一种恒温扩增结合熔解曲线法检测药物基因组多态性的引物和分子信标探针及其试剂盒的制作方法

1.本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种恒温扩增结合熔解曲线法检测药物基因组多态性的引物和分子信标探针及其试剂盒。


背景技术：

2.cyp2c19同工酶在许多药物的疗效和安全使用中起着重要作用。cyp2c19的基因多态性与药物的个体差异密切相关，通过检测患者cyp2c19基因型，判断患者代谢速率类型。合理调整用药剂量,是提高相关疾病治愈率,减少毒副作用的有效途径。药物治疗的有效性和安全性取决于许多因素。cyp2c19基因的遗传变异导致cyp2c19酶活性的个体差异，使人群出现超快代谢者(μm)、快代谢者(em)、中间代谢者(im)和慢代谢者(pm)4种表型。在最佳剂量和药物不良反应(adr)方面，它们导致患者间和患者内药物反应的显著差异。优化治疗需要了解这些因素之间的关系。然而，遗传变异可以解释多达95％的药物处置和效果的变异。cyp2c19基因编码的s-美芬妥英羟化酶是细胞色素p450酶系统的重要成员之一，是氯吡格雷代谢的关键酶，cyp2c19是目前常用的基因检测项目，如果此基因功能缺失或者代谢不良基因型，会明显减弱氯吡格雷的药物效果，用药不当往往使得患者病情加重或增加耐药性。因此，建立一种快速且特异性强的药物基因组多态性检测方法是十分必要的。
3.重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)，是2006年olaf piepenburg团队发明的一种参考t4噬菌体核酸复制原理，依赖单链dna结合蛋白(ssb)、单链结合重组酶、链置换dna聚合酶共同协作达到dna扩增目标的技术，适宜的反应温度30℃-42℃；较为经典的体系是使用重组酶uvsx、uvsy，单链dna结合蛋白gp32，dna聚合酶bsu四种蛋白，反应体系的活性激发与维持还需要镁离子与atp等组份；循环扩增15-20min即可得到大量dna产物；扩增后的产物检测可以通过琼脂糖凝胶电泳检测，也可以结合荧光探针进行实时检测，或者运用侧流层进行析检测。其具有检测时间短，检测敏感度低，检测特异性好的优点。
4.pcr方法是目前广泛使用的的诊断技术，这种技术快速、灵敏，在病原体检测方面获得了极为广泛的应用；但是pcr检测方法也存在一些不足，如检测每一种病原菌都需要特异性引物，因而每次反应只能确定一种病原菌的有无，这种检测方法不适合检测混合感染的复杂标本，也不适用于基因多态性的检测，其次pcr反应用时时间长，通常需要1-2个小时，不利于快速检测，而药物基因组多态性的检测急需建立一种“一对多”的检测系统，可以通过一次反应鉴定多种目标类型。因此，有必要寻求一种新的检测方法，能在一定程度上识别固定区域内的已知和未知位点突变情况，且检测特异性强、设计简单、成本低廉，同时操作简便、结果客观准确。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种恒温扩增结合熔解曲线法检测药物基因组多态性的
引物，以解决现有技术中临床常见慢性病用药上检测方法复杂，检测周期长、易污染出现假阳性或假阴性以及检测成本较高的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供一种恒温扩增结合熔解曲线法检测药物基因组多态性的引物和分子信标探针，其特征在于，包括如下序列：
7.正向引物f1：其核苷酸序列如seq id no:1所示；
8.反向引物r1：其核苷酸序列如seq id no:2所示；
9.正向引物f2：其核苷酸序列如seq id no:3所示；
10.反向引物r2：其核苷酸序列如seq id no:4所示；
11.正向引物f3：其核苷酸序列如seq id no:5所示；
12.反向引物r3：其核苷酸序列如seq id no:6所示；
13.分子信标探针p1：其核苷酸序列如seq id no:7所示；
14.分子信标探针p2：其核苷酸序列如seq id no:8所示；
15.分子信标探针p3：其核苷酸序列如seq id no:9所示。
