在低氧条件下具有高适应性的细胞及其用途的制作方法

1.本技术涉及在低氧条件下具有高适应性的细胞、其制备方法、以及含有该细胞作为活性成分的细胞治疗剂。近年来，正在进行关于将干细胞(例如胚胎干细胞和成体干细胞)分化为各种细胞并将所产生的细胞用于细胞疗法的方法的多种研究。具有多能性的胚胎干细胞作为细胞治疗剂吸引关注，因为它们可以分化成各种细胞。然而，由于使用胚胎干细胞的伦理问题，难以将胚胎干细胞实际用于细胞疗法。为了避免这些伦理问题，正在积极进行使用成体干细胞的研究。


背景技术：

2.已知的是，低氧条件下的细胞高度表达缺氧诱导因子1(hif1)蛋白以维持生存。hif1蛋白是参与低氧环境中的血管生成(血管化)和能量代谢从而在创造细胞可以生存的环境中发挥作用的基因转录调节因子。hif1具有hif1α和hif1β作为其亚。hif1α和hif1β分别由hif1a和hif1b基因编码。
3.[相关技术文献]
[0004]
mahon pc,hirota k,semenza gl.fih-1:a novel protein that interacts with hif-1alpha and vhl to mediate repression of hif-1transcriptional activity,genes dev.2001；15(20):2675？2686.doi:10.1101/gad.924501。


