培养基中纤维母细胞生长因子活化剂的使用

培养基中纤维母细胞生长因子活化剂的使用
1.相关申请案的交叉引用
2.本技术主张2020年1月21日申请的第62/963,819号美国临时专利申请案的优先权，其内容在此通过引用其整体并入本文中。
技术领域
3.本发明一般是有关细胞生长。更具体地，本发明是有关包含一种或多种纤维母细胞生长因子活化剂的多种无血清细胞生长培养基以及在所述多种培养基中生长多个细胞从而生产培养肉的多种方法。


背景技术：

4.目前世界人口已超过70亿，并且仍在快速增长。为了满足这样不断增长的人口的营养需求，越来越多的土地专门用于粮食生产。所述多种自然资源不足以满足所述需求。这导致了世界一些地区的饥荒。在世界其他地区，这个问题正在通过在多个恶劣条件下多个密集的工厂化农场中大规模多种动物的生产来解决。这种大规模生产不仅给多种动物带来了巨大的痛苦，而且由于多个有机砷化合物和多种抗生素用于提高食品效率和控制感染，因此增加了多种肉制品中的多个砷水平和抗药性细菌，从而进一步增加了多种疾病的数量并恶化其对多种动物和人类的所述多个后果。需要大规模屠宰以满足当前多种食品需求，并且因此可能导致大规模疾病爆发，例如猪瘟病毒和狂牛症的所述发生。这些疾病导致供人类食用的所述肉类的损失，从而完全否定了最初饲养所述多种动物的所述目的。
5.此外，大规模生产降低了所述成品的所述风味。在那些能够负担得起非层架笼生产的蛋和非层架笼生产的肉的人们中存在偏好。这不仅是一口味问题，也是一更健康的选择，从而避免食用各种饲料添加剂，如多种生长激素。与大规模动物生产相关的另一个问题是由来自所述多种动物的大量粪便引起的所述环境问题，所述环境随后必须处理这些问题。此外，目前生产所述多种动物或所述多种动物的所述饲料所需的大量土地不能用于其他多种用途，例如种植其他作物、住房、娱乐、野生自然和森林，这是一个问题。
6.本领域已知的多种技术的所述多个主要问题之一是，由于生产时间长且成本极高，产品质量一般，不能也不会取代所述目前源自牲畜的肉。例如，just-inc.在培养基中生长多个提取的动物细胞来制造多个鸡块，每块鸡块的制造成本为50美元。
7.多个细胞的培养，例如多个哺乳动物细胞或多个昆虫细胞，用于多个体外实验或离体培养，以施用于一人类或动物，是多种人类疾病的多个研究和多个治疗的一重要工具。细胞培养广泛用于生产各种生物活性产品，例如多种病毒疫苗、多种单克隆抗体、多种多胜肽生长因子、多种激素、多种酶、多种肿瘤特异性抗原和多种食品。然而，许多用于培养所述多个细胞的所述多种培养基或多种方法包含对细胞生长和/或一未分化细胞培养的维持具有多个负面影响的多种组分。例如，哺乳动物或昆虫细胞培养基通常补充有血液来源的血清，如胎犊血清(fetal calf serum，fcs)或胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)，以提供多种生长因子、多种载体蛋白、多种附着和扩散因子、多种营养物质和多种微量元素。以促
进培养中多个细胞的增殖和生长。然而，在fcs或fbs中发现的所述多种因子，例如转化生长因子(tgf)-β或视黄酸，可以促进某些细胞类型的分化(ke等人,am j pathol.137:833-43,1990)或在所述多个细胞中启动意外的下游讯息传递，从而促进培养中不需要的细胞活动(veldhoen等人,nat immunol.7(11):1151-6,2006)。
8.培养基的所述成本是培养肉生产的所述成本的所述主要驱动因素。培养基由相对简单的基础培养基组成，包含多种碳水化合物、多种胺基酸、多种维生素和多种矿物质以及更昂贵的血清替代组分，所述组分包括：白蛋白、多种生长因子、多种酶、多种附着因子和多种激素。为了消除多种动物组分的所述使用，工业界目前正依赖多种重组人类蛋白在细胞疗法和疫苗生产中的多种应用。然而，多种培养肉的应用不限于多种人类蛋白的所述使用，因此可以潜在地利用一更容易获得的适合人类食用的多种材料的来源。
9.多个纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factor，fgf)是多个肝素结合细胞讯息传递蛋白的一家族。所述fgf家族的多个成员是多个多功能蛋白，参与多种生物过程，包括胚胎发育、器官发生、细胞增殖、细胞迁移、细胞分化和整合素表现(burgess等人,annu rev biochem 58,575-606,1989；rifkin等人,j cell biol 109,1-6,1989；basilico等人,adv cancer res 59,115-165,1992)。在多种哺乳动物中，所述fgf超家族中有20多种不同的亚家族成员蛋白，其中18个亚家族成员与四种讯息传递酪氨酸激酶fgf受体(tyrosine kinase fgf receptor，fgfr)相互作用(beenken等人,nat rev drug discov 8,235-253,2009)。这种相互作用导致数种讯息传递途径的下游活化，包括磷脂酶c-γ(phospholipase c-γ，plcγ)、磷脂肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，pi3k)和促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，mapk)途径。
10.多个fgf是重要的多个促分裂原。它们是用于多个细胞疗法、多个醣基化蛋白质、疫苗和培养肉的生物制造的多种培养基的多个关键组分。动物源性或重组人类fgf的成本是所述多种培养基的所述成本的一重要部分，也是培养肉的所述商业现实的一主要障碍。此外，对于多种治疗应用及培养肉，优选在多个化学限定条件下在多种无动物组分(xeno-free，无异种来源)培养基中培养所述多个细胞。因此，寻找替代多个fgf的多个小分子将在培养肉和细胞疗法的所述领域提供有希望的进展。因此，需要没有多个生长或附着因子血清组分的所述多个不良副作用的多种细胞培养基。本公开满足了这种长期存在的需要。


技术实现要素：

11.本公开部分基于可活化所述纤维母细胞生长因子(fgf)讯息传递途径的多个小分子的所述鉴定。这些小分子或fgf活化剂包括，但不限于pf-05231023(t2dm的一fgf21类似物)、id-8(一吲哚衍生物)、1-氮杂坎帕罗酮(1-azakenpaullone；所述wnt途径的一活化剂)、他克莫司(tacrolimus；fk-506)(一大环内酯抗生素；macrolide antibiotic)及(e/z)-bci氢氯化物((e/z)-bci hydrochloride；过度活化fgf的一dusp6抑制剂)或其一组合。这些长效小分子可以替代多种培养基中fgf的所述作用，并且支持具有成本效益的细胞增殖。在多种培养基中使用这种小分子显着降低了用于生产培养肉的所述多种培养基的所述成本。
12.本公开的一个方面提供了一种细胞培养基，所述细胞培养基包含一种无血清培养基及一种或多种纤维母细胞生长因子(fgf)活化剂。
13.在一些实施例中，所述培养基包含少于1ng/ml的纤维母细胞生长因子(fgf)、表皮生长因子(epidermal growth factor，egf)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，tgf-β)或其一组合。
14.在一些实施例中，所述细胞培养基实质上不含任何基于蛋白质的生长因子，其中所述基于蛋白质的生长因子不包括基于胜肽的激素或基于类固醇的激素。在一些实施例中，所述多个基于蛋白质的生长因子刺激细胞生长和增殖。在一些实施例中，所述基于胜肽的激素为胰岛素。在一些实施例中，所述基于类固醇的激素为可体松或其一衍生物。
