一种利用盐单胞菌重复批次发酵生产pha的方法
技术领域
1.本发明属于生物工程领域，具体涉及一种利用盐单胞菌重复批次发酵生产pha的方法。
背景技术：
2.聚羟基脂肪酸酯（pha）是一种胞内聚酯，它具有类似于合成塑料的物化特性及合成塑料所不具备的生物可降解性、生物相容性、光学活性、压电性、气体相隔性等许多优秀性能。聚羟基脂肪酸酯在可生物降解的包装材料、组织工程材料、缓释材料、电学材料以及医疗材料方面有广阔的应用前景。
3.现有pha的生产以微生物发酵为主，传统的pha发酵工艺已经比较成熟，经改良后的盐单胞菌发酵48h的pha积累量可达70％以上，然而pha生产过程产生废水的处理问题却难以彻底解决，这已成为限制pha发酵生产发展的瓶颈问题。pha的发酵时间也相对较长，整体的发酵效率较低，这导致pha的生产成本居高不下，制约了pha的应用范围。
4.盐单胞菌是常用的pha发酵菌株，cn111349662a、cn111500650a、cn111394398a、cn113801810a等公开了不同使用盐单胞菌生产pha的工艺。这些生产工艺在一定程度上提高了pha的产量，但是依然分批发酵，单次发酵的时间一般长达48h，批次间隔一般为24h，每次发酵都需要重新准备种子液，生产成本依然较高。
5.开发出一种高效的pha发酵工艺，具有非常重要的意义。
技术实现要素：
6.本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种利用盐单胞菌重复批次发酵生产pha的方法。
7.本发明所采取的技术方案是：一种利用盐单胞菌重复批次发酵生产pha的方法，包括：s1)以发酵基础培养基作为培养物，接种盐单胞菌液；s2)补料培养：当菌液中的含糖量降至10g/l后，依次补充补料a、补料b和补料c，控制糖浓度在5～15g/l；补料c补充完继续培养至菌液的残糖量降至不高于1g/l，放出部分菌液，从放出的部分菌液中提取pha；s3)在剩余的菌液中加入发酵基础培养基，重复s2)进行重复批次发酵；其中：发酵基础培养基的组分主要为：葡萄糖340～560g/l，酵母粉2～5g/l，尿素30～50g/l，玉米浆干粉30～40g/l；补料a的组分主要为：葡萄糖 500～800g/l，尿素27.72～44.35g/l；补料b的组分主要为：葡萄糖 500～800g/l，硫酸铵5～8g/l；补料c的组分主要为：葡萄糖800g/l。
8.在一些方法的实例中，盐单胞菌液的接种量与发酵基础培养基的体积比为5：95至
10：90。
9.在一些方法的实例中，步骤s4)中，剩余的菌液与发酵基础培养基的体积比为5：95至10：90。
10.在一些方法的实例中，步骤s2)中，菌液中的含糖量降至10～15g/l时，进行补料操作。
11.在一些方法的实例中，步骤s2)中，补料操作时控制菌液中的含糖量为8～15g/l。
12.在一些方法的实例中，步骤s2)中，菌液中的含糖量降至10～15g/l时，进行补料操作，补料操作时控制菌液中的含糖量为8～15g/l。
13.在一些方法的实例中，所述发酵基础培养基还添加微量元素，具体为硫酸镁0.2 g/l，柠檬酸铁铵0.05 g/l, 无水氯化钙0.015 g/l，七水硫酸锌0.1mg/l，四水硫酸锰0.03mg/l，硼酸0.3mg/l，六水氯化钴0.2mg/l，五水硫酸铜0.01mg/l，氯化镍六水合物0.02mg/l，钼酸钠0.03mg/l。
14.在一些方法的实例中，所述补料a的体积是步骤s1)中发酵基础培养基体积的8～15%。
15.在一些方法的实例中，所述补料b的体积是步骤s1)中发酵基础培养基体积的6～10%。
16.在一些方法的实例中，所述补料c的体积是步骤s1)中发酵基础培养基体积的10～15%。
17.在一些方法的实例中，步骤s2)中，放出部分菌液占菌液总体积的70～90%。
18.在一些方法的实例中，重复培养的批次不超过20次。
