稻瘟灵含量检测用半抗原、制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及农药残留检测技术领域，特别是一种稻瘟灵含量检测用半抗原、制备方法及其应用。


背景技术：

2.稻瘟灵(isoprothiolane)又名异丙硫环、富士一号，化学名称1,3
‑
二硫戊环
‑2‑
亚基丙二酸二异丙酯，是一种高效内吸性杀菌剂，其杀菌谱较窄，是防治稻瘟病的特效药，特别是对穗颈瘟具有优良效果，能通过植物的根、茎、叶各个部位内吸传导，并能达到心叶。其对稻苗瘟和小球菌核病也均有效，大面积使用还可兼治稻飞虱、叶蝉，并对植物生长有调节作用。但随着稻瘟灵的大量施用，可能会污染环境，且增大其在农产品中的残留量，并对人类健康形成潜在威胁。现多需对各类农产品中稻瘟灵残留量进行有效、准确的检测。
3.水果、蔬菜、烟草产品中稻瘟灵残留问题受到越来越多的关注。我国针对不同农作物，制定了稻瘟灵最大残留限量标准，其中西瓜的最大残留限量为0.1mg/kg，大米的最大残留限量为1mg/kg，烟草的最大残留限量为2mg/kg。
4.目前，现有文献中只出现对谷物、水果、蔬菜中这类杀菌剂残留量的检测报道，而没有见到有关烟叶中残留量的测定方法的报道。国内外对稻瘟灵残留的现有检测方法主要有气相色谱
‑
质谱联用(gc
‑
ms)、高效液相色谱
‑
质谱联用(hplc
‑
ms)、气相色谱法(gc)等。此类仪器分析方法具有检测灵敏度高、特异性强等优势，但是检测样本前处理繁琐、耗时，样品还需提取和净化处理，同时仪器检测方法需要昂贵的大型仪器和设备，配备专业的检测技术人员进行操作和管理，无法进行现场大规模快速检测，时效性差，难以推广。
5.免疫学检测分析技术以其高灵敏、高特异性、快速、操作简便等优点，已被药物残留检测领域广泛应用，与仪器检测方法相比具有很多优势。但现有技术中缺乏对稻瘟灵具有特异性反应的检测试剂，阻碍了免疫分析检测法在稻瘟灵检测中的运用。
6.在建立免疫学检测方法并应用该检测方法检测稻瘟灵时，关键技术在于能够获取特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件是需要合成、制备出合适的稻瘟灵半抗原。但是，目前国内还没有针对稻瘟灵半抗原的相关报道。


技术实现要素：

7.本发明提供了一种稻瘟灵含量检测用半抗原、制备方法及其应用，用于解决现有技术中存在的缺乏对稻瘟灵成分具有特异反应的抗体及合成抗体所需半抗原的技术问题。
8.本发明提供了一种稻瘟灵含量检测用半抗原，化学式为：2
‑
(2
‑
(1,3
‑
二异丙醚
‑
1,3
‑
二氧丙烷
‑2‑
亚基)
‑
1,3
‑
二硫戊环)乙酸；化学结构式为：
[0009][0010]
具有该结构式的半抗原按现有技术中常用方法处理后可制得抗体，该抗体能对经过预处理后的各类农产品样本中所含稻瘟灵产生特异性反应。根据该特性可对稻瘟灵标准品配制溶液后，梯度稀释获得不同浓度稻瘟灵样品后，采用酶标仪在450nm下测量各样本的od值得到标准曲线后，对待测样本进行预处理后，测定相同波长下的od值，并通过标准曲线得到对应的浓度，从而实现对样本中所含稻瘟灵含量的定量有效、快速检测。本发明提供半抗原产品如图2所示。
[0011]
例如对于样本的预处理，以烟叶为例，具体包括以下步骤：用均质器均质烟叶样本；称取1.0g
±
0.05g均质后的烟叶样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入5ml甲醇溶液，用振荡器振荡5min，混匀，3000g室温(20～25℃)离心10min；移取10μl上层清液至2ml聚苯乙烯离心管中，加入1990μl复溶液，涡旋仪涡动30s，混匀；取50μl用于分析(稀释倍数：1000)。
[0012]
本发明另一方面还提供了一种上述半抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0013]
在强碱反应环境下，以丙二酸二异丙酯为原料与二硫化碳和3,4
‑
二氯丁酸进行缩合反应，得到稻瘟灵含量检测用半抗原。
[0014]
采用该反应能获得纯度较高的半抗原。该制备方法中所用试剂及反应条件，可按现有缩合反应所需的试剂和条件进行选择。
[0015]
优选的，包括以下步骤：
[0016]
1)丙二酸二异丙酯与二硫化碳在室温下搅拌混匀后，加强碱溶液后室温下搅拌1h后，加入3,4
‑
二氯丁酸并补加强碱溶液、四丁基溴化铵和乙腈，得到原料液；
[0017]
2)对原料液加热回流反应4h后停止反应，得到反应液；
[0018]
3)对所得反应液进行旋蒸、提纯分离得到所述稻瘟灵含量检测用半抗原。
[0019]