15.在一些实施例中，所述一种或多种fgf活化剂为活化fgf讯息传递途径的一种或多种小分子。在一些实施例中，所述一种或多种小分子包含用于第2型糖尿病(t2dm)的一fgf21类似物、一吲哚衍生物、所述wnt途径的一活化剂、具有一免疫抑制特性的一大环内酯抗生素、fgf讯息传递的一下游途径的一负调节剂的一标的或其一组合。
16.在一些实施例中，所述一种或多种小分子包含用于第2型糖尿病(t2dm)的一fgf21类似物。在一些实施例中，所述fgf21类似物为pf-05231023。
17.在一些实施例中，所述一种或多种小分子包含一吲哚衍生物。在一些实施例中，所述吲哚衍生物为id-8。
18.在一些实施例中，所述一种或多种小分子包含所述wnt途径的一活化剂。在一些实施例中，所述活化剂为肝糖合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，gsk3β)的一抑制剂。在一些实施例中，所述活化剂为1-氮杂坎帕罗酮。
19.在一些实施例中，所述一种或多种小分子包含具有一免疫抑制特性的一大环内酯抗生素。在一些实施例中，所述大环内酯抗生素为他克莫司(fk-506)。
20.在一些实施例中，所述一种或多种小分子包含fgf讯息传递的一下游途径的一负调节剂的一标的。在一些实施例中，所述标的是通过活化erk途径过度活化fgf途径的一抑制剂。在一些实施例中，所述抑制剂为一dusp6抑制剂。在一些实施例中，所述dusp6抑制剂为(e/z)-bci氢氯化物。
21.在一些实施例中，id-8的一浓度约为0.5μm至约50μm。在一些实施例中，id-8的一浓度约为1μm至约10μm。
22.在一些实施例中，fk-506的一浓度约为1nm至约20nm。在一些实施例中，fk-506的一浓度约为1nm至约2nm。
23.在一些实施例中，所述一种或多种小分子包含id-8及fk-506。
24.还在一些实施例中，id-8的一浓度约为0.5μm至约50μm并且fk-506的一浓度约为1nm至约20nm。
25.在一些实施例中，id-8的一浓度约为1μm至约10μm并且fk-506的一浓度约为1nm至约2nm。
26.本公开的另一方面提供了一种套组，其包含本文公开的细胞培养基中的任一种及使用说明。
27.本公开的又一方面提供了一种通过在本文公开的细胞培养基中的任一种中培养多个细胞来生产一培养肉以及从所述多个培养细胞生产一培养肉的方法。
28.在一些实施例中，所述多个细胞来自多个可食用动物。在一些实施例中，所述可食用动物为牲畜、狩猎动物、家禽、鱼、甲壳类动物或软体动物。
29.在一些实施例中，所述方法包含多个培养细胞，其中所述多个细胞为多个纤维母细胞。在一些实施例中，所述多个纤维母细胞为多个牛的纤维母细胞或多个鸡的纤维母细胞。
30.本公开的又另一方面提供了一种通过上述和本文公开的所述多种方法生产的培养肉。
31.本公开的还又一方面提供了一种通过在本文公开的细胞培养基中的任一种中培养多个细胞来体外生长多个细胞的方法。
32.本发明的还一方面提供了一种在一细胞培养基中使用一种或多种fgf活化剂的用途，其中所述培养基实质上不含任何基于蛋白质的生长因子，且其中所述基于蛋白质的生长因子不包括基于胜肽的激素或基于类固醇的激素。
附图说明
33.本发明的上述多个方面和其他多个特征在以下描述中结合所述多个附图进行解释，其中：
34.图1描绘了在无血清培养基悬浮液中培养的多个牛纤维母细胞中用id-8及/或fk-506替代fgf。
35.图2描绘了在无血清培养基悬浮液中培养的多个鸡纤维母细胞中用id-8及fk-506替代fgf。
36.图3描绘了在多个无血清培养基中培养的多个绵羊纤维母细胞中用各种浓度的id-8及fk-506替代fgf。
具体实施方式
37.为了促进对本公开的所述多个原理的一理解，现在将参考多个实施例并且将使用特定语言对其进行描述。然而，应当理解，并不意在限制本公开的所述范围，如本公开所涉及的本领域技术人员通常会想到的如本文所说明的本公开的这种改变和多个进一步修改。
38.本文使用的所述术语仅出于描述多个特定实施例的所述目的，并不旨在限制本发明。
39.如本文所用，一细胞培养基“没有任何基于蛋白质的生长因子”或“没有纤维母细胞生长因子”，或一细胞培养基“实质上没有任何基于蛋白质的生长因子”或“实质上没有纤维母细胞生长因子”是指不包含任何可检测量的基于蛋白质的生长因子或纤维母细胞生长因子(fgf)的一培养基。所述术语“不可检测”被理解为基于本公开时本领域已知的标准检测的多种方法。在一些实施例中，所述培养基可包含少于1ng/ml(0ng/ml至少于1ng/ml)的基于蛋白质的生长因子或fgf。在一些实施例中，所述培养基可包含少于0.5ng/ml(0ng/ml至少于0.5ng/ml)的基于蛋白质的生长因子或fgf。在一些实施例中，所述培养基可包含少于0.1ng/ml(0ng/ml至少于0.1ng/ml)的基于蛋白质的生长因子或fgf。
40.如本文所用，“一基于蛋白质的生长因子”刺激细胞生长和增殖，其包括，但不限于fgf、表皮生长因子(egf)、转化生长因子-β(tgf-β)或其一组合。
41.如本文所用，一“无血清”培养基是指不含动物或人类血清的一培养基，其中所述多种组分不是衍生、获得、来源或产生自多种动物。预期所述多种组分是重组产生的或衍生
自多种植物或一动物以外的多种来源。
42.如本文所用，“基底培养基(basal media或basal medium)”、“基础培养基(base media或base medium)”、或“基础营养培养基(base nutritive media或base nutritive medium)”是指一基底盐营养物或多种盐和其他多种元素的一水溶液，为多个细胞提供水和某些对正常细胞代谢至关重要的大量无机离子，并维持细胞内和细胞外渗透平衡。在一些实施例中，一基础培养基包含至少一种碳水化合物作为能量来源，及/或缓冲系统以将所述培养基维持在所述生理ph范围内。多种可市面上购得的基础培养基的多个示例包括，但不限于磷酸盐缓冲生理盐水(pbs)、达尔伯克改良伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle's medium，dmem)、最低必需培养基(minimal essential medium，mem)、基础eagle培养基(basal medium eagle，bme)、rpmi1640、ham's f-10、ham's f-12、α-最低必需培养基(α-minimal essential medium，αmem)、格拉斯哥最低必需培养基(glasgow's minimal essential medium，g-mem)、伊斯科夫改良达尔伯克培养基(iscove's modified dulbecco's medium)，或为多个多能细胞使用而改良的多种通用培养基，例如x-vivo(lonza)或一造血基础培养基。
43.如本文所用，一“完全培养基”是指一基底培养基，其还包含多种添加的补充物，例如多种生长因子、多种激素、多种蛋白质、血清或血清替代物、多种微量元素、多种糖、多种抗生素、多种抗氧化剂等，它们可以促进细胞生长。例如，一可市面上购得的完全培养基包含多种补充物，例如乙醇胺、谷胱甘肽(还原)、抗坏血酸磷酸盐、胰岛素、人类运铁蛋白、一富含脂质的牛血清白蛋白、多种微量盐、亚硒酸钠、偏钒酸铵、硫酸铜及氯化锰(dmem advanced
tm