16.进一步，所述分子信标探针p1，其寡核苷酸dna分子的5’端标记荧光报告基团fam，3’端标记荧光淬灭基团dabcyl；
17.所述分子信标探针p2，其寡核苷酸dna分子的5’端标记荧光报告基团hex，3’端标记荧光淬灭基团dabcyl；
18.所述分子信标探针p3，其寡核苷酸dna分子的5’端标记荧光报告基团rox，3’端标记荧光淬灭基团dabcyl。
19.本发明还提供一种恒温扩增熔解曲线法检测药物基因组多态性的试剂盒，含有所述引物和分子信标探针。
20.进一步，还包括，恒温扩增冻干反应管、醋酸镁溶液、复溶液；优选的，复溶液为灭菌超纯水。
21.进一步，所述恒温扩增冻干反应管的配方如下：tris-hcl ph8 10-50mm、potassiμm acetate 20-40mm、peg20k 10％-30％、atp 3-10mm、phosphocreatine 20-60mm、creatine kinase 100-300ng/μl、dtt 2-10mm、dntp 400-800μm、uvsx 600-1000ug/ml、uvsy 278-500ug/ml、gp32 10-50mg/ml、5000-10000unit/ml bsu polymerase、正向引物f1 0.24-1μm、反向引物r2 1.45-2.5μm、正向引物f2 0.24-1μm、反向引物r2 1.45-2.5μm、正向引物f3 0.24-1μm、反向引物r3 1.45-2.5μm、分子信标探针p1 0.24-1μm、分子信标探针p2 0.24-1μm、分子信标探针p3 0.24-1μm。
22.进一步，所述恒温扩增冻干反应管的配方如下：tris-hcl ph8 10mm、potassiμm acetate 20mm、peg20k 10％、atp 3mm、phosphocreatine 20mm、creatine kinase 100ng/μl、dtt 2mm、dntp 400μm、uvsx 600ug/ml、uvsy 278ug/ml、gp32 10ug/ml、bsu polymerase 5000unit/ml、正向引物f1 0.24μm、反向引物r2 1.45μm、正向引物f2 0.24μm、反向引物r2 1.45μm、正向引物f3 0.24μm、反向引物r3 1.45μm、分子信标探针p1 0.24μm、分子信标探针p2 0.24μm、分子信标探针p3 0.24μm。
23.进一步，所述恒温扩增冻干反应管的冻干程序为：冷冻第一阶段：-45℃100-200分钟；
24.一次干燥第一阶段设定温度-40
‑‑‑
20℃，设定时间30-60分钟，持续时间200-300
分钟，控制真空0.1500mbar；第二阶段设定温度-25
‑‑‑
10℃，设定时间30-60分钟，持续时间250-350分钟，控制真空0.1000mbar；第三阶段设定温度-15
‑‑‑
10℃，设定时间30-60分钟，持续时间200-300分钟，控制真空0.1000mbar；
25.解析干燥第一阶段设定温度0-10℃，设定时间20-60分钟，持续时间120-200分钟，控制真空0.1000mbar；第二阶段设定温度25-30℃，设定时间20-60分钟，持续时间90-120分钟，控制真空0.1000mbar；压力升设定值0.020，时间10-30分钟；压力升间隔设定值2，时间10-30分钟；冷凝器制冷设定温度-50.0℃～-30℃，持续时间5-15分钟；预抽真空0.2000，报警真空0.4000，报警真空持续时间300分钟。
26.进一步，所述恒温扩增冻干反应管的冻干程序如下：冷冻第一阶段：-45℃100分钟；
27.一次干燥第一阶段设定温度-40℃，设定时间30分钟，持续时间200分钟，控制真空0.1500mbar；第二阶段设定温度-25℃，设定时间30分钟，持续时间250分钟，控制真空0.1000mbar；第三阶段设定温度-15℃，设定时间30分钟，持续时间200分钟，控制真空0.1000mbar；
