极端嗜热古菌重组HhH-GPD蛋白及其制备方法和应用

极端嗜热古菌重组hhh-gpd蛋白及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及极端嗜热古菌重组hhh-gpd蛋白及其制备方法和应用。


背景技术：

2.据了解，碱基甲基化是造成dna中碱基损伤的常见类型之一，细胞内源性和环境中存在的甲基化试剂会引起dna中碱基的甲基化，目前主要碱基甲基化的种类包括，7-甲基鸟嘌呤(n7-methylguanine, 7-meg)、3-甲基腺嘌呤 (3-methyladenine, 3-mea)、6-甲基鸟嘌呤 (o6-methylguanine, o6-meg)、1-甲基腺嘌呤 (1-methyladenine, 1-mea)、3-甲基鸟嘌呤 (3-methylcytosine, 3-mec)、4-甲基胸腺嘧啶 (o4-methylthymine, o4-met) 和methyl phosphotriesters (mpt)。研究发现，7-meg、3-mea和o6-meg是dna甲基化的主要形式，而 1-mea、3-mec、o4-met和mpt是dna甲基化相对较少的形式。研究发现，o6-meg和o4-met，具有高度的基因诱变性和基因毒理性，3-mea、1-mea、3-mec和3-meg能够阻止dna复制和转录，具有细胞毒理性和相对较低的基因诱变性。因此，不同类型的碱基甲基化会导致基因突变和干扰细胞的dna复制和修复过程，很有必要检测dna中的甲基化碱基。现有的检测dna甲基化方法主要包括超高效液相色谱-串联质谱法、光交联测序、单细胞实时测序等。尽管这些方法能够达到检测dna甲基化的目的，但是它们仍存在一些局限性，比如步骤繁琐或者设备昂贵。
3.dna糖苷酶是一类水解dna中n-c糖苷键的酶，进而切除dna中的损伤碱基，因此在dna损伤碱基修复、避免细胞突变、检测dna突变方面具有重要的作用。目前，dna糖苷酶可分为单功能dna糖苷酶和双功能dna糖苷酶。单功能dna糖苷酶仅切除dna中的损伤碱基，从而形成无碱基位点。而双功能dna糖苷酶不仅能够切除dna中特定的碱基，而且还能够进一步在所产生的无碱基位点处切开磷酸二酯键。
4.hhh (helix-hairpin-helix) dna 糖苷酶超家族目前包括六个家族的成员：nth、oggi、muty/mig、alka、mpgii和oggii。hhh dna 糖苷酶能够切除dna中脱氨基化碱基、氧化碱基和烷基化碱基等。hhh dna糖苷酶广泛地分布在细菌、真核生物和古菌中，细菌和真核生物来源的hhh dna糖苷酶已有较多的研究，而古菌hhh dna糖苷酶的研究相对较少。冰岛硫化叶菌sulfolobus islandicus rey15a是研究古菌dna复制和修复的重要模式生物，其基因组编码一种hhh-gpd (sis-hhh-gpd)蛋白，属于hhh dna糖苷酶超家族。


技术实现要素：

5.本发明针对所要解决的技术问题，克服现有技术的不足而提供一种极端嗜热古菌重组hhh-gpd蛋白及其制备方法。
6.本发明的另一目的在于提供一种无需使用昂贵仪器、无繁琐步骤、实用性强且能高效、特异并灵敏地识别检测dna甲基化的方法。
7.本发明提供了一种极端嗜热古菌重组hhh-gpd蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2
所示。
8.编码上述蛋白的核酸分子，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.本发明还提供了上述蛋白的制备方法，该蛋白由能够表达sis-hhh-gpd (ncbi: adx84373) 的基因工程菌产生，所用的菌株为e. coli bl21 (de3) plyss细胞，能够在短时间内大量表达目的蛋白。
10.本发明利用基因工程技术构建了一株能够过量表达耐热hhh-gpd蛋白的基因工程菌，通过诱导、表达和镍离子亲和纯化等步骤，得到电泳级的重组酶蛋白。该蛋白在高温条件下能够专一性地切除dna中的1-mea，并对含有1-mea的dna具有较高的亲和力显著地高于结合正常的dna，从而为检测甲基化的dna提供简便的方法。因此，该蛋白在涉及到dna中甲基化碱基的检测及其修复相关的分子生物学领域具有应用的潜力。
11.本发明能够表达sis-hhh-gpd的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：步骤1、利用引物，以s. islandicus rey15a基因组为模板进行pcr扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增结果；所用的正向引物序列为：5'
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cgcggatccatggttcgtaaaatacttgac
