一种检测胰岛素抵抗或检测糖尿病的标志物及其应用

id no 4所示的引物序列。
13.优选地，seq id no 1所示的引物序列为：ggaaaccgttaccattactgagtta。
14.优选地，seq id no 2所示的引物序列为：tcgcttcggcagcacatatac。
15.优选地，seq id no 3所示的引物序列为：atatggaacgcttcacgaatttg。
16.优选地，seq id no 3所示的引物序列为：gctgtcaacgatacgctacgtaac。
17.mirna定量检测手段是常规的定量检测手段，可以采用常规的mirna检测试剂盒进行；本发明检测mirna451a的试剂盒，是在常规的mirna检测试剂盒的基础上加入seq id no 1、seq id no 2、seq id no 3以及seq id no 4所示的引物序列即可实现。
18.有益效果：本发明提供了一种全新的检测胰岛素抵抗或检测糖尿病的标志物；发明人对比了176例正常人及178例糖尿病患者mirna451a的水平差异，结果证明正常人血浆中mirna451a的水平显著高于糖尿病人群。因此，可以采用检测mirna451a的试剂盒来检测胰岛素抵抗或检测糖尿病，并且其是一种简单、准确的检测胰岛素抵抗或检测糖尿病的方法。
具体实施方式
19.以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例并不限定本发明的范围。
20.以下实施例中提供了一种胰岛素抵抗检测方法，检测方法：sybr green染料法；分析方法：相对定量
△△
ct法。
21.一、主要仪器及试剂
[0022][0023]
二、详细步骤步骤：
[0024]
提取静脉外周血2ml，3500rpm离心10min，取血浆或血清5ooul进行mirna451a测定；(mirnas提取、cdna合成及qpcr定量测定均可根据试剂盒提示进行)
[0025]
a.mirnas抽提
[0026]
1)每200μl血清或血浆中加入900μl裂解液mza，振荡器振荡混匀30sec至完全匀浆，颠倒混匀。
[0027]
2)室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。
[0028]
3)加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置5min。
[0029]
4)12,000rpm(～13,400
×
g)，4℃，离心15min，样品会分成三层：黄色的有机相，白色的中间层和无色的水相，rna主要在水相中，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
[0030]
5)量取转移液的体积，缓慢加入转移液2倍体积的无水乙醇(如：500μl的转移液加1ml无水乙醇)，混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱mirelute，室温放置2min,室温12,000rpm(～13,400
×
g)离心30sec，离心后弃掉流出液，保留吸附柱mirelute。
[0031]
6)向吸附柱mirelute中加入700μl去蛋白液mrd(请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，室温12,000rpm(～13,400
×
g)离心30sec，弃废液。
[0032]
7)向吸附柱mirelute中加入500μl漂洗液rw(请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，室温12,000rpm(～13,400
×
g)离心30sec，弃废液。
[0033]
8)重复步骤7一次。
[0034]
9)室温12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min，弃收集管。
[0035]
10)将吸附柱mirelute转入一个新的rnase-free 1.5ml离心管中，向吸附膜中心位置加30μl rnase-free ddh2o，室温放置2min，室温12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min。
[0036]
11)用分光光度计测定rna浓度和纯度后记录数据。
[0037]
b.第一链cdna合成
[0038]
1)将模板rna置于冰上融解，5
×
pap/rt buffer室温融解。
[0039]
2)轻柔混匀试剂盒中各种组分，短暂离心后置于冰上保存。
[0040]
3)准备反转录反应液，将下表中试剂加入预冷的rnase-free反应管。
[0041][0042]
4)反转录反应
[0043]
动作轻柔地混匀已准备好的反应混合物，短暂离心后置于37℃孵育60分钟，接着置于85℃温育5分钟(终止逆转录反应)。
[0044]
5)反应完后产物稀释8倍放-20℃保存备用！
[0045]
c.mirna451a定量检测
[0046]
1.检测方法：sybr green染料法
[0047]
1)将mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心。
[0048]
2)冰上配制下表中的反应液
[0049][0050]
3)将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。
[0051]
4)采用以下程序进行反应：
[0052][0053]
d.相对定量
△△
ct分析原理和方法
[0054]
1)荧光信号理论方程
[0055]rn
＝rb x0(1 e)
nrs
[0056]
第n次pcr循环时的荧光信号强度(rn)等于背景信号强度(rb)加上每个分子的荧光强度(即单位荧光强度rs)与分子数目的乘积。
[0057]
或总信号＝本底信号 分子数量
×
单位信号强度。
[0058]
其中，rn为第n个循环时的总信号，rb为本底信号，rs为单位信号强度，x0为起始模板数量，e为pcr效率。
[0059]
2)公式推算
[0060]
当循环次数n＝ct值时，假设e＝100％时：
[0061]rct
＝rb x0×2ctrs
[0062]
x0×2ct
＝(r
ct-rb)/rs＝b
[0063]
x0＝b/2
ct
＝b
×
2-ct
[0064]
3)内参基因均一化样本差异
[0065]
每个样品都检测目的基因和内参基因，用内参基因做均一化处理，校正各样品在核酸数量上的差异，校正值＝目的基因/内参基因，即x1/x2＝2-(ct1-ct2)
＝2
‑△
ct
。2
‑△
ct
即表示为每个样品中目的基因经过内参基因均一化处理后的分子数量。
[0066]
4)处理样品和对照样品比较
[0067]
比较不同样品间某个基因的表达量差异，相对值＝处理样品/对照样品。
[0068]
即倍数变化为2
‑△
ct1
/2
‑△
ct2
＝2
‑△△
ct
[0069]
发明人采用上述方法对比了176例正常人及178例糖尿病患者mirna451a的水平差异，结果见表1；表1结果证明正常人血浆中mirna451a的水平显著高于糖尿病人群。
[0070]
表1.
[0071] mirna451a表达量正常人0.582(0.235，1.222)糖尿病患者0.001(0.000，0.024)
[0072]
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。