反应方程式如式(2)：
[0020][0021]
由上可知，该反应可以正常发生，并制得具有上述结构的半抗原。
[0022]
优选的，步骤3)中所述旋蒸操作包括以下步骤：旋蒸除去反应液中乙腈和二硫化
碳后加水和酸溶液，调节反应液ph值到6。
[0023]
优选的，步骤3)中所述提出分离步骤包括以下步骤：以乙酸乙酯为溶剂萃取反应液三次后合并所得有机相，水洗有机相，无水硫酸钠干燥蒸干，得到黄色油状物，上硅胶柱，用体积比为3:1的石油醚
‑
乙酸乙酯混合溶液洗脱分离纯化，得到所述稻瘟灵含量检测用半抗原。
[0024]
优选的，所用强碱溶液为2mol/l koh溶液；所述酸溶液为6mol/l hcl溶液；每次萃取所用溶剂的体积为100ml。
[0025]
为实现对半抗原的有效应用，可进行以下应用：
[0026]
本发明另一方面还提供了一种稻瘟灵含量检测用抗原，为由上述所述半抗原与载体蛋白偶联得到的偶联物。
[0027]
本发明中所用半抗原与载体蛋白偶联方法可以为现有常用由半抗原制备抗原的方法，例如以牛血清蛋白为载体的偶联方法可以为：
[0028]
取上述半抗原12.9mg，加1ml四氢呋喃溶解澄清，加n
‑
羟基丁二酰亚胺(nhs)8.5mg、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)14.8mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液a液；取牛血清白蛋白(bsa)50mg，加0.1mol/l cb9.1 8ml溶解，得到b液；将a液逐滴滴加到b液中，室温反应4h，停止反应，用0.02mol/l pbs缓冲液透析纯化3天，每天换液3次，离心，得到与牛血清白蛋白偶联的稻瘟灵人工抗原，分装，
‑
20℃保存。
[0029]
以卵清蛋白为载体的偶联方法包括以下步骤：
[0030]
取上述的稻瘟灵半抗原7.7mg，加1ml二甲基亚砜(dmso)溶解澄清，加nhs 5.1mg、edc 9.7mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液a液；取卵清蛋白(ova)50mg，加0.1mol/l cb9.1 7ml溶解，得到b液；将a液逐滴滴加到b液中，室温反应4h，停止反应，用0.02mol/l pbs缓冲液透析纯化3天，每天换液3次，离心，得到与卵清蛋白偶联的稻瘟灵人工抗原，分装，
‑
20℃保存。
[0031]
优选的，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白。采用以上种类的载体蛋白能有效发挥半抗原的检测作用。
[0032]
本发明另一方面还提供了一种稻瘟灵含量检测用抗体，为由上述的抗原经动物免疫得到抗体；所述抗体能与稻瘟灵发生特异性免疫反应。所用由上述抗原制备抗体可以为本领域常用动物免疫方法，例如包括以下步骤：
[0033]
(1)动物免疫：将牛血清白蛋白偶联的上述抗原注入到balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生多克隆抗体血清。
[0034]
(2)细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1比例与sp2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争elisa测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0035]
(3)细胞冻存和复苏：将稻瘟灵的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1
×
109个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
[0036]
(4)单克隆抗体的生产与纯化：将balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射稻瘟灵的单克隆杂交瘤细胞株6
×
105个/只，7天后采集腹水。用辛酸
‑
饱和硫酸铵法进行腹水纯化，
‑
20℃保存。
[0037]
(5)单克隆抗体效价的测定：用间接竞争elisa法测定抗体的效价为1:(64000～120000)。
[0038]
间接竞争elisa方法：用与卵清蛋白偶联的上述抗原包被酶标板。
[0039]
优选的，所述抗体为稻瘟灵单克隆抗体。
[0040]
本发明另一方面还提供了一种稻瘟灵酶联免疫检测试剂盒，所用抗体为上述抗体。该试剂盒按现有方法制得，具体方法本领域技术人员可通过检索现有免疫试剂盒生产方法制备得到。