28.解析干燥第一阶段设定温度0℃，设定时间20分钟，持续时间120分钟，控制真空0.1000mbar；第二阶段设定温度25℃，设定时间20分钟，持续时间90分钟，控制真空0.1000mbar；压力升设定值0.020，时间10分钟；压力升间隔设定值2，时间10分钟；冷凝器制冷设定温度-50.0℃，持续时间5分钟；预抽真空0.2000，报警真空0.4000，报警真空持续时间300分钟。
29.进一步，还包括空白对照。
30.进一步，所述空白对照为超纯灭菌水。
31.本发明还保护所述引物和分子信标探针或所述试剂盒在制备检测药物基因组多态性药物中的应用。
32.本发明还提供一种以非疾病诊断和治疗为目的的检测人类cyp2c19基因多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
33.(1)提取待检样本的基因组dna，作为dna模板；
34.(2)将上述权利要求1或2的引物和探针、或权利要求3～9任一所述试剂盒和pcr混合反应液混合在一起，加入dna模板，进行荧光pcr扩增反应；
35.(3)反应结束后，分析扩增产物的熔解曲线，通过熔解峰的个数和tm值来确定cyp2c19*2位点、cyp2c19*3位点和cyp2c19*17位点的基因型；
36.当检测结果为tm在60
±
1℃上有单一熔解峰时，cyp2c19*2位点为野生型；当检测结果为tm在65
±
1℃上有单一熔解峰时，cyp2c19*2位点为突变型；当检测结果为tm在60
±
1℃，65
±
1℃上分别有单一熔解峰时，cyp2c19*2位点为杂合基因型；
37.当检测结果为tm在73
±
1℃上有单一熔解峰时，cyp2c19*3位点为野生型；当检测结果为tm在69
±
1℃上有单一熔解峰时，cyp2c19*3位点为突变型；当检测结果为tm在73
±
1℃，69
±
1℃上分别有单一熔解峰时，cyp2c19*3位点为杂合基因型；
38.当检测结果为tm在66
±
1℃上有单一熔解峰时，cyp2c19*17位点为野生型；当检测结果为tm在58
±
1℃上有单一熔解峰时，cyp2c19*17位点为突变型；当检测结果为tm在66
±
1℃，58
±
1℃上分别有单一熔解峰时，cyp2c19*17位点为杂合基因型。
39.本发明将恒温扩增(rpa)与熔解曲线相结合，但是现有技术中两者很难结合在一起，因为rpa体系中含有的各种酶适合恒温37℃-39℃条件下运行，且其中含有的必要组分peg聚合剂非常黏稠，不利于后续的熔解曲线分析。申请人为了能够将恒温扩增(rpa)与熔解曲线分析相结合，进行了大量的实验才得到rpa各组分的浓度比例，同时对熔解曲线程序进行了优化。
40.本发明涉及的探针为分子信标探针，一般rpa恒温扩增的探针为线性探针，且长度为45-50bp，长度相对长的原因是确保扩增的特异性，但本发明的探针长度相对较短为25-35bp，且具有环加臂的结构，该探针在低温下会形成臂即5’端的荧光基团与3’端的猝灭基团相结合，从而没有荧光，但随着温度的升高变化，靶序列的增多，探针与靶序列结合，荧光基团与猝灭基团分开，荧光增强，该探针性质能够在熔解过程中更好的与靶标结合或者脱离，从而具有更明显的熔解峰，方便后续的基因型鉴定。
41.有益效果：
42.(1)高特异性：通过大量的引物探针筛选优化，最终选择出的特异性正向引物、反向引物和分子信标探针，结合熔解曲线分析能准确区分基因野生、突变及杂合型，保证了扩增的特异性；
43.(2)高灵敏度：可达1fg/μl；
44.(3)快速检测:将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，而且整个过程中没有温度的升降级循环，因而所需时间大大缩短，扩增检测只需要10-15分钟；
45.(4)低污染：由于采取封闭式的恒温放大检测系统，整个过程中无需开盖打开反应体系，因而避免了扩增子的污染；
46.(5)结果直观明了：反应结束后，根据熔解曲线的tm值即可确定所检测样本的基因型。
47.综上所述，本发明试剂盒能够区分鉴定临床常见慢性病的基因多态性，将在慢性病中基因多态性的快速鉴定和检测分析中未来临床诊断，给药用药以及快速鉴定等检测分析中发挥重要作用，应用前景广阔。