19.本发明的有益效果是：本发明一些实例的方法，可以节约单批次发酵后的清洗、消毒时间，提高了发酵罐的利用效率，同时节省了种子液的制备过程，产能提高约0.5～1.5倍。
具体实施方式
20.发明人研究意外发现，盐单胞菌单批次发酵后期菌体内富含pha颗粒，且菌体长度增加，在将一定体积的菌液接种到lb培养基中，菌体可再次恢复快速分裂能力，菌体内pha颗粒在分裂过程中略有损耗，且新产生的盐单胞菌菌体内不含有pha颗粒。基于盐单胞菌的此特点，提供该盐单胞菌重复批次发酵生产pha的方法。
21.一种利用盐单胞菌重复批次发酵生产pha的方法，包括：s1)以发酵基础培养基作为培养物，接种盐单胞菌液；s2)补料培养：当菌液中的含糖量降至10g/l后，依次补充补料a、补料b和补料c，控制糖浓度在5～15g/l；补料c补充完继续培养至菌液的残糖量降至不高于1g/l，放出部分菌液，从放出的部分菌液中提取pha；s3)在剩余的菌液中加入发酵基础培养基，重复s2)进行重复批次发酵；其中：发酵基础培养基的组分主要为：葡萄糖340～560g/l，酵母粉2～5g/l，尿素30～50g/l，玉米浆干粉30～40g/l；补料a的组分主要为：葡萄糖 500～800g/l，尿素27.72～44.35g/l；
补料b的组分主要为：葡萄糖 500～800g/l，硫酸铵5～8g/l；补料c的组分主要为：葡萄糖800g/l。
22.在一些方法的实例中，盐单胞菌液的接种量与发酵基础培养基的体积比为5：95至10：90。
23.在一些方法的实例中，步骤s4)中，剩余的菌液与发酵基础培养基的体积比为5：95至10：90。
24.在一些方法的实例中，步骤s2)中，菌液中的含糖量降至10～15g/l时，进行补料操作。为了使得培养基中组分保持基本稳定，补料时优选流加。
25.在一些方法的实例中，步骤s2)中，补料操作时控制菌液中的含糖量为8～15g/l。这样更有利于提高pha的产量。
26.为了满足菌株生长的需要，发酵基础培养基中还添加有微量元素。在一些方法的实例中，所述发酵基础培养基还添加微量元素，具体为硫酸镁0.2 g/l，柠檬酸铁铵0.05 g/l, 无水氯化钙0.015 g/l，七水硫酸锌0.1mg/l，四水硫酸锰0.03mg/l，硼酸0.3mg/l，六水氯化钴0.2mg/l，五水硫酸铜0.01mg/l，氯化镍六水合物0.02mg/l，钼酸钠0.03mg/l。
27.在一些方法的实例中，所述补料a的体积是步骤s1)中发酵基础培养基体积的8～15%。具体的添加量可以根据浓度和菌株的生长情况、pha合成情况进行相应的调整。
28.在一些方法的实例中，所述补料b的体积是步骤s1)中发酵基础培养基体积的6～10%。具体的添加量可以根据浓度和菌株的生长情况、pha合成情况进行相应的调整。
29.在一些方法的实例中，所述补料c的体积是步骤s1)中发酵基础培养基体积的10～15%。具体的添加量可以根据浓度和菌株的生长情况、pha合成情况进行相应的调整。
30.在一些方法的实例中，步骤s2)中，放出部分菌液占菌液总体积的70～90%，更佳为85～90%。这样既可以获得较高的产量，又可以保留足够的盐单胞菌，满足重复批次生产需要。
31.重复培养的批次过多，菌株的生产性能会发生一定的下降，不利于稳产高产。在一些方法的实例中，重复培养的批次不超过20次。
32.下面结合实例，进一步说明本发明的技术方案。以下实施例中，使用的盐单胞菌为商品化的盐单胞菌菌株，具体为halomonas lutescens mdf-9。当然，本领域技术人员也可以使用其他具有类似性能的盐单胞菌并根据具体菌株的特性对方法进行相应的微调，以获得最佳的生产性能。
33.实施例1整个发酵过程包括三个阶段：接种、培养、再接种；发酵体积为3l。
34.发酵基础培养基组分主要为：葡萄糖340～560g/l，酵母粉2～5g/l，尿素30～50g/l，玉米浆干粉36g/l，硫酸镁0.2 g/l，柠檬酸铁铵0.05 g/l, 无水氯化钙0.015 g/l，七水硫酸锌0.1mg/l，四水硫酸锰0.03mg/l，硼酸0.3mg/l，六水氯化钴0.2mg/l，五水硫酸铜0.01mg/l，氯化镍六水合物0.02mg/l，钼酸钠0.03mg/l。