[0041]
优选的，所述稻瘟灵酶联免疫试剂盒检测样本为经过预处理的烟草样本。该检测抗体对烟草中所含稻瘟灵的检测灵敏、准确性更高。
[0042]
优选的，免疫试剂盒包括：酶标板、工作液；酶标板为上述抗原；工作液为用辣根过氧化物酶标记的上述抗体液体。
[0043]
优选的，免疫试剂盒包括：梯度浓度的稻瘟灵标准品溶液、底物显色a、b液、终止液、洗涤液、复溶液；
[0044]
梯度浓度的稻瘟灵标准品溶液的梯度浓度为0μg/l、0.1μg/l、0.3μg/l、0.9μg/l、2.7μg/l、8.1μg/l；
[0045]
底物显色a、b液：a液为过氧化脲，b液为四甲基联苯胺；
[0046]
终止液为2mol/l硫酸；
[0047]
洗涤液为ph7.2，含0.8％～1.2％吐温
‑
20、0.01
‰
～0.03
‰
硫柳汞防腐剂、0.1～0.3mol/l的碳酸盐缓冲液；
[0048]
复溶液为ph 7.6，含8％～12％酪蛋白、0.1～0.3mol/l的磷酸盐缓冲液。
[0049]
采用上述各成分制成的试剂盒检测效率高、检测准确性好，适用于现场大批量进行检测。
[0050]
本发明能产生的有益效果包括：
[0051]
1)本发明所提供的稻瘟灵含量检测用半抗原，该半抗原能最大程度保留稻瘟灵特征结构，以此半抗原制备人工抗体后，该抗体具有对稻瘟灵检测灵敏度高和特异性强的特点。
[0052]
2)本发明所提供的稻瘟灵含量检测用半抗原，采用该半抗原为原料制备的抗体，由于以该半抗原为原料，显示针对稻瘟灵残留检测较强的免疫原性；用该半抗原作为原料，制备适于动物免疫的人工抗原体系免疫动物，所得抗体的效价、特异性、亲和力都比较好，针对稻瘟灵残留样本的检测灵敏度可达0.1μg/l，满足现有国标对农产品中稻瘟灵残留量的检测要求。
[0053]
3)本发明所提供的稻瘟灵含量检测用抗体及试剂盒，检测操作简单，无需购置大型仪器分析设备，仅需通过试剂盒即可完成对样本的检测，适宜现场大批量检测。
[0054]
4)本发明所提供的酶联免疫试剂盒，以所得抗体制成酶联免疫试剂盒，使用方便、检测成本低、检测方法高效、准确、快速、可同时检测大批量样本，适于烟草中稻瘟灵的现场监控和大量样本的筛查。
附图说明
[0055]
图1为本发明所得抗体试剂盒在烟叶样本检测中的运用中采用本发明提供的抗体
对稻瘟灵标准样品梯度稀释溶液检测后，绘制的标准曲线；
[0056]
图2为本发明实施例1中提供方法合成制备得到的半抗原产品照片。
具体实施方式
[0057]
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式及其附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。本发明半抗原制备抗原、抗原制备抗体、抗体制备试剂盒中未详述内容均按现有技术中公开的方法进行，在此不累述。
[0058]
实施例
[0059]
以下实施例中所用物料及仪器如非特殊说明，均为商业渠道购得。
[0060]
实施例1
[0061]
制备上述半抗原包括如下步骤：
[0062]
取1.88g丙二酸二异丙酯，加二硫化碳20ml，室温搅拌，充分混匀，加2mol/l koh溶液13ml，室温搅拌1h，再加入3,4
‑
二氯丁酸1.56g，补加2mol/l koh溶液5ml，四丁基溴化铵3.8g，乙腈80ml，加热回流反应4h，停止反应，旋蒸，除去乙腈和二硫化碳，加水80ml，加6mol/l hcl调节ph值到6，加乙酸乙酯100ml
×
3萃取三次，合并有机相，水洗，无水硫酸钠干燥蒸干，得到黄色油状物，上硅胶柱，用体积比为3:1的石油醚
‑
乙酸乙酯混合溶液洗脱分离纯化，得到乙酸
‑
稻瘟灵0.76g，即为上述稻瘟灵半抗原。本实施例中所得半抗原产品为如图2所示的白色粉体材料。
[0063]
实施例2
[0064]
制备稻瘟灵含量检测用抗原，包括以下步骤：
[0065]
取实施例1制备的半抗原12.9mg，加1ml四氢呋喃溶解澄清，加n
‑
羟基丁二酰亚胺(nhs)8.5mg、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)14.8mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液a液；取牛血清白蛋白(bsa)50mg，加0.1mol/l cb9.1 8ml溶解，得到b液；将a液逐滴滴加到b液中，室温反应4h，停止反应，用0.02mol/l pbs缓冲液透析纯化3天，每天换液3次，离心，得到与牛血清白蛋白偶联的稻瘟灵人工抗原，分装，
‑
20℃保存。
[0066]