附图说明
48.图1是cyp2c19*2基因多态性的特异性恒温扩增熔解检测结果图；
49.图2是cyp2c19*3基因多态性的特异性恒温扩增熔解检测结果图；
50.图3是cyp2c19*17基因多态性的特异性恒温扩增熔解检测结果图。
51.图4是cyp2c19*2野生型敏感度结果图；
52.图5是cyp2c19*2突变型敏感度结果图；
53.图6是cyp2c19*2杂合型敏感度结果图；
54.图7是cyp2c19*3野生型敏感度结果图；
55.图8是cyp2c19*3突变型敏感度结果图；
56.图9是cyp2c19*3杂合型敏感度结果图；
57.图10是cyp2c19*17野生型敏感度结果图；
58.图11是cyp2c19*17突变型敏感度结果图；
59.图12是cyp2c19*17杂合型敏感度结果图。
具体实施方式
60.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
61.实施例1：恒温扩增引物和熔解曲线检测分子信标探针的设计及筛选
62.由于基因序列的保守性和存在的普遍性，设计的引物序列避免引物自身形成发夹结构，引物序列足够长，保证序列的特异性，降低非特异性扩增的可能。分子信标探针的设计思想是：综合考虑对常见基因多态性检测的特异性和通用性、引物和探针设计应遵循的普遍性原则(如tm值、3’末端自由能、gc含量、避免出现内部结构及形成二聚体等)。对于设计出的引物和探针合成回来后再通过合成基因质粒进行pcr实验和恒温扩增熔解曲线反应实验进行筛选验证。最初实验设计多对引物探针，部分序列如下：
63.表1
64.[0065][0066][0067]
对设计的引物探针进行排列组合，用合成的基因模板进行扩增，通过熔解曲线分析特征峰，如果有明显的特征峰出现并且能明确区分各多态性则说明此组引物探针的效果
好，最后优选出如下引物和探针：
[0068]
正向引物f1：5
’‑
gcatattgtatctatacctttattaaatg-3’(seq id no：1)
[0069]
反向引物r1：5
’‑
atcgattcttggtgttcttttactttctcca-3’(seq id no：2)
[0070]
正向引物f2：5
’‑
atctgctccattattttccagaaacg-3’(seq id no：3)
[0071]
反向引物r2：5
’‑
cttcagggcttggtcaatatagaattttggat-3’(seq id no：4)
[0072]
正向引物f3：5
’‑
tatatattcagaataactaatgtttggaagttg-3’(seq id no：5)
[0073]
反向引物r3：5
’‑
agctcatagctggcagaactgggatttg-3’(seq id no：6)
[0074]
分子信标探针p1：
[0075]
分子信标探针p2：
[0076]
分子信标探针p3：分子信标探针p3：
[0077]
所述分子信标探针p1在其寡核苷酸dna分子的5’端标记荧光报告基团fam，3’端标记荧光淬灭基团dabcyl；p1的5’端和3’端的5个碱基(双下划线部分)是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的21个碱基(下划线部分)是与cyp2c19*2g》a互补的特异性序列；
[0078]
所述分子信标探针p2在其寡核苷酸dna分子的5’端标记荧光报告基团hex，3’端标记荧光淬灭基团dabcyl；p2的5’端和3’端的5个碱基(双下划线部分)是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的17个碱基(下划线部分)是与cyp2c19*3g》a互补的特异性序列；
[0079]
所述分子信标探针p3在其寡核苷酸dna分子的5’端标记荧光报告基团rox，3’端标记荧光淬灭基团dabcyl；p3的5’端和3’端的5个碱基(双下划线部分)是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的24个碱基(下划线部分)是与cyp2c19*17c》t互补的特异性序列；