培养基，life technologies)。
44.如本文所用，一“液体基础混合物”或“基础生理缓冲液体混合物”是指多个脂质体悬浮于其中以完成所述细胞培养基组合物的所述血清替代物或培养基补充物的所述基础液体溶液。预期将所述液体基础混合物加载到所述多个脂质体中，使得所述脂质体在融合到细胞培养中的多个细胞/被多个细胞吸收时将一定量的所述液体基础混合物递送至多个细胞。本文还预期所述液体基础混合物或基础生理缓冲液体混合物是一基础培养基、一完全培养基或一生理缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲生理盐水(pbs)和其他多种平衡盐溶液，其可与本文的所述多个脂质体及/或其他多种组分结合使用以形成一血清替代物、一完全培养基、一培养基补充物或一冷冻保存培养基。
45.如本文所用，一“培养基”或“细胞培养基”是指提供多个细胞的所述生长、活力或储存的一水基溶液。如本文所考虑的一培养基可以补充有一种或多种营养物以促进所述所需的细胞活性，例如所述培养基中培养的所述多个细胞的细胞活力、生长、增殖、分化。如本文所用，一培养基包括一血清替代物、一培养基补充物、一完全培养基或一冷冻保存培养基。一培养基的所述ph应适合将要生长的所述多个微生物。大多数细菌在ph 6.5至7.0中生长，而大多数动物细胞在ph 7.2至7.4中生长旺盛。
46.如本文所用，一“培养基补充物”是指在多个细胞的培养之前添加到基础培养基中的一试剂或组合物。一培养基补充物可以是对培养中的细胞生长有益的一试剂，例如生长因子、激素、蛋白质、血清或血清替代物、微量元素、糖、抗生素、抗氧化剂等。通常，一培养基补充物是将所述所需补充物的一浓缩溶液稀释成一完全培养基或基础培养基，以达到所述适合细胞培养的最终浓度。
47.如本文所用，“血清替代物”或“血清替代培养基”是指可与一基底培养基结合使用或作为一完全培养基以促进培养中的细胞生长和存活的一组合物。血清替代物在基底或完全培养基中用作任何血清的一替代物，这些血清是典型地添加到用于体外多个细胞的培养的培养基中。预期所述血清替代物包含用于培养中多个细胞的生长和存活的多个蛋白质和其他多个因子。在用于细胞培养之前，将所述血清替代物添加到一基底培养基中。进一步预期一血清替代物可包含一基础培养基和多个基础营养物，例如多种盐、多种胺基酸、多种维生素、多种微量元素、多种抗氧化剂等，使得所述血清替代物可用作细胞培养的一无血清完全培养基。
48.如本文所用，所述术语“多个结缔组织细胞”是指构成结缔组织的各种细胞类型。例如，多个结缔组织细胞是多个纤维母细胞、多个软骨细胞、多个骨细胞、多个脂肪细胞和多个平滑肌细胞，或可以从一纤维母细胞自然分化的一细胞类型。如本文所用，所述术语“自然分化”或“自然地自
…
分化”用于指在自然界中发生的一分化，而不是一反式分化，例如可以在一实验室中人工实现且不是逆分化的反式分化。可以从一纤维母细胞自然分化的一细胞类型包括一软骨细胞、一脂肪细胞、一成骨细胞、一骨细胞、一肌纤维母细胞、一卫星细胞、一肌母细胞和一肌细胞。多个结缔组织细胞不是多个间质干细胞(msc)或衍生自多个msc或多个多能细胞的多个细胞。
49.在一些实施例中，一结缔组织细胞选自由以下组成的所述群组：一软骨细胞、一脂肪细胞、一成骨细胞、一骨细胞、一肌纤维母细胞、一卫星细胞、一肌母细胞及一肌细胞。在一些实施例中，一结缔组织细胞选自由以下组成的所述群组：一脂肪细胞、一成骨细胞、一骨细胞、一肌纤维母细胞、一卫星细胞、一肌母细胞及一肌细胞。在一些实施例中，一结缔组织细胞是一纤维母细胞。
50.如本文所用，所述片语“自发永生化纤维母细胞”是指一纤维母细胞，其能够进行无限的细胞分裂，并且优选地还能够进行细胞扩增，而不会受到人为突变，例如基因操作，从而导致所述永生化。所述自发永生化纤维母细胞是非基因改造的。
51.如本文所用，一“小分子”是可以调节一生物过程的一低分子量(《900道耳顿)有机化合物，其直径约为1nm。多个较大的结构如多个核酸和多个蛋白质、以及许多多醣不是多个小分子，尽管它们的多个构成单体(分别为多个核糖或去氧核糖核苷酸、多个胺基酸和多个单醣)通常被认为是多个小分子。
52.如本文所用，关于所述一种或多种小分子(即，多个fgf活化剂)的所述多个术语“替代fgf讯息传递”、“替代fgf”及“活化fgf讯息传递途径”是可互换的，因为这些活化剂替代了所述培养基中fgf的所述作用，并且支持具有成本效益的细胞增殖。
53.应注意的是，在本公开内容中，特别是在所述多个权利要求及/或多个段落中，诸如“包含(comprise、comprised、comprising)”等多个术语可以具有美国专利法中赋予它的所述含义；例如，它们可以表示“包括(include、included、including)”等；并且诸如“实质上由
……
组成(consisting essentially of及consist essentially of)”等多个术语具有美国专利法赋予它们的所述含义，例如，它们允许未明确列举的多个元素，但排除在现有技术中发现的或影响本发明的一基本或新颖特征的多个元素。
54.本文公开了一种细胞培养基，其包含一无血清培养基及一种或多种纤维母细胞生长因子(fgf)活化剂。在一些实施例中，所述细胞培养基实质上不含任何基于蛋白质的生长
因子，所述基于蛋白质的生长因子不包括基于胜肽的激素或基于类固醇的激素。本文还公开了在上述和本文公开的细胞培养基中培养多个细胞并且利用这种多个培养生产培养肉的多种方法。本文所公开的细胞培养基也可用于多种套组。令人惊讶地发现，多种fgf活化剂可用于多种细胞培养基替代多种生长因子，以支持具有成本效益的细胞增殖。在多种培养基中使用这些fgf活化剂显着降低了用于生产培养肉的所述多种培养基的所述成本。
55.在多种fgf活化剂中，多种吲哚衍生物，例如id-8，显示支持无血清培养中小鼠的多个esc的自我更新(miyabayashi等人,biosci biotechnol biochem 72,1242-1248,2008)，而id-8、1-氮杂坎帕罗酮及他克莫司的所述组合被发现支持无血清培养中人类的多个esc的自我更新(yasuda等人,nat biomed eng 2,173-182,2018)。id-8是双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶(dyrk)的一化学抑制剂。1-氮杂坎帕罗酮是一种有效的、选择性的肝糖合成酶激酶3β(gsk3β)抑制剂，因此活化所述wnt途径。他克莫司(fk-506)是一种具有多个免疫抑制特性的大环内酯抗生素。他克莫司抑制钙调磷酸酶，导致多个钙依赖性事件的抑制，例如白细胞介素-2基因转录、一氧化氮合成酶活化、细胞去颗粒作用及细胞凋亡(thomson等人,ther drug monit 17,584-591,1995)。据报道，另一种小分子pf05231023作为fgf21的一类似物起作用(thompson等人,j pharmacokinet pharmacodyn 43,411-425,2016)。
56.靶向fgf讯息传递的所述多个下游途径的多个负调节剂是另一种寻找可以替代fgf的多个小分子的方法。这些抑制剂中的一种是(e/z)-bci氢氯化物，一dusp6抑制剂通过活化erk途径过度活化fgf途径已在斑马鱼心脏模型中显示(molina等人,nat chem biol 5,680-687,2009)。
