为阴性对照。
[0119]
表11基因编辑的vegfr2 mrna相对表达量变化引物
[0120]
[0121][0122]
表12 qpcr反应体系
[0123]
反应总体积10μlsybr green pro taq hs5μlforward primer/10μm0.2μlreverse primer/10μm0.2μl稀释3倍的cdna3μl去离子水1.2μl
[0124]
(3)重组质粒转染细胞、取rna、反转合成cdna以及qpcr均需独立的3次生物性重复实验，通过2-δδct t计算方法获得三次平均结果，结果见下表和图10。
[0125]
表13各组基因编辑效率及mrna的改变
[0126]
[0127][0128]
综合表9的编辑效率数据和上表的转录验证数据分析，与对照组k12相比，本发明的grna导致细胞中细胞中vegfr2基因的转录水平降低明显，显著性提高编辑效率。对vegfr2基因编辑效果最好的是grna#5、grna#6、grna#12，较好的为grna#9、grna#13。
[0129]
上述实验证实，本发明中对于靶向切割特定位点(识别同一pam位点)的grna，靶向结构域序列长度在17-24nt范围内变化时，对编辑效果的影响并不是很大。
[0130]
实施例4
[0131]
靶向vegfr2的aav-sacas9-sgrna病毒包装、感染和基因编辑
[0132]
将不同px601-sacas9-sgrnas质粒分别与病毒辅助质粒paav-rc、paav-helper进行aav病毒的包装，收集上清、浓缩获得重组不同的aav-sacas9-sgrna病毒，并以qpcr法检测病毒滴度。
[0133]
将重组aav病毒感染hek293t细胞，72小时后，提取感染后的细胞基因组、rna，分别通过测序法检测中基因编辑效率，通过qpcr法检测细胞cdna中的vegfr2基因转录水平，同时以western blot鉴定vegfr2蛋白的敲除效率。
[0134]
aav病毒血清型优选为aav-2、aav-5、aav-8、aav-9或其变体。
[0135]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0136]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。