35.补料a组分主要为：葡萄糖
ꢀꢀꢀ
806.45g/l，尿素44.35g/l，单次补料量共计310ml。
36.补料b组分主要为：葡萄糖
ꢀꢀꢀ
800g/l，硫酸铵8g/l，单次补料量共计250 ml。
37.补料c组分主要为：葡萄糖
ꢀꢀꢀ
800g/l，单次补料量共计375 ml。
38.发酵过程主要有以下几个阶段：
①
接种：按照10%的体积比接种菌液（种子菌液由平板上挑取的菌块接种至lb培养基培养10h获得），以发酵基础培养基作为培养物；
②
菌液中糖含量降至10～15g/l时，开始顺序补充补料a、补料b、补料c，过程中控制糖含量在5～15g/l范围内；
③
待补料全部用完，且菌液中残糖降至1g/l左右，留下300～400ml菌液其余部分放出；
④
在发酵罐中重新添加发酵基础培养物；
⑤
重复
②
～
④
过程10～15次，完成重复批次培养。
39.发酵控制：通气量3l/min，搅拌桨转速设置为800rpm/min，维持温度36.5℃，ph 8.5
±
0.2范围内。
40.结果分析：在重复批次发酵培养过程中，分阶段取样进行分析，确定菌液中pha的含量，计算产量并计算同等条件下单批次发酵和重复批次发酵的pha产出情况。
41.单批次发酵：每次发酵约50小时，期间停顿洗罐、消毒等需24小时，750h进行10批次发酵，收获菌液的pha含量均稳定在70%～ 75%范围内，产量约3.08kg。
42.重复批次发酵：单次重复约50h，750h进行15罐次重复发酵，收获菌液的pha含量均稳定在70%～75%范围内，pha分子量与单批次发酵无明显区别，产量约4.59kg。
43.以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
技术领域
1.本发明属于生物工程领域，具体涉及一种利用盐单胞菌重复批次发酵生产pha的方法。
背景技术：
2.聚羟基脂肪酸酯（pha）是一种胞内聚酯，它具有类似于合成塑料的物化特性及合成塑料所不具备的生物可降解性、生物相容性、光学活性、压电性、气体相隔性等许多优秀性能。聚羟基脂肪酸酯在可生物降解的包装材料、组织工程材料、缓释材料、电学材料以及医疗材料方面有广阔的应用前景。
3.现有pha的生产以微生物发酵为主，传统的pha发酵工艺已经比较成熟，经改良后的盐单胞菌发酵48h的pha积累量可达70％以上，然而pha生产过程产生废水的处理问题却难以彻底解决，这已成为限制pha发酵生产发展的瓶颈问题。pha的发酵时间也相对较长，整体的发酵效率较低，这导致pha的生产成本居高不下，制约了pha的应用范围。
4.盐单胞菌是常用的pha发酵菌株，cn111349662a、cn111500650a、cn111394398a、cn113801810a等公开了不同使用盐单胞菌生产pha的工艺。这些生产工艺在一定程度上提高了pha的产量，但是依然分批发酵，单次发酵的时间一般长达48h，批次间隔一般为24h，每次发酵都需要重新准备种子液，生产成本依然较高。
5.开发出一种高效的pha发酵工艺，具有非常重要的意义。
技术实现要素：
6.本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种利用盐单胞菌重复批次发酵生产pha的方法。
7.本发明所采取的技术方案是：一种利用盐单胞菌重复批次发酵生产pha的方法，包括：s1)以发酵基础培养基作为培养物，接种盐单胞菌液；s2)补料培养：当菌液中的含糖量降至10g/l后，依次补充补料a、补料b和补料c，控制糖浓度在5～15g/l；补料c补充完继续培养至菌液的残糖量降至不高于1g/l，放出部分菌液，从放出的部分菌液中提取pha；s3)在剩余的菌液中加入发酵基础培养基，重复s2)进行重复批次发酵；其中：发酵基础培养基的组分主要为：葡萄糖340～560g/l，酵母粉2～5g/l，尿素30～50g/l，玉米浆干粉30～40g/l；补料a的组分主要为：葡萄糖 500～800g/l，尿素27.72～44.35g/l；补料b的组分主要为：葡萄糖 500～800g/l，硫酸铵5～8g/l；补料c的组分主要为：葡萄糖800g/l。