实施例3
[0067]
制备稻瘟灵含量检测用抗原，包括以下步骤：
[0068]
取实施例1制备的稻瘟灵半抗原7.7mg，加1ml二甲基亚砜(dmso)溶解澄清，加nhs 5.1mg、edc 9.7mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液a液；取卵清蛋白(ova)50mg，加0.1mol/l cb9.1 7ml溶解，得到b液；将a液逐滴滴加到b液中，室温反应4h，停止反应，用0.02mol/l pbs缓冲液透析纯化3天，每天换液3次，离心，得到与卵清蛋白偶联的稻瘟灵人工抗原，分装，
‑
20℃保存。
[0069]
实施例4
[0070]
制备稻瘟灵抗体，包括以下步骤：
[0071]
(1)动物免疫：将实施例2制备的与牛血清白蛋白偶联的稻瘟灵人工抗原注入到balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生多克隆抗体血清。
[0072]
(2)细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1比例与sp2/
0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争elisa测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0073]
(3)细胞冻存和复苏：将稻瘟灵的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1
×
109个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
[0074]
(4)单克隆抗体的生产与纯化：将balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射稻瘟灵的单克隆杂交瘤细胞株6
×
105个/只，7天后采集腹水。用辛酸
‑
饱和硫酸铵法进行腹水纯化，
‑
20℃保存。
[0075]
(5)单克隆抗体效价的测定：用间接竞争elisa法测定抗体的效价为1:(64000～120000)。
[0076]
间接竞争elisa方法：用实施例3制备的与卵清蛋白偶联的稻瘟灵人工抗原包被酶标板，加入稻瘟灵标准品溶液和单克隆抗体工作液，4℃反应30min，倒出孔内液体，用pbst洗涤液洗涤3～5次，用吸水纸拍干；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体，25℃反应30min，取出重复洗板步骤；加入底物显色液，25℃反应15min后，加入终止液终止反应；设定酶标仪于波长450nm处测定每孔吸光度值。
[0077]
实施例5
[0078]
制备稻瘟灵酶联免疫试剂盒，所得试剂盒包括：
[0079]
(1)包被有与卵清蛋白偶联的稻瘟灵人工抗原的酶标板；
[0080]
(2)用辣根过氧化物酶标记的稻瘟灵单克隆抗体工作液；
[0081]
(3)稻瘟灵标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/l、0.1μg/l、0.3μg/l、0.9μg/l、2.7μg/l、8.1μg/l；
[0082]
(4)底物显色液由a液和b液组成，a液为过氧化脲，b液为四甲基联苯胺；
[0083]
(5)终止液为2mol/l硫酸；
[0084]
(6)洗涤液为ph7.2，含0.8％～1.2％吐温
‑
20、0.01
‰
～0.03
‰
硫柳汞防腐剂、0.1～0.3mol/l的碳酸盐缓冲液；
[0085]
(7)复溶液为ph7.6，含8％～12％酪蛋白、0.1～0.3mol/l的磷酸盐缓冲液。
[0086]
本试剂盒的主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。
[0087]
所得抗体试剂盒在烟叶样本检测中的运用：
[0088]
一种稻瘟灵酶联免疫试剂盒检测烟草中稻瘟灵的应用，其包括如下步骤：
[0089]
1.样品前处理
[0090]
用均质器均质烟叶样本；称取1.0g
±
0.05g均质后的烟叶样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入5ml甲醇溶液，用振荡器振荡5min，混匀，3000g室温(20～250℃)离心10min；移取10μl上层清液至2ml聚苯乙烯离心管中，加入1990μl复溶液，涡旋仪涡动30s，混匀；取50μl用于分析(稀释倍数：1000)。
[0091]
2.用试剂盒检测
[0092]