57.本公开考虑在多种细胞培养基中添加一种或多种生长因子活化剂，例如替代纤维母细胞生长因子(fgf)讯息传递的一种或多种小分子。因此，本公开的一个方面提供了一种细胞培养基，其包含一无血清培养基和一种或多种fgf活化剂。在一些实施例中，所述细胞培养基实质上不含任何基于蛋白质的生长因子，所述基于蛋白质的生长因子不包括基于胜肽的激素或基于类固醇的激素。在一些实施例中，所述一种或多种fgf活化剂是活化fgf讯息传递途径的一种或多种小分子。
58.多种哺乳动物包含18种fgf类型(fgf1-fgf10及fgf16-fgf23)，根据系统发生和序列相似性将其分为六个不同的亚家族。四(4)个fgf共享一个相似的内部核心，并且对肝素和多种纤维母细胞生长因子受体(fgfr)都具有典型地的高结合亲和力。多种fgfr是多种酪氨酸激酶受体，包含一个肝素结合序列、三个细胞外免疫球蛋白样结构域(d1-d3)、一个疏水性跨膜结构域和一个分裂的细胞内酪氨酸激酶结构域。所述哺乳动物fgfr家族由四个成员(fgfr1-fgfr4)组成。所述多个受体的所述多个胺基酸序列是高度保守，仅在其配体亲和力和组织分布中发生分化。多种fgfr的特征是所述酸框(acid box)，它是d1结构域与d2结构域之间的所述连接区中一富含丝氨酸的酸性序列(beenken等人，nat rev drug discov 8,235-253,2009)。所述酸框及d1结构域被认为在受体自身抑制中起作用。所述d2-d3片段是配体特异性和结合所必需的。在多种脊椎动物中，四个基因编码所述多种fgfr(fgfr1-fgfr4)，并在其细胞外结构域进行选择性剪接，从而产生许多对其多种配体具有不同多种亲和力的fgfr1-fgfr4。
59.所述fgf讯息传递串接由多种fgf配体与多种fgfr的所述结合启动。在fgf结合后，
发生一配体依赖性二聚化作用事件，其中形成由两个fgf、两个硫酸乙醯肝素链(heparin sulfate chain)和两个fgfr组成的一复合物。每一个配体都与两个受体结合，所述受体通过所述d2结构域上的一个区块相互接触。这促进了每一个受体单体通过内在酪氨酸激酶结构域的所述转磷酸化作用。已经确定了fgfr1的至少七个磷酸化位点(tyr
163
、tyr
583
、tyr
585
、tyr
653
、tyr
654
、tyr
730
及tyr
766
)。多个磷酸酪氨酸基团充当调节下游讯息传递的多个转接蛋白的多个对接位点。所述fgf系统与数个下游讯息传递途径相关，其中最了解的是所述ras/促分裂原活化蛋白(mitogen-activating protein，map)激酶途径、所述磷脂肌醇3(phosphoinositide 3，pi3)激酶/akt途径及所述磷脂酶c-γ(phospholipase c gamma，plcγ)途径。
60.与fgf讯息传递相关的所述主要下游途径是所述ras/map激酶途径。此途径涉及细胞增殖和分化。多个map激酶是多个丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，响应细胞外刺激并调节各种细胞过程。多种map激酶效应物的多个示例包括c-jun氨基末端激酶(c-jun n-terminal kinase，jnk)、细胞外讯息调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，erk)及p38促分裂原活化激酶(p38 mitogen-activated kinase)。在一fgf配体与其受体结合后，所述讯息传递途径中的一个不可或缺的步骤是所述转接蛋白纤维母细胞生长因子受体基质2α(fibroblast growth factor receptor substrate 2alpha，frs2α)上所述多个酪氨酸残基的所述磷酸化。这允许与讯息活化相关的多个转接蛋白的结合。然后形成由frs2α、鸟嘌呤核苷酸交换因子2(guanine nucleotide exchange factor 2，grb2)、grb2相关结合蛋白1(grb2-associated binding protein 1，gab1)、无七之子(the son of sevenless，sos)及酪氨酸磷酸酶(tyrosine phosphatase，shp2)组成的一frs2复合物，促进所述ras/map激酶和pi3激酶/akt途径的活化。
61.所述pi3激酶/akt途径与细胞存活和细胞命运决定相关。此途径也可能影响细胞极性。与所述ras/map激酶途径一样，所述pi3激酶/akt途径在一frs2讯息传递复合物形成时启动。然后gab1蛋白将活化的多个fgfr与pi3激酶连接起来。pi3激酶的下游，磷酸肌醇依赖性激酶和akt(一种抗凋亡蛋白激酶)被活化。
62.活化的fgfr的另一个标的分子是plcγ。此途径在所述plcγ分子与所述受体的所述磷酸化的tyr766的所述结合时被活化。然后通过活化的plcγ的所述水解生成三磷酸肌醇(inositol triphosphate，ip3)及二醯基甘油(diacylglycerol，dag)。响应ip3从所述内质网释放的dag及细胞质钙一起活化蛋白激酶c(protein kinase c，pkc)。尽管尚未完全阐明，所述plcγ激酶途径影响细胞形态、迁移和附着。
63.所述下表包含可从sigma-aldrich公司获得的多个接受的调节剂及附加信息。
64.表1.多个调节剂及附加信息
65.66.67.[0068][0069]
表格内的多个缩写：pd161570：1-三级丁基-3-[6-(2,6-二氯-苯基)-2-(4-二乙氨基-丁氨基)-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]脲；pd166285：6-(2,6-二氯苯基)-2-[[4-[2-(二乙氨基)乙氧基]苯基]氨基]-8-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-一种二盐酸盐；pd166866：1-[2-氨基-6-(3,5-二甲氧基-苯基)-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-3-三级丁基-脲；pd173074：n-[2-[[4-(二乙氨基)丁基]氨基-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-n'-(1,1-二甲基乙基)-脲；su5402：3-[4-甲基-2-(2-氧代-1,2-二氢-吲哚-3-亚甲基)-1h-吡咯-3-基]-丙酸。
[0070]
虽然没有已知的所述多种fgf受体的多个活化剂，但存在多种上游和下游活化剂，所有这些都可以被调节成为多种fgf活化剂。由于涉及fgf讯息传递的多种途径，本公开内容考虑了涉及模拟fgf活化的所述多种途径中的任一种的多种小分子。
[0071]
在一些实施例中，所述一种或多种小分子包含用于第2型糖尿病(t2dm)的一fgf21类似物、一吲哚衍生物、所述wnt途径的一活化剂、具有一免疫抑制特性的一大环内酯抗生素、fgf讯息传递的一下游途径的一负调节剂的一标的或其一组合。
[0072]
在一些实施例中，所述一种或多种小分子包含用于第2型糖尿病(t2dm)的一fgf21类似物。在一些实施例中，所述fgf21类似物为pf-05231023。
[0073]
在一些实施例中，所述一种或多种小分子包含一吲哚衍生物。在一些实施例中，所述吲哚衍生物为id-8。
[0074]
在一些实施例中，所述一种或多种小分子包含所述wnt途径的一活化剂。在一些实施例中，所述活化剂为肝糖合成酶激酶3β(gsk3β)的一抑制剂。在一些实施例中，所述活化剂为1-氮杂坎帕罗酮。
[0075]