8.在一些方法的实例中，盐单胞菌液的接种量与发酵基础培养基的体积比为5：95至
10：90。
9.在一些方法的实例中，步骤s4)中，剩余的菌液与发酵基础培养基的体积比为5：95至10：90。
10.在一些方法的实例中，步骤s2)中，菌液中的含糖量降至10～15g/l时，进行补料操作。
11.在一些方法的实例中，步骤s2)中，补料操作时控制菌液中的含糖量为8～15g/l。
12.在一些方法的实例中，步骤s2)中，菌液中的含糖量降至10～15g/l时，进行补料操作，补料操作时控制菌液中的含糖量为8～15g/l。
13.在一些方法的实例中，所述发酵基础培养基还添加微量元素，具体为硫酸镁0.2 g/l，柠檬酸铁铵0.05 g/l, 无水氯化钙0.015 g/l，七水硫酸锌0.1mg/l，四水硫酸锰0.03mg/l，硼酸0.3mg/l，六水氯化钴0.2mg/l，五水硫酸铜0.01mg/l，氯化镍六水合物0.02mg/l，钼酸钠0.03mg/l。
14.在一些方法的实例中，所述补料a的体积是步骤s1)中发酵基础培养基体积的8～15%。
15.在一些方法的实例中，所述补料b的体积是步骤s1)中发酵基础培养基体积的6～10%。
16.在一些方法的实例中，所述补料c的体积是步骤s1)中发酵基础培养基体积的10～15%。
17.在一些方法的实例中，步骤s2)中，放出部分菌液占菌液总体积的70～90%。
18.在一些方法的实例中，重复培养的批次不超过20次。
19.本发明的有益效果是：本发明一些实例的方法，可以节约单批次发酵后的清洗、消毒时间，提高了发酵罐的利用效率，同时节省了种子液的制备过程，产能提高约0.5～1.5倍。
具体实施方式
20.发明人研究意外发现，盐单胞菌单批次发酵后期菌体内富含pha颗粒，且菌体长度增加，在将一定体积的菌液接种到lb培养基中，菌体可再次恢复快速分裂能力，菌体内pha颗粒在分裂过程中略有损耗，且新产生的盐单胞菌菌体内不含有pha颗粒。基于盐单胞菌的此特点，提供该盐单胞菌重复批次发酵生产pha的方法。
21.一种利用盐单胞菌重复批次发酵生产pha的方法，包括：s1)以发酵基础培养基作为培养物，接种盐单胞菌液；s2)补料培养：当菌液中的含糖量降至10g/l后，依次补充补料a、补料b和补料c，控制糖浓度在5～15g/l；补料c补充完继续培养至菌液的残糖量降至不高于1g/l，放出部分菌液，从放出的部分菌液中提取pha；s3)在剩余的菌液中加入发酵基础培养基，重复s2)进行重复批次发酵；其中：发酵基础培养基的组分主要为：葡萄糖340～560g/l，酵母粉2～5g/l，尿素30～50g/l，玉米浆干粉30～40g/l；补料a的组分主要为：葡萄糖 500～800g/l，尿素27.72～44.35g/l；
补料b的组分主要为：葡萄糖 500～800g/l，硫酸铵5～8g/l；补料c的组分主要为：葡萄糖800g/l。
22.在一些方法的实例中，盐单胞菌液的接种量与发酵基础培养基的体积比为5：95至10：90。
23.在一些方法的实例中，步骤s4)中，剩余的菌液与发酵基础培养基的体积比为5：95至10：90。
24.在一些方法的实例中，步骤s2)中，菌液中的含糖量降至10～15g/l时，进行补料操作。为了使得培养基中组分保持基本稳定，补料时优选流加。
25.在一些方法的实例中，步骤s2)中，补料操作时控制菌液中的含糖量为8～15g/l。这样更有利于提高pha的产量。