[0080]
为保证引物和分子信标探针的质量，委托通用生物(安徽)股份有限公司以hplc的纯度标准进行合成。
[0081]
实施例2：cyp2c19基因多态性恒温扩增熔解曲线法检测体系的建立与优化
[0082]
(1)扩增反应管冻干程序的优化：固定其它参数，分别调节一次干燥第一阶段的温度-40℃、-35℃、-30℃，设定时间及持续时间；解析干燥第一阶段的温度0℃、5℃、10℃，设定时间及持续时间；第二阶段的温度10℃、15℃、20℃，设定时间及持续时间，以冻干后成型的最佳状态进行恒温扩增熔解曲线检测。实验结束后比较不同冻干程序对扩增效率和熔解曲线的影响。
[0083]
(2)mg
2
浓度优化：固定其它参数，分别调节mg
2
的终浓度至30mm、25mm、20mm、15mm、10mm，以合成的基因质粒为模板进行恒温扩增熔解曲线检测。实验结束后比较不同mg
2
浓度对扩增效率和熔解曲线的影响。
[0084]
(3)上下游引物的浓度优化：固定其它参数，分别调节上游和下游引物的摩尔浓度比例1：2、1：4、1：6、1：8、1：10，以合成的基因质粒为模板进行恒温扩增熔解曲线检测。实验结束后比较不同上下游引物的比例对扩增效率和熔解曲线的影响。
[0085]
(4)探针的浓度优化：固定其它参数，分别调节探针的终浓度为0.2mm、0.25mm、0.3mm、0.35mm、0.4mm、0.45mm、0.5mm，以合成的基因质粒为模板进行恒温扩增熔解曲线检
测。实验结束后比较不同探针的浓度对扩增效率和熔解曲线的影响。
[0086]
结果：
[0087]
针对每个关键组分的优化实验，系统比较恒温扩增反应所获得的荧光增长曲线情况，结果发现扩增反应管冻干程序一次干燥第一阶段设定温度-40℃，设定时间30分钟，持续时间200分钟，控制真空0.1500mbar；第二阶段设定温度-25℃，设定时间30分钟，持续时间250分钟，控制真空0.1000mbar；第三阶段设定温度-15℃，设定时间30分钟，持续时间200分钟，控制真空0.1000mbar；解析干燥第一阶段设定温度0℃，设定时间20分钟，持续时间120分钟，控制真空0.1000mbar；第二阶段设定温度25℃，设定时间20分钟，持续时间90分钟，控制真空0.1000mbar、mg2 浓度选用14mm、dntp的浓度选用400μm、上下游引物比为1：6、探针浓度选用0.24μm时，通过10-15分钟的恒温扩增熔解曲线所得的扩增效果最佳，即能通过熔解峰准确的区分各多态性位点，野生型、突变型和杂合型。因此选用上述最优条件确定为试剂盒各组分的组成。
[0088]
实施例3：恒温扩增熔解曲线法检测药物基因组多态性的试剂盒的组成和检测方法
[0089]
试剂盒的组成(保存于-20℃)
[0090]
(1)恒温扩增冻干反应管：其组分为：tris-hcl ph8 10mm、potassiμm acetate 20mm、peg20k 10％、atp 3mm、phosphocreatine 20mm、creatine kinase 100ng/μl、dtt 2mm、dntp 400μm、uvsx重组酶蛋白(600ug/ml)、uvsy辅酶(278ug/ml)、gp32单链结合蛋白(10mg/ml)、bsu聚合酶polymerase(5000unit/ml)、0.24μm正向引物f1(f2、f3)(即0.24μm正向引物f1，0.24μm正向引物f2和0.24μm正向引物f3)、1.45μm反向引物r1(r2、r3)、0.24μm分子信标探针p1(p2、p3)；其中正向引物f1是序列编号为seq id no：1所示的核苷酸序列，反向引物r1是序列编号为seq id no：2所示的核苷酸序列，正向引物f2是序列编号为seq id no：3所示的核苷酸序列，反向引物r2是序列编号为seq id no：4所示的核苷酸序列，正向引物f3是序列编号为seq id no：5所示的核苷酸序列，反向引物r3是序列编号为seq id no：6所示的核苷酸序列，分子信标探针p1是序列编号为seq id no：7所示的核苷酸序列，分子信标探针p2是序列编号为seq id no：8所示的核苷酸序列，分子信标探针p3是序列编号为seq id no：9所示的核苷酸序列；