在一些实施例中，所述一种或多种小分子包含具有一免疫抑制特性的一大环内酯抗生素。在一些实施例中，所述大环内酯抗生素为他克莫司(fk-506)。
[0076]
在一些实施例中，所述一种或多种小分子包含fgf讯息传递的一下游途径的一负调节剂的一标的。在一些实施例中，所述标的是通过活化erk途径过度活化fgf途径的一抑制剂。在一些实施例中，所述抑制剂为一dusp6抑制剂。在一些实施例中，所述dusp6抑制剂为(e/z)-bci氢氯化物。
[0077]
所述一种或多种小分子的所述浓度取决于所述小分子的所述活性。确定添加到所述多种培养基中的所述小分子的所述最佳浓度在本领域普通技术人员的所述范围内。在一些实施例中，所述多种培养基中的所述小分子的所述浓度可以为约0.1nm至约100μm、约1nm至约10μm、或约10nm至约1μm。在一些实施例中，所述多种培养基中的所述小分子的所述浓度可以是约0.1nm、0.2nm、0.3nm、0.4nm、0.5nm、0.6nm、0.7nm、0.8nm、0.9nm、1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm或1mm。
[0078]
在一些实施例中，所述一种或多种小分子包含id-8、fk-506或其一组合。在一些实施例中，id-8的一浓度约为0.5μm至约50μm。在一些实施例中，id-8的一浓度约为0.5μm至约40μm。在一些实施例中，id-8的一浓度约为0.5μm至约30μm。在一些实施例中，id-8的一浓度约为0.5μm至约20μm。在一些实施例中，id-8的一浓度约为0.5μm至约10μm。
[0079]
在一些实施例中，id-8的一浓度约为1μm至约50μm。在一些实施例中，id-8的一浓度约为1μm至约40μm。在一些实施例中，id-8的一浓度约为1μm至约30μm。在一些实施例中，id-8的一浓度约为1μm至约20μm。在一些实施例中，id-8的一浓度约为1μm至约10μm。在一些实施例中，id-8的一浓度约为1μm至约5μm。
[0080]
在一些实施例中，id-8的一浓度约为5μm。
[0081]
在一些实施例中，fk-506的一浓度约为1nm至约20nm。在一些实施例中，fk-506的一浓度约为1nm至约10nm。在一些实施例中，fk-506的一浓度约为1nm至约5nm。在一些实施例中，fk-506的一浓度约为1nm至约2nm。
[0082]
在一些实施例中，fk-506的一浓度约为1nm。
[0083]
在一些实施例中，id-8的一浓度约为0.5μm至约10μm并且fk-506的一浓度约为1nm
至约2nm。
[0084]
还在一些实施例中，id-8的一浓度约为1μm至约5μm并且fk-506的一浓度约为1nm至约2nm。
[0085]
在一些实施例中，所述无血清培养基实质上不含动物污染物。
[0086]
在一些实施例中，所述无血清培养基实质上不含人类污染物。
[0087]
在一些实施例中，所述无血清培养基实质上不含任何抗生素药物。
[0088]
本公开的另一方面提供了一种通过在本文公开的细胞培养基中的任一种中培养多个细胞来生产一培养肉以及从所述多个培养细胞生产一培养肉的方法。本公开的又一方面提供了一种通过本文公开的所述多种方法生产的培养肉。
[0089]
在一些实施例中，所述多个细胞来自多个可食用动物。在一些实施例中，所述多个细胞的所述来源是任何需要食用的任何可食用物种，包括但不限于牲畜、狩猎动物、家禽、鱼、贝类、甲壳类动物及软体动物。
[0090]
在一些实施例中，所述多个细胞的所述来源为一牲畜，例如牛、绵羊、猪、山羊、羔羊、马、驴、兔及骡。在一些实施例中，所述多个细胞的所述来源为传统上被认为是“狩猎动物”的一动物，例如驯鹿、熊、野猪、鹿、麋鹿及驼鹿。在一些实施例中，所述多个细胞的所述来源为一家禽，例如鸡、鸭、鹅、珠鸡、鹌鹑及火鸡。在一些实施例中，所述多个细胞的所述来源为一鱼，例如美洲鲈、鲤鱼、土虱、智利海鲈鱼、鳕鱼、比目鱼、大比目鱼、鲯鳅、鮟鱇鱼、梭子鱼、鲈鱼、胸棘鲷、鲑鱼、鲱鱼、鲷鱼、旗鱼、吴郭鱼、鳟鱼及鲔鱼。在一些实施例中，所述多个细胞的所述来源为一甲壳类动物，例如蟹、螯虾、龙虾、明虾及小虾。在一些实施例中，所述多个细胞的所述来源为一软体动物，例如蛤、贻贝、章鱼、牡蛎、扇贝及乌贼。
[0091]
在一些实施例中，所述方法包含多个培养细胞，其中所述多个细胞为多个纤维母细胞。所述多个纤维母细胞可以来自一可食用的动物。在一实施例中，所述多个纤维母细胞为多个牛的纤维母细胞或多个鸡的纤维母细胞。
[0092]
多个鸡胚胎纤维母细胞广泛用于生产多种病毒和多种疫苗。它们与多个鸡胚胎肝细胞一起由多个无特定病原体(specific pathogen-free，spf)胚胎生产，并由charles river laboratories(威尔明顿，马萨诸塞州)和其他多间公司销售。虽然多个鸡肝细胞在培养中表现出有限的增殖，就像它们的多个哺乳动物对应物一样，多个鸡纤维母细胞可以经历超过30次群体倍增，产生约2.6吨细胞，然后在不致瘤的情况下自发永生。自发转化的多个鸡纤维母细胞，例如umnsah/df-1(crl-12203)，可以直接从attc(马纳萨斯，维吉尼亚州)购买。虽然纤维母细胞的所述生长潜力非常好，但所述多个细胞主要形成不可食用的结缔组织。
[0093]
鸡胚胎内皮细胞可以很容易地分离出来，但它们的生长潜力是未知的，并且可以是器官特异性的。多个小鼠内皮细胞可以进行30次群体倍增，而多个人类内皮细胞很少通过12次群体倍增。多个鸡胚胎肌肉细胞(多个肌细胞)可以类似地分离，但生长潜力非常有限。多个小鼠和人类肌肉细胞很少通过12次群体倍增。肌肉生成，即，新肌肉组织的所述形成，在大多数物种的所述新生儿生命阶段之后并不常见。本公开的多个小分子概念上可用于调节这种行为。
[0094]
在过去的十年中，许多团队生产了多个鸡胚胎干细胞(cesc)。多个细胞是从多个受精鸡蛋中分离出来的，并且实质上是永生的。多个鸡诱导的多能干细胞(cipsc)是通过多
个重编程因子oct4、nanog、sox2、lin28、klf4和c-myc以及最近使用oct4、klf4和c-myc的多个鸡纤维母细胞从多个鹌鹑胚胎纤维母细胞中产生的。多个细胞实质上是永生的，但经过基因工程改造。
[0095]
最近，使用多个小分子从多个纤维母细胞诱导多个小鼠多能干细胞，允许多种细胞类型的所述分化，包括多个肌细胞、多个肝细胞和多个内皮细胞以及多个复杂的类胚体。cipsc的化学诱导提供了一种将多个纤维母细胞转化为其他多种细胞类型的替代方法。
[0096]
多个化学化合物为通常用于支持细胞生长或通过重编程或分化将一种细胞类型转换为另一种细胞类型的多种生长因子和基因工程提供了一种有吸引力的替代方案。多个小分子更便宜，批次间变异性更低，并且是非免疫性的且更稳定。在一项研究中，使用一高含量筛选来鉴定促进多个初代人肝细胞增殖的小分子fph1和fph2(hou等人,science,341(6146):651-654,2013)。这种方法很有吸引力，因为小分子可以替代多种无血清培养基配方中的多种生长因子，从而在提高安全性的同时显著降低成本。
[0097]
在最近的一项研究中，鉴定了多个诱导人纤维母细胞转变为多个心肌细胞的九种化合物的一组合(shan等人,nature chemical biology,9:514-520，2013)，而其他人则使用一七种化合物的组合来转化多个小鼠纤维母细胞(cao等人,science,352(6290):1216-1220,2016)。考虑到许多所述讯息传递途径在多种不同动物之间是保守的，可以使用一相对相似的组合将多个鸡纤维母细胞转化为多个肌细胞。