向包被有与卵清蛋白偶联的稻瘟灵人工抗原的酶标板微孔中加入稻瘟灵标准品溶液或样品溶液50μl，然后加入用辣根过氧化物酶标记的稻瘟灵单克隆抗体工作液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，25℃避光反应30min，倒出孔内液体，每孔加入250μl洗
涤液，30s后倒出孔内液体，如此重复操作洗板5次，用吸水纸拍干；每孔加入底物显色液a液过氧化脲50μl，底物显色液b液四甲基联苯胺(tmb)50μl，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光显色15min，每孔加入终止液2mol/l硫酸50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪波长设定在450nm处，测定每孔吸光度值(od值)。
[0093]
3.检测结果分析
[0094]
用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(b)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(b0)再乘以100％，得到百分吸光度值。以稻瘟灵标准品浓度(μg/l)的对数值为x轴，百分吸光度值为y轴，绘制标准曲线图，如图1所示。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中稻瘟灵的实际浓度。
[0095]
试剂盒能检出待测物的最低量测定：
[0096]
灵敏度：指应用该法能检出待测物的最低量，定量试剂盒本身的灵敏度通常可以理解为试剂盒标准品中除“0”标准品外，浓度最小的标准品浓度值或建立标准曲线时所对应的最低标准品浓度。因此本方法的灵敏度为0.1μg/l。
[0097]
试剂盒检测限测定：
[0098]
检测限：通常指试剂盒产品测定实际样本的最小检出量，其理论定义为：按照合理的前处理方法对20份阴性(空白)样本进行测定，算出平均值x和标准差(sd)，据公式x 3sd得出的结果即为该样本的检测(下)限。因此，根据上述方法测得本试剂盒对烟叶样本的检测限为100μg/kg。
[0099]
试剂盒准确度和精密度测定：
[0100]
准确度和精密度：elisa测定的准确度以回收率表示，精密度以变异系数表示。取空白烟叶样本，以100、200、400μg/kg三个浓度的稻瘟灵对其进行添加回收试验，结果得该方法对烟叶样本的回收率为100％
±
20％，批内变异系数＜10％，批间变异系数＜15％。
[0101]
试剂盒测定结果与仪器方法比较：
[0102]
取采后待烤烟叶、初烤烟叶样本各20份，编号1
‑
20号，使用本发明提供试剂盒与仪器检测方法进行对比检测，仪器方法参照：“gb/t 20769
‑
2008水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱
‑
串联质谱法”(稻瘟灵检出限为0.46mg/kg)。
[0103]
以中国烟草总公司企业标准yq 50
‑
2014《烟叶农药最大残留限量》中稻瘟灵的最大残留限量(2mg/kg)为阳性判定线，低于2mg/kg，视为未检出，用“－”表示；高于2mg/kg的样品用实际结果表示，结果见下表1～2。
[0104]
表1采后待烤烟叶样本试剂盒与仪器方法检测结果比较(mg/kg)
[0105]
样本编号12345678910试剂盒－－－－7.9－－－2.6－lc
‑
ms/ms－－－－8.4－－－3.3－样本编号11121314151617181920试剂盒11.5－－－－－－－－－lc
‑
ms/ms12.7－－－－－－－－－
[0106]
表2初烤烟叶样本试剂盒与仪器方法检测结果比较(mg/kg)
[0107]
样本编号12345678910
试剂盒－－3.4－－－－－－－lc
‑
ms/ms－－4.1－－－－－－－样本编号11121314151617181920试剂盒－10.3－－－－2.2－－－lc
‑
ms/ms－9.5－－－－2.8－－－
[0108]
由上表1～2可知，试剂盒检测结果与仪器检测结果相基本吻合，误差处于可接受范围内。试剂盒保存期限条件：
[0109]
经测定本发明提供的试剂盒在2～8℃至少可以保存12个月。
[0110]
由以上检测结果可知，本发明提供的半抗原制得的抗体，并制成试剂盒后，在烟叶中稻瘟灵残留量检测中具有较准确的检查效果，由上可知，采用本发明提供的试剂盒，可以在各类经过预处理的农产品中进行有效检测。。
[0111]
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。