[0091]
(2)醋酸镁：浓度为140mm，是激活分子反应的启动剂；
[0092]
(3)超纯灭菌水：作为空白对照使用。
[0093]
方法：
[0094]
(1)提取待测样品的dna，即模板dna。
[0095]
(2)按照以下方法配制反应液：反应总体积为25μl：取冻干反应管(含seq id no:1-9的序列)，加12.5μl复溶液(灭菌超纯水)，10μl模板dna溶液(模板最低浓度为1fg/ul)，2.5μl的醋酸镁，分别以待测样本、阴性对照(经过核酸提取过程的无菌生理盐水)、空白对照作为模板，加入pcr管中；
[0096]
(3)上机恒温扩增：在荧光pcr仪中37℃保温10分钟；
[0097]
(4)熔解曲线检测：按照0.04℃/s升温速率，从40℃到85℃逐渐升高温度，熔解曲线分析程序记录每一次升温分子信标产生的荧光值。melting analysis程序在荧光定量pcr仪(slan 96s/96p,上海宏石)上进行。
[0098]
(5)结果判定：根据检测样本的熔解曲线tm值判断结果。首先是质控系统判断，即空白对照无熔解峰，否则系统检测无效。当系统检测有效时，判断待测样本结果，不同基因型对应不同熔解tm值(如图1-3所示)。图1是cyp2c19*2基因多态性的特异性恒温扩增检测结果图；图2是cyp2c19*3基因多态性的特异性恒温扩增检测结果图；图3是cyp2c19*17基因多态性的特异性恒温扩增检测结果图。图1-3的线条1表示野生型；线条2表示突变型；线条3表示杂合型；线条4表示空白对照。
[0099]
(6)注意事项：实验全过程都应使用无粉手套。为了避免实验中的交叉污染，在加模板的过程中，应首先加空白对照，其次加待测样本，最后加阳性对照。
[0100]
实施例4：恒温扩增熔解曲线法检测药物基因组多态性试剂盒的灵敏度分析
[0101]
方法：
[0102]
(1)样本处理：取高浓度1ng/μl的质粒模板，将其依次做10倍梯度稀释，得到浓度为100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl，取dna作为模板，每个浓度梯度各取10μl用于扩增。
[0103]
(2)恒温扩增检测：采用实施例3所述检测方法进行试剂配制，各梯度稀释模板10μl，管盖上加2.5μl的醋酸镁，瞬时离心震荡，然后将反应管置于荧光定量pcr仪(slan 96s/96p,上海宏石)，进行等温扩增和熔解曲线检测，设置反应条件为：37℃加热10min，荧光检测通道分别选择fam、hex、rox，熔解曲线检测按0.04℃/s升温速率，从40℃到85℃逐渐升高温度。反应完成后观察熔解曲线熔解峰tm值，分析本发明所述试剂盒所能检测到的模板浓度最低限。
[0104]
(3)结果：30分钟左右时间出检测结果，检测到模板浓度为1fg/μl的dna，结果见图4-12。其中图4是cyp2c19*2野生型敏感度结果图；图5是cyp2c19*2突变型敏感度结果图；图6是cyp2c19*2杂合型敏感度结果图；图7是cyp2c19*3野生型敏感度结果图；图8是cyp2c19*3突变型敏感度结果图；图9是cyp2c19*3杂合型敏感度结果图；图10是cyp2c19*17野生型敏感度结果图；图11是cyp2c19*17突变型敏感度结果图；图12是cyp2c19*17杂合型敏感度结果图。图4-12的线条1表示模板浓度为1ng/μl，线条2表示模板浓度为100pg/μl，线条3表示模板浓度为10pg/μl，线条4表示模板浓度为1pg/μl，线条5表示模板浓度为100fg/μl，线条6表示模板浓度为10fg/μl，线条7表示模板浓度为1fg/μl，线条8表示为空白对照。
[0105]
本发明所述药物基因组多态性恒温扩增熔解曲线法检测试剂盒快速、高效，灵敏度高，能在慢性病基因多态性快速鉴定中发挥重要作用。
[0106]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。