[0098]
如上所述，细胞培养基通常含有提供多种附着因子、多种脂肪酸、多种生长因子、多种激素和白蛋白的胎牛血清(fbs)。fbs通常可以用由多种胺基酸、多种维生素和多种微量元素以及运铁蛋白、胰岛素和富含脂质的牛血清白蛋白组成的血清替代物(例如ko-血清)来替代。虽然运铁蛋白和胰岛素都是使用重组技术在细菌中产生的，但白蛋白通常是衍生自动物的。然而，植物和衍生自细菌的重组人类白蛋白(例如cellastim
tm
)可通过数家公司获得，包括sigma-aldrich(圣路易斯，密苏里州)。
[0099]
鸡纤维母细胞培养基传统上由补充有10％fbs、胰蛋白酶磷酸盐和麸胺醯胺的ml 99培养基组成。然而，用于多种哺乳动物纤维母细胞的所述生长的无血清培养基现在很容易获得。培养基由补充有0.5mg/ml白蛋白、0.6μm亚麻油酸、0.6μg/ml卵磷脂、5ng/nil bfgf、5ng/nil egf、30pg/ml tgfpi、7.5mm麸胺醯胺、1μg/ml氢化可体松、50μg/ml抗坏血酸和5μg/ml胰岛素的m199组成。这种培养基pcs-201-040可从atcc(马纳萨斯，维吉尼亚州)获得，并且据报导它支持多个人纤维母细胞的增殖速度提高4倍。多个鸡肝细胞相似地得到为多个人和小鼠肝细胞设计的一无血清培养基的支持。培养基由补充有白蛋白、胰岛素、运铁蛋白和氢化可体松的williams e基底培养基组成。
[0100]
灌注细胞培养基还可以包括一氧载体。基于血红素的多个氧载体包括重组的或化学修饰的、包封的血红素或修饰的(例如交联的)多个红血球细胞的多个血红素衍生物。多个替代品包括基于全氟碳化物的多个替代品，例如nahmias等人(the faseb journal，20(14):2531-2533)开发的多个替代品。
[0101]
应注意的是，通常，多个初代纤维母细胞能够进行一有限的细胞分裂，因此在大约30次群体倍增(例如10次继代)后经历细胞老化。生成永生化纤维母细胞样细胞株的多种方法包括使用已知的多种方法通过引入一端粒酶基因或sv40或hpve6/e7基因的遗传操作。
[0102]
预期其他多种禽类纤维母细胞也是合适的，例如鸭、鹅和鹌鹑纤维母细胞。
[0103]
本公开的又一方面提供了一种通过在本文公开的细胞培养基中的任一种中培养多个细胞来体外生长多个细胞的方法。
[0104]
本公开的还一方面提供了一种在一细胞培养基中使用一种或多种fgf活化剂的用途，所述培养基实质上不含任何基于蛋白质的生长因子，其中所述基于蛋白质的生长因子不包括基于胜肽的激素或基于类固醇的激素。
[0105]
预期本文描述的所述多种培养基，例如血清替代物、培养基补充物、完全培养基可用于体外多个细胞的培养，特别是对于通常需要多种血清补充物或多种限定培养基以在体外充分生长的多个细胞。这样的细胞包括多种真核细胞，例如多种哺乳动物细胞和多种昆虫细胞。预期受益于使用所述血清替代物、完全培养基或培养基补充物的多种哺乳动物细胞包括，但不限于仓鼠、猴、黑猩猩、狗、猫、牛/公牛、猪、小鼠、大鼠、兔、绵羊和人类细胞。多种昆虫细胞包括衍生自草地贪夜蛾(毛虫)、埃及斑蚊(蚊子)、白线斑蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)和家蚕的多个细胞。
[0106]
预期用所述血清替代物、完全培养基或培养基补充物培养的所述多个细胞是多个永生化细胞(一细胞株)或多个非永生化(初代或次代)细胞，并且可以是在体内发现的多种细胞类型中的任一种。多个示例性细胞类型包括，但不限于多个纤维母细胞、多个角质细胞、多个上皮细胞、多个卵巢细胞、多个内皮细胞、多个神经胶细胞、多个神经细胞、所述血液的形成元素(例如多个淋巴细胞、多个骨髓细胞)、多个软骨细胞和其他多个骨衍生细胞、多个肝细胞、多个胰脏细胞、及这些体细胞类型的多个前驱细胞。
[0107]
在一些实施例中，考虑与上文和本文公开的所述多种培养基一起使用的所述多个细胞分离自一哺乳动物受试者。从一哺乳动物受试者分离的多个细胞包括，但不限于多个多能干细胞、多个胚胎干细胞、多个骨髓基质细胞、多个造血先驱细胞、多个淋巴干细胞、多个骨髓干细胞、多个淋巴细胞、多个t细胞、多个b细胞、多个巨噬细胞、多个内皮细胞、多个神经胶细胞、多个神经细胞、多个软骨细胞和其他多个骨衍生细胞、多个肝细胞、多个胰脏细胞、多种体细胞类型的多个前驱细胞、及任何癌或肿瘤衍生细胞。
[0108]
在一些实施例中，所述多个细胞为一细胞株。多个示例性细胞株包括，但不限于多个中国仓鼠卵巢细胞，包括chok1、dxb-11、dg-44和cho/-dhfr；猴肾cv1、cos-7；人胚胎肾(hek)293；多个幼仓鼠肾细胞(bhk)；多个小鼠塞特利氏细胞(tm4)；多个非洲绿猴肾细胞(vero)；多个人类子宫颈癌细胞(hela)；多个犬肾细胞(mdck)；多个水牛大鼠肝细胞(brl 3a)；多个人类肺细胞(w138)；多个人类肝癌细胞(hep g2；sk-hep)；小鼠乳腺肿瘤(mmt)；多个tri细胞；多个mrc 5细胞；多个fs4细胞；一t细胞株(jurkat)、一b细胞株、小鼠3t3、rin、a549、pc12、k562、per.c6.rtm.、sp2/0、ns-0、u20s、ht1080、l929、多个融合瘤、多个肿瘤细胞、和多个永生化初代细胞。
[0109]
多个示例性昆虫细胞株包括，但不限于sf9、sf21、high five.tm.、expressf .rtm.、s2、tn5、tn-368、bmn、schneider 2、d2、c6/36及kc细胞。
[0110]
附加的多种细胞类型和多种细胞株在wo 2006/004728中公开，通过引用并入本文中。这些细胞包括，但不限于多个cd34 造血细胞和多个骨髓系的细胞、多个293胚胎肾细胞、a-549、jurkat、namalwa、heia、多个293bhk细胞、多个hela子宫颈上皮细胞、多个per-c6视网膜细胞(per.c6)、多个mdbk(nbl-i)细胞、多个911细胞、多个crfk细胞、多个mdck细胞、多个bewo细胞、多个chang细胞、多个detroit 562细胞、多个hela 229细胞、多个hela s3细
胞、多个hep-g2细胞、多个kb细胞、多个ls 180细胞、多个ls 174t细胞、多个nci-h-548细胞、多个rpmi 2650细胞、多个sw-13细胞、多个t24细胞、wi-28va13、多个2ra细胞、多个wish细胞、多个bs-c-i细胞、多个llc-mk2细胞、多个clone m-3细胞、多个1-10细胞、多个rag细胞、多个tcmk-i细胞、多个y-i细胞、多个llc-pk1细胞、多个pk(15)细胞、多个gh1细胞、多个gh3细胞、多个l2细胞、多个llc-rc 256细胞、多个mh1c1细胞、多个xc细胞、多个mdok细胞、多个vsw细胞、th-i、多个b1细胞或其多个衍生物、来自任何组织或器官(包括但不限于心、肝、肾、结肠、肠、食道、胃、神经组织(脑、脊髓)、肺、血管组织(动脉、静脉、微血管)、淋巴组织(淋巴腺、腺样体、扁桃腺、骨髓和血液)、脾、纤维母细胞和多个纤维母细胞样细胞株)的多个纤维母细胞、多个trg-2细胞、多个imr-33细胞、多个don细胞、多个ghk-21细胞、多个瓜胺酸血症细胞、多个dempsey细胞、多个detroit 551细胞、多个detroit 510细胞、多个detroit 525细胞、多个detroit 529细胞、多个detroit 532细胞、多个detroit 539细胞、多个detroit 548细胞、多个detroit 573细胞、多个hel 299细胞、多个mr-90细胞、多个mrc-5细胞、多个wi-38细胞、多个wi-26细胞、多个mic11细胞、多个cv-i细胞、多个cos-i细胞、多个cos-3细胞、多个cos-7细胞、多个vero细胞、多个dbs-frhl-2细胞、多个balb/3t3细胞、多个f9细胞、多个sv-t2细胞、多个m-msv-balb/3t3细胞、多个k-balb细胞、多个blo-i1细胞、多个nor-io细胞、多个c3h/ioti/2细胞、多个hsdm1c3细胞、多个kln205细胞、多个mccoy细胞、多个小鼠l细胞、多个品系2071(小鼠l)细胞、多个l-m品系(小鼠l)细胞、多个l-mtk(小鼠l)细胞、nctc克隆2472和2555、多个scc-psa1细胞、nso、ns1、多个swiss/3t3细胞、多个印度麂细胞、多个sirc细胞、多个cn细胞、多个jensen细胞、多个cos细胞和多个sp2/0细胞、多个模拟细胞及/或其多个衍生物。