ꢀ‑
3'，反向引物序列为：5'
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ccgctcgagtcacgaggaattttctctata
ꢀ‑
3'；步骤2、对步骤1得到的pcr扩增产物和pet-28a plus载体进行双酶切 (bamhi/xhoi) 反应；步骤3、通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的pcr产物和pet-28a plus载体片段，进行连接反应；步骤4、将步骤3得到的连接产物转化到感受态细胞e. coli dh5α中，过夜培养（即涂布于含有卡那霉素的lb平板，37℃培养过夜），挑取克隆，并提取质粒进行测序验证，得到基因序列正确的克隆质粒；步骤5、将基因序列正确的克隆质粒转化到感受态细胞e. coli bl21(de3) plyss细胞中，得到能够表达sis-hhh-gpd的基因工程菌，进行诱导表达；步骤6、通过超声波破碎和镍离子亲和纯化的步骤，对该酶进行纯化，得到电泳级纯蛋白样品sis-hhh-gpd。
12.本发明进一步地提供了上述蛋白在检测dna甲基化中的应用。
13.通过上述构建方法所获得的蛋白sis-hhh-gpd的分子量约为26 kda，能够专一性地切除dna中的1-mea，并且能够进一步在所形成的无碱基位点处切开磷酸二酯键。
14.所述蛋白sis-hhh-gpd能够在40oc ～ 90oc温度范围内切割含有1-mea的dna，其切割反应最适温度为70oc。
15.所述蛋白sis-hhh-gpd能够在ph 8.0 ～ 9.5范围内切割含有1-mea的dna。
16.所述蛋白sis-hhh-gpd的切割反应不需要二价金属离子。
17.所述蛋白sis-hhh-gpd的切割反应不需要盐存在，高盐会抑制该酶的活性。
18.所述蛋白sis-hhh-gpd能够结合含有1-mea的dna，不能结合正常的dna。
19.本发明的有益效果如下：本发明利用基因工程技术，构建了一株表达sis-hhh-gpd蛋白的基因工程菌，该基因工程菌能够高效地表达sis-hhh-gpd蛋白，且后续的纯化步骤简单易行，很容易得到大量重组酶蛋白（每升发酵液可得到大约2 mg重组蛋白）；该重组sis-hhh-gpd蛋白活力高，能够
特异性切除dna中的1-mea；该重组sis-hhh-gpd蛋白结合含有1-mea dna的能力显著地高于结合正常的dna。
20.基于上述的研究成果，本发明所涉及的重组sis-hhh-gpd蛋白作为dna甲基化的检测试剂，在医疗领域和分子生物学领域具有广泛的应用前景。
21.总之，本发明的极端嗜热古菌重组hhh-gpd蛋白，能够切除和结合dna中的甲基化碱基，具有表达量高、易纯化和活力高等优点，使其在dna甲基化的检测方面具有市场实施的可能性，预期能够产生较大的经济效益。
附图说明
22.图1是sis-hhh-gpd的诱导、表达及纯化结果示意图。
23.图2是sis-hhh-gpd切割dna的分析示意图。
24.图3是温度对sis-hhh-gpd切割dna的影响示意图。
25.图4是ph对sis-hhh-gpd切割dna的影响示意图。
26.图5是二价金属离子对sis-hhh-gpd切割dna的影响示意图。
27.图6是盐浓度对sis-hhh-gpd切割dna的影响示意图。
28.图7是sis-hhh-gpd结合dna的分析结果示意图。
具体实施方式
29.下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护权限不限于下述的实施例。
30.实施例所涉及试剂及材料的来源如下：omega pcr试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，pet-28a plus载体由中国科学院高能物理研究所提供，omega胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，e. coli dh5α感受态细胞来自全式金生物公司，omega质粒提取试剂盒来自天根生化科技（北京）有限公司，感受态细胞e. coli bl21(de3) plyss细胞购自全式金生物公司。
31.除了上述特殊说明的生物材料及试剂外，本发明中所提及的其余材料及试剂为市购，公众能从国内外商业渠道购买到，此处不再一一说明。本发明中的“%”为体积百分比。
32.实施例1 sis-hhh-gpd蛋白的基因克隆（1）设计引物从genbank中下载已经完成测序的冰岛硫化叶菌s. islandicus rey15a基因组编码的sis-hhh-gpd基因序列 (ncbi: sire_0278)，设计一对含有两个不同的限制性核酸内切酶酶切位点的引物，其正向引物序列为：5'
‑ꢀ
cgcggatccatggttcgtaaaatacttgac-3'，反向引物序列为：5'
‑ꢀ