26.为了满足菌株生长的需要，发酵基础培养基中还添加有微量元素。在一些方法的实例中，所述发酵基础培养基还添加微量元素，具体为硫酸镁0.2 g/l，柠檬酸铁铵0.05 g/l, 无水氯化钙0.015 g/l，七水硫酸锌0.1mg/l，四水硫酸锰0.03mg/l，硼酸0.3mg/l，六水氯化钴0.2mg/l，五水硫酸铜0.01mg/l，氯化镍六水合物0.02mg/l，钼酸钠0.03mg/l。
27.在一些方法的实例中，所述补料a的体积是步骤s1)中发酵基础培养基体积的8～15%。具体的添加量可以根据浓度和菌株的生长情况、pha合成情况进行相应的调整。
28.在一些方法的实例中，所述补料b的体积是步骤s1)中发酵基础培养基体积的6～10%。具体的添加量可以根据浓度和菌株的生长情况、pha合成情况进行相应的调整。
29.在一些方法的实例中，所述补料c的体积是步骤s1)中发酵基础培养基体积的10～15%。具体的添加量可以根据浓度和菌株的生长情况、pha合成情况进行相应的调整。
30.在一些方法的实例中，步骤s2)中，放出部分菌液占菌液总体积的70～90%，更佳为85～90%。这样既可以获得较高的产量，又可以保留足够的盐单胞菌，满足重复批次生产需要。
31.重复培养的批次过多，菌株的生产性能会发生一定的下降，不利于稳产高产。在一些方法的实例中，重复培养的批次不超过20次。
32.下面结合实例，进一步说明本发明的技术方案。以下实施例中，使用的盐单胞菌为商品化的盐单胞菌菌株，具体为halomonas lutescens mdf-9。当然，本领域技术人员也可以使用其他具有类似性能的盐单胞菌并根据具体菌株的特性对方法进行相应的微调，以获得最佳的生产性能。
33.实施例1整个发酵过程包括三个阶段：接种、培养、再接种；发酵体积为3l。
34.发酵基础培养基组分主要为：葡萄糖340～560g/l，酵母粉2～5g/l，尿素30～50g/l，玉米浆干粉36g/l，硫酸镁0.2 g/l，柠檬酸铁铵0.05 g/l, 无水氯化钙0.015 g/l，七水硫酸锌0.1mg/l，四水硫酸锰0.03mg/l，硼酸0.3mg/l，六水氯化钴0.2mg/l，五水硫酸铜0.01mg/l，氯化镍六水合物0.02mg/l，钼酸钠0.03mg/l。
35.补料a组分主要为：葡萄糖
ꢀꢀꢀ
806.45g/l，尿素44.35g/l，单次补料量共计310ml。
36.补料b组分主要为：葡萄糖
ꢀꢀꢀ
800g/l，硫酸铵8g/l，单次补料量共计250 ml。
37.补料c组分主要为：葡萄糖
ꢀꢀꢀ
800g/l，单次补料量共计375 ml。
38.发酵过程主要有以下几个阶段：
①
接种：按照10%的体积比接种菌液（种子菌液由平板上挑取的菌块接种至lb培养基培养10h获得），以发酵基础培养基作为培养物；
②
菌液中糖含量降至10～15g/l时，开始顺序补充补料a、补料b、补料c，过程中控制糖含量在5～15g/l范围内；
③
待补料全部用完，且菌液中残糖降至1g/l左右，留下300～400ml菌液其余部分放出；
④
在发酵罐中重新添加发酵基础培养物；
⑤
重复
②
～
④
过程10～15次，完成重复批次培养。
39.发酵控制：通气量3l/min，搅拌桨转速设置为800rpm/min，维持温度36.5℃，ph 8.5
±
0.2范围内。
40.结果分析：在重复批次发酵培养过程中，分阶段取样进行分析，确定菌液中pha的含量，计算产量并计算同等条件下单批次发酵和重复批次发酵的pha产出情况。
41.单批次发酵：每次发酵约50小时，期间停顿洗罐、消毒等需24小时，750h进行10批次发酵，收获菌液的pha含量均稳定在70%～ 75%范围内，产量约3.08kg。
42.重复批次发酵：单次重复约50h，750h进行15罐次重复发酵，收获菌液的pha含量均稳定在70%～75%范围内，pha分子量与单批次发酵无明显区别，产量约4.59kg。
43.以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。