[0111]
本文所考虑的多个细胞培养条件可适用于任何适合生长多个细胞的培养基质。具有一合适表面的多种基质包括多个组织培养孔、多个培养瓶、多个滚瓶、多个透气容器、多个平板或多个平行板生物反应器或多个细胞工厂。还考虑了多个培养条件，其中所述多个细胞附着在多个搅拌罐器皿中保持悬浮状态的多个微载体或多个颗粒。
[0112]
多种细胞培养方法一般描述于culture of animal cells:a manual of basic technique,6th edition,2010(r.i.freshney ed.,wiley&sons)；general techniques of cell culture(m.a.harrison&i.f.rae,cambridge univ.press)及embryonic stem cells:methods and protocols(k.turksen ed.,humana press)。其他多个参考文本包括creating a high performance culture(aroselli,hu.res.dev.pr.1996)及limits to growth(d.h.meadows等人,universe publ.1974)。多种组织培养用品和多种试剂是本领域技术人员熟知的并且是可市面上购得的。
[0113]
应当理解的是，将细胞以适合所述特定细胞株或分离的细胞类型与所述血清替代物、完全培养基或培养基补充物一起使用的多个密度置于培养中。在某些实施例中，细胞以1x 103、5x 103、1x 104、5x 104、1x 105、5x 105、1x 106或5x 106细胞/ml培养。
[0114]
还考虑了所述多种细胞培养基中的多种附加组分。在一些实施例中，所述细胞培养基可包含如本文所述的一基础培养基和多种补充物的一种或多种元素，例如多种盐、多种胺基酸、多种维生素、多种缓冲液、多种核苷酸、多种抗生素、多种微量元素、多种抗氧化剂和葡萄糖或一等效能量来源，使得所述细胞培养基能够用作一无血清完全培养基。
[0115]
多个示例性无机盐包括，但不限于磷酸钾、氯化钙(无水)、硫酸铜、硝酸铁、硫酸
铁、氯化镁(无水)、硫酸镁(无水)、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、无水磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化锡及硫酸锌。多个示例性有机盐包括，但不限于碳酸氢钠或hepes。
[0116]
多个示例性的糖包括，但不限于右旋糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖和这些糖的多个多聚体。
[0117]
多个示例性抗氧化剂包括，但不限于生育酚、参双键生殖酚、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-参双键生殖酚、β-参双键生殖酚、α-生育醌、trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸)、丁基羟基茴香醚(bha)、丁基羟基甲苯(bht)、类黄酮、异黄酮、茄红素、β-胡萝卜素、硒、泛醌、叶黄素、s-腺苷甲硫胺酸、麸胺基硫、牛磺酸、n-乙醯半胱胺酸、柠檬酸、肉碱、bht、硫代甘油、抗坏血酸、五倍子酸丙酯、甲硫胺酸、半胱氨酸、同半胱氨酸、麸胺基硫、胱胺和胱硫醚、以及甘氨酸-甘氨酸-组氨酸(三肽)。
[0118]
多个示例性微量元素包括，但不限于铜、铁、锌、锰、矽、钼酸盐、钼、钒、镍、锡、铝、银、钡、溴、镉、钴、铬、钙、二价阳离子、氟、锗、碘、铷、锆或硒。多个附加的微量金属在wo 2006/004728中公开。
[0119]
在一些实施例中，所述多种培养基或液体基础混合物包含一铁源或运铁蛋白。多个示例性的铁源包括，但不限于铁盐及亚铁盐，例如硫酸亚铁、柠檬酸亚铁、柠檬酸铁、硝酸铁、硫酸铁、多种铁铵化合物，例如柠檬酸铁铵、草酸铁铵、富马酸铁铵、苹果酸铁铵和琥珀酸铁铵。多个示例性的运铁蛋白包括，但不限于运铁蛋白及乳铁蛋白。
[0120]
在一些实施例中，所述多种培养基或液体基础混合物可包含如上所述的一基础培养基和多种补充物的一种或多种元素，例如多种盐、多种胺基酸、多种维生素、多种缓冲液、多种核苷酸、多种抗生素、多种微量元素、多种抗氧化剂和葡萄糖或一等效能量来源，使得所述细胞培养基能够用作一无血清完全培养基。
[0121]
在一些实施例中，所述多种培养基或液体基础混合物还可包含一铜源或运铜蛋白(例如，ghk-cu)。多个示例性铜源包括，但不限于氯化铜及硫酸铜。
[0122]
在一些实施例中，所述铁源或铜源以约0.05至250ng/ml、0.05至100ng/ml、约0.05至50ng/ml、约0.05至10ng/ml、约0.1至5ng/ml、约0.5至2.5ng/ml、或约1至5ng/ml。进一步预期所述铁源或铜源在所述血清替代物中的一最终浓度为约0.05、0.1、0.25、0.35、0.45、0.5、0.6、0.7、0.8、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10ng/ml。
[0123]
在一些实施例中，将所述血清替代物或培养基补充物添加到一基础培养基中。多种标准基础培养基在细胞培养领域是已知的并且是可市面上购得的。多种基础培养基的多个示例包括，但不限于达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem)、dmem f12(1:1)、伊斯科夫改良达尔伯克培养基、ham's营养混合物f-10或f-12、洛斯维帕克纪念研究所培养基(roswell park memorial institute medium，rpmi)、mcdb 131、克里克培养基(click's medium)、麦考伊5a培养基(mccoy's 5a medium)、培养基199(medium 199)、william's e培养基(william's medium e)、以及多种昆虫培养基如grace's培养基和tnm-fh。
[0124]
本文所述的血清替代物和培养基补充物也考虑用于市售的多种无血清培养基。多个示例性无血清培养基包括，但不限于aim-v(life technologies,卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、per-c6(life technologies,卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、knock-out