ccgctcgagtcacgaggaattttctctata-3'，其中下划线碱基分别是bamhi和xhoi酶切位点。
33.（2）pcr扩增该酶基因a）利用上述引物对，以从genbank中下载的s. islandicus rey15a基因组为模板进行pcr扩增。
34.pcr反应体系为50 μl:
10 μm正向引物
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2 μl10 μm反向引物
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2 μls. islandicus rey15a基因组dna（50 ng/μl）
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1 μlddh2o
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20 μl2
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phanta max master mix
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25 μlpcr反应循环参数：95oc，3 min；循环34次（95oc，30 s；55oc，30 s；72oc，1 min）；72oc延伸5 min。
35.b）通过琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增该酶基因的结果：反应结束后，取5 μl pcr产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
36.c）pcr产物的纯化：采用omega pcr试剂盒进行回收纯化，具体步骤见其说明书。利用nanodrop 2000超微量分光光度计测定pcr回收产物的浓度。
37.（3）酶切酶基因和质粒载体对pcr产物和pet-28a plus载体分别进行双酶切(bamhi/xhoi)反应。
38.酶切反应体系为20 μl:pcr产物或pet-28a plus载体
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16 μl10 x 酶切buffer (mg
2 plus)
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2 μlbamhi
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1 μlxhoi
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1 μl37oc水浴2 hr。酶切结束后，将酶切产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。采用omega胶回收试剂盒进行切胶回收纯化，具体步骤见其说明书。采用nanodrop 2000超微量分光光度计测定其浓度。
39.（4）连接酶基因和载体：将通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的pcr产物和pet-30a ( )载体并进行连接反应。
40.连接反应体系为10 μl:10 x ligation buffer
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1 μl酶切后的pet-28a plus载体
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2 μl酶切后的pcr产物
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6 μlt4 dna ligase
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1 μl22oc反应2 hr。
41.（5）重组质粒的转化：将连接产物转化到e. coli dh5α感受态细胞中，并涂布于含有卡那霉素的lb平板，37oc过夜培养。挑取单菌落，并提取质粒进行测序验证。
42.吸取5 μl连接产物至50 μl e. coli dh5α感受态细胞中，混匀，冰浴放置30 min。42oc静止水浴90 sec，迅速放回冰中继续冰浴2 min。加200 μl lb液体培养基，于37oc摇床上150 rpm培养1 hr。吸取100 μl培养物涂布于含有终浓度为50 μg/ml卡那霉素的lb培养基平板上，37oc培养12 h ～16 h，得到100 ～ 200个单菌落。
43.随后，对阳性克隆进行验证：分别选取4个单菌落，接种于5 ml含有50 μg/ml卡那霉素的lb培养基试管，37oc摇床上150 rpm过夜培养。采用omega质粒提取试剂盒，提取质粒，并进行测序。将测序结果与ncbi注释的序列比对，验证阳性克隆，得到重组质粒sis-hhh-gpd-pet-28a plus ( )。