tm
(life technologies)、(life technologies)、(coming life sciences-mediatech公司，马纳萨斯，维吉尼亚州)。
[0125]
这些培养基中的任一种任选地补充有多种盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、多种胺基酸、多种维生素、多种缓冲液(例如hepes)、多种核苷酸(例如腺核苷和胸腺核苷)、多种抗生素(例如庆大霉素药物)、多种微量元素(定义为多种最终浓度通常在所述微摩尔范围内的多种无机化合物)、多种抗氧化剂和葡萄糖或一等效能量来源。也可以以本领域技术人员已知的多种适当浓度包括任何其他必要的补充物。多个培养条件，例如温度、ph等，对于普通技术人员来说是显而易见的。
[0126]
预期所述多种培养基组合物以多种单位形式包装。在一实施例中，所述培养基(血清替代物、培养基补充物、完全培养基或冷冻保存培养基)包装在10ml、50ml、100ml、500ml或1l的一体积中。
[0127]
本公开进一步提供了一种套组，所述套组包含如上文和本文所述的一细胞培养基及使用说明。在一些实施例中，所述培养基被包装在一容器中，一标签附在所述容器上或包含在描述所述多种组合物在体外、体内或离体使用的用途的所述包装中。多个示例性容器包括，但不限于一器皿、一小玻璃瓶、一管、一安瓿、一瓶子、一烧瓶等。进一步设想所述容器适于包装所述培养基，例如液体或冷冻形式的血清替代物或培养基补充物。预期所述容器由本领域公知的材料制成，包括但不限于玻璃、聚丙烯、聚苯乙烯和其他多种塑料。在一些实施例中，所述多种组合物被包装在一单位剂型中。所述套组任选地包括适合于将所述血清替代物或培养基补充物与一基础培养基结合的一装置。在一些实施例中，所述套组包含描述所述培养基用于细胞培养或冷冻保存的一标签及/或说明书。
[0128]
在本文或在其审查期间引用的所有申请案和所有文件(“多个申请引用文件”)和在所述多个申请引用文件中引用或引据的所有文件，以及在本文引用或引据的所有文件(“在本文引用的多个文件”)及本文引用的多个文件中引用或引据的所有文件，连同任何制造商的说明、描述、产品规格和用于本文提及的任何产品或通过引用并入本文的任何文件中的产品表一起，通过引用并入本文，并且可以在本发明的所述实践中使用。更具体地，所有引据的文件都以引用的方式并入，就好像每个单独的文件都被具体地和单独地指出以引用的方式并入一样。
[0129]
以下多个实施例是作为说明而非以限制的方式提供的。
[0130]
实施例1：id-8及/或fk-506对牛纤维母细胞生长的多个影响
[0131]
通过多个标准分化方案将多个牛非锚定依赖性纤维母细胞分化成多个非锚定依赖性脂肪细胞。fmt-sbf-1(多个牛非附着纤维母细胞)在含有200μm油酸与一pparγ促效剂的脂肪生成培养基中生长。测试了一合成抑制剂(罗格列酮，rosiglitazone)及一天然抑制剂(降植烷酸，pristanic acid)。
[0132]
评估了id-8及/或fk-506(单独或组合)对牛纤维母细胞生长的多个影响。将适应悬浮培养的多个牛纤维母细胞以0.3百万/ml接种在多个细胞培养瓶中，总体积为20ml。将所述多个培养瓶保存在具有100rpm、37℃和5％co2的一振荡培养箱中。在第3天使用自动细胞计数器进行多个细胞计数，并进行apoi染色以从所述多个计数中消除所述多个死细胞。
[0133]
所述多个结果如图1所示。与fgf(10ng/ml)相比，单独的id-8(1μm)对牛纤维母细胞生长有一相当的影响，这表示id-8可以至少部分地替代多种细胞培养基中的fgf。与fgf(10ng/ml)相比，单独的fk-506(2nm)对牛纤维母细胞生长没有一可比的影响。值得注意的
是，在本研究中，fk-506的测试浓度远低于id-8。所述多个结果进一步显示，与所述fgf对照(10ng/ml)相比，小分子id-8(1μm)和fk-506(2nm)的所述组合在培养三天后表现出最大的细胞生长。预计id-8和fk-506的所述多种浓度可分别在约0.5μm至约10μm和约2nm至约10nm的所述多个范围内变化。此研究表示，id-8和fk-506的所述组合可以完全替代多个牛纤维母细胞的多种无血清培养基中的fgf。
[0134]
实施例2：id-8及/或fk-506对鸡纤维母细胞生长的多个影响
[0135]
通过多个标准分化方案将多个鸡非锚定依赖性纤维母细胞分化成多个非锚定依赖性脂肪细胞。fmt-scf-2(多个鸡非附着纤维母细胞)在含有200μm油酸与一pparγ促效剂的脂肪生成培养基中生长。测试了一合成抑制剂(罗格列酮)及一天然抑制剂(降植烷酸)。
[0136]
评估了id-8及/或fk-506对鸡纤维母细胞生长的多个影响。将适应悬浮培养的多个鸡纤维母细胞以0.3百万/ml接种在多个细胞培养瓶中，总体积为20ml。将所述多个培养瓶保存在具有100rpm、39℃和5％co2的一振荡培养箱中。在第3天使用自动细胞计数器进行多个细胞计数，并进行apoi染色以从所述多个计数中消除所述多个死细胞。
[0137]
所述多个结果如图2所示。与所述fgf对照(10ng/ml)相比，id-8(0.5μm)和fk-506(2nm)的所述组合对细胞生长表现出多个相似的影响。预计id-8和fk-506的所述多种浓度可分别在约0.5μm至约10μm和约2nm至约10nm的所述多个范围内变化。此研究表示，id-8和fk-506的所述组合可以完全替代多个鸡纤维母细胞的多种无血清培养基中的fgf。
[0138]
实施例3：id-8和fk-506的梯度浓度对多个绵羊纤维母细胞的多个影响
[0139]
在多个绵羊纤维母细胞二维培养上测试了两种小分子(id-8和fk-506)的梯度浓度的多个影响，id-8的梯度浓度范围为约1至50μm，fk-506的梯度浓度为约1至50nm。多个羊纤维母细胞以1000细胞/孔的一密度接种在96孔盘中。根据公司方案，在添加xtt(来自biological industries(以色列)的细胞增殖测定法)之前，将无血清培养基中的id-8和fk-506与所述多个纤维母细胞一起培养48小时。添加xtt 8小时后测量比色信号。从所述多个样本测量值(n＝4)中减去多个空白(仅培养基)测量值。
[0140]
所述多个结果显示，当fk-506在约1至2nm的所述浓度和id-8在约1至5μm的所述浓度(所述多个最佳浓度)时，获得了最好的细胞生长(图3)。多种较高浓度的id-8(例如10μm或50μm)仍显示出比所述对照(无fgf)更多的细胞生长。另一方面，较高浓度的fk-506(例如5nm、20nm或50nm)未显示对细胞生长的显著影响，即使id-8在1μm的所述最佳浓度下也是如此。
[0141]
尽管已经详细描述了本发明及其多个优点，但应当理解的是，在不脱离如所附多个权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下，可以在本文中进行各种改变、替换和变更。
[0142]
本领域技术人员将容易理解，本发明很好地适用于实现这些目的并获得所提到的多个结果和多个优点，以及其中固有的那些。本发明多个示例连同本文描述的多种方法目前代表多个优选实施例，是示例性的，并且不意在限制本发明的范围。本领域技术人员将想到其中的多个变化和其他多种用途，这些包括在由所述多个权利要求的所述范围限定的本发明的所述精神内。