sis-hhh-gpd、1 mm dtt和8%甘油。反应温度分别为30oc、40oc、50oc、60oc、70oc、80oc或90oc反应时间为30 min。反应结束后，加入10 μl含有100 mmol/l edta的甲酰胺终止反应，95oc反应5 min使双链解链。利用尿素浓度为8 m的15%变性聚丙烯酰胺凝胶 (0.5
ꢀ×ꢀ
tbe) 对切除后的产物进行凝胶电泳。电泳结果如图3所示，sis-hhh-gpd能够在30oc ～90oc温度下切除dna中的1-mea，其最适反应温度为70oc。
53.测试3：反应ph对sis-hhh-gpd活性的影响反应体系为10 μl：100 nm含有1-mea的ssdna、1000 nm sis-hhh-gpd、1 mm dtt、8%甘油和不同ph的缓冲液 (20 mmol/l)。制备不同ph的缓冲液的方法如下：磷酸钠缓冲液 (ph 6.0，6.5)；tris-hcl 缓冲液 (ph 7.0，7.5和8.0)；甘氨酸缓冲液 (ph 8.5，9.0)；碳酸氢钠缓冲液 (ph 10.0)。70oc反应30 min。反应结束后，加入10 μl含有100 mmol/l edta的甲酰胺终止反应，95oc反应5 min使双链解链，利用尿素浓度为8 m的15%变性聚丙烯酰胺凝胶 (0.5
ꢀ×ꢀ
tbe) 对切除后的产物进行凝胶电泳。电泳结果如图4所示，sis-hhh-gpd能够在ph 6.0 ～ 9.5的范围内切除dna中的1-mea，其最适反应ph为8.0～9.5。
54.测试4：二价金属离子对sis-hhh-gpd活性的影响反应体系为10 μl：20 mm tris-hcl ph 8.0、100 nm含有1-mea的ssdna、1000 nm sis-hhh-gpd、1 mm dtt、8%甘油和5 mm二价金属离子（二价金属离子为ca
2
、mg
2
、zn
2
、mn
2
、ni
2
、co
2
或cu
2
）。70oc反应30 min，反应结束后，加入10 μl含有100 mmol/l edta的甲酰胺终止反应，95oc反应5 min使双链解链，利用尿素浓度为8 m的15%变性聚丙烯酰胺凝胶 (0.5
ꢀ×ꢀ
tbe) 对切除后的产物进行凝胶电泳。结果如图5所示，sis-hhh-gpd切除dna中1-mea的活性不依赖于二价金属离子；zn
2
、ni
2
、co
2
和cu
2
在不同程度上会抑制该酶的活性，而ca
2
、mn
2
和mg
2
不影响该酶的活性。
55.测试5：盐浓度对sis-hhh-gpd活性的影响反应体系为10 μl：20 mm tris-hcl ph 8.0、100 nm含有1-mea的ssdna、1000 nm sis-hhh-gpd、1 mm dtt、8%甘油和不同浓度的 nacl（50 mm、100 mm、200 mm或400 mm）；70oc反应30 min。反应结束后，加入10 μl含有100 mmol/l edta的甲酰胺终止反应，95oc反应5 min使双链解链，利用尿素浓度为8 m的15%变性聚丙烯酰胺凝胶 (0.5
ꢀ×ꢀ
tbe) 对切除后的产物进行凝胶电泳。电泳结果如图6所示，sis-hhh-gpd切除dna中的1-mea不依赖于nacl，而高浓度的nacl则会抑制该酶的活性。
56.测试6：sis-hhh-gpd结合dna的分析凝胶阻滞实验体系为10 μl：20 mm tris-hcl ph 8.0、1 mm dtt、10%甘油、100 nm cy3标记的1-mea ssdna或正常的ssdna以及不同浓度的sis-hhh-gpd。室温结合10 min后直接上样，4%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (0.1
ꢀ×ꢀ
tbe) 分离阻滞产物。随后使用分子成像仪扫描拍照，对图中dna条带定量分析，计算酶与底物的结合率。扫描结果如图7中a所示，sis-hhh-gpd能够高效地结合含有1-mea的dna，但是微弱地结合正常的dna（图7中b）。
57.本发明发现，sis-hhh-gpd 蛋白是一种双功能dna糖苷酶，能够专一性地切除dna中的1-mea，并且结合含有1-mea dna的能力显著地高于结合正常的dna，因此本发明为检测dna甲基化提供一种重要的方法。相对于其他dna甲基化检测方法，本发明提供的方法，具有灵敏度高、成本低、易操作等优点。
58.以上所述，仅为本发明中的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任
何熟悉该技术的人在本发明所揭露的技术范围内，可理解想到的变换或替换，都应涵盖在本发明的包含范围之内，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。