技术实现要素：

[0005]
技术问题
[0006]
本公开内容的目的在于提供对低氧环境具有高适应性的细胞。
[0007]
本公开内容的另一目的在于提供基因工程化组合物，所述基因工程化组合物用于产生对低氧环境具有高适应性的细胞。
[0008]
本公开内容的进一步目的在于提供基因工程化方法，所述基因工程化方法用于产生对低氧环境具有高适应性的细胞。
[0009]
本公开内容的又一目的在于提供对低氧环境具有高适应性的细胞的用途。
[0010]
技术方案
[0011]
本公开内容公开了经操纵的细胞，所述细胞包含：在野生型基因中具有插入缺失的至少一个经工程化的基因，所述野生型基因选自于由hif1an、hif3a、phd2、tlr4和pai1所组成的组，其中，经工程化的基因和野生型基因的基因序列不同，经操纵的细胞中由野生型基因转录的mrna的表达水平低于野生型细胞，并且经操纵的细胞中hifα的表达水平高于野生型细胞。
[0012]
在一个实施方式中，提供了经操纵的细胞，所述经操纵的细胞被配置使得：当经操纵的细胞包含在hif1an基因中具有插入缺失的经工程化的基因时，hif1an基因中的插入缺失位于hif1an基因的外显子1中；当经操纵的细胞包含在hif3a基因中具有插入缺失的经工程化的基因时，hif3a基因中的插入缺失位于选自于由hif3a基因的外显子2、外显子3、外显
子4、外显子5和外显子6所组成的组中的一个或多个区域中；当经操纵的细胞包含在phd2基因中具有插入缺失的经工程化的基因时，phd2基因中的插入缺失位于phd2基因的外显子1中；当经操纵的细胞包含在tlr4基因中具有插入缺失的经工程化的基因时，tlr4基因中的插入缺失位于选自于由tlr4基因的外显子1、外显子2和外显子3所组成的组中的一个或多个区域中；并且当经操纵的细胞包含在pai1基因中具有插入缺失的经工程化的基因时，pai1基因中的插入缺失位于pai1基因的外显子2中。
[0013]
在一个实施方式中，提供了经操纵的细胞，所述经操纵的细胞被配置使得：当经操纵的细胞包含在hif1an基因中具有插入缺失的经工程化的基因时，所述经工程化的基因不包括选自于由seq id no:1至seq id no:9所组成的组中的一个或多个序列；当经操纵的细胞包含在hif3a基因中具有插入缺失的经工程化的基因时，所述经工程化的基因不包括选自于由seq id no:10至seq id no:34所组成的组中的一个或多个序列；当经操纵的细胞包含在phd2基因中具有插入缺失的经工程化的基因时，所述经工程化的基因不包括选自于由seq id no:35至seq id no:38所组成的组中的一个或多个序列；当经操纵的细胞包含在tlr4基因中具有插入缺失的经工程化的基因时，所述经工程化的基因不包括选自于由seq id no:39至seq id no:59所组成的组中的一个或多个序列；并且当经操纵的细胞包含在pai1基因中具有插入缺失的经工程化的基因时，所述经工程化的基因不包括选自于由seq id no:60至seq id no:71所组成的组中的一个或多个序列。
[0014]
在一个实施方式中，提供了经操纵的细胞，所述经操纵的细胞包含在hif1an基因中具有插入缺失的经工程化的基因。
[0015]
在一个实施方式中，提供了经操纵的细胞，其中，hif1an基因中的插入缺失位于hif1an基因的外显子1中。
[0016]
在一个实施方式中，提供了经操纵的细胞，其中，经工程化的基因的序列不包括选自于由seq id no:1至seq id no:9所组成的组中的一个或多个序列。
[0017]
在一个实施方式中，提供了经操纵的细胞，其中，经操纵的细胞中fih-1的表达水平是野生型细胞中fih-1表达水平的70％或更低。
[0018]
在一个实施方式中，提供了经操纵的细胞，其中，经操纵的细胞中vegf和il-8的表达水平分别高于野生型细胞中vegf和il-8的表达水平。
[0019]
在一个实施方式中，提供了经操纵的细胞，所述经操纵的细胞包含在hif3a基因中具有插入缺失的经工程化的基因。
[0020]
在一个实施方式中，提供了经操纵的细胞，其中，hif3a基因中的插入缺失位于选自于由外显子2、外显子3、外显子4、外显子5和外显子6所组成的组中的一个或多个区域中。
[0021]
在一个实施方式中，提供了经操纵的细胞，其中，经工程化的基因的序列不包括选自于由seq id no:10至seq id no:34所组成的组中的一个或多个序列。
[0022]
在一个实施方式中，提供了经操纵的细胞，所述经操纵的细胞包含在phd2基因中具有插入缺失的经工程化的基因。
[0023]
在一个实施方式中，提供了经操纵的细胞，其中，phd2基因中的插入缺失位于phd2基因的外显子1中。
[0024]
在一个实施方式中，提供了经操纵的细胞，其中，经工程化的基因的序列不包括选自于由seq id no:35至seq id no:38所组成的组中的一个或多个序列。
[0025]
在一个实施方式中，提供了经操纵的细胞，所述经操纵的细胞包含在tlr4基因中具有插入缺失的经工程化的基因。
[0026]
在一个实施方式中，提供了经操纵的细胞，其中，tlr4基因中的插入缺失位于选自于由外显子1、外显子2和外显子3所组成的组中的一个或多个区域中。
[0027]
在一个实施方式中，提供了经操纵的细胞，其中，经工程化的基因的序列不包括选自于由seq id no:39至seq id no:59所组成的组中的一个或多个序列。
[0028]
在一个实施方式中，提供了经操纵的细胞，所述经操纵的细胞包含在pai1基因中具有插入缺失的经工程化的基因。
[0029]
在一个实施方式中，提供了经操纵的细胞，其中，pai1基因中的插入缺失位于pai1基因的外显子2中。
[0030]
在一个实施方式中，提供了经操纵的细胞，其中，经工程化的基因的序列不包括选自于由seq id no:60至seq id no:71所组成的组中的一个或多个序列。
[0031]
在一个实施方式中，经操纵的细胞是源自如下组织的间充质干细胞，所述组织选自于由骨髓、脂肪组织、脐带、胎盘、羊水和脐带血所组成的组。
[0032]
在一个实施方式中，经操纵的细胞是源自骨髓的间充质干细胞。
[0033]
本公开内容公开了经操纵的细胞，所述经操纵的细胞包含：选自于由经工程化的hif1an基因、经工程化的hif3a基因、经工程化的phd2基因、经工程化的tlr4基因和经工程化的pai1基因所组成的组中的至少一种经工程化的基因，其中，经工程化的hif1an基因不包括选自seq id no:1至seq id no:9的一个或多个序列；经工程化的hif3a基因不包括选自seq id no:10至seq id no:34的一个或多个序列；经工程化的phd2基因不包括选自seq id no:35至seq id no:38的一个或多个序列；经工程化的tlr4基因不包括选自seq id no:39至seq id no:59的一个或多个序列；并且经工程化的pai1基因不包括选自seq id no:60至seq id no:71的一个或多个序列。
[0034]
本公开内容公开了基因编辑组合物，所述基因编辑组合物包括：源自酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)的cas9蛋白或编码cas9蛋白的dna；以及向导rna或编码向导rna的dna，其中，向导rna具有选自于由seq id no:146至seq id no:216所组成的组中的序列。
[0035]
在一个实施方式中，提供了基因编辑组合物，所述基因编辑组合物包括处于核糖核蛋白(rnp)形式的向导rna和cas9蛋白。
[0036]
在一个实施方式中，提供了基因编辑组合物，所述基因编辑组合物包含处于单一载体形式的编码向导rna的dna和编码cas9蛋白的dna。
[0037]
在一个实施方式中，提供了基因编辑组合物，其中，所述单一载体选自于由质粒、aav等所组成的组。
[0038]
本公开内容公开了编辑细胞中的基因的方法，该方法包括将基因编辑组合物引入细胞中，所述组合物包括：源自酿脓链球菌的cas9蛋白或编码cas9蛋白的dna；以及向导rna或编码向导rna的dna，其中，向导rna具有选自于由seq id no:146至seq id no:216所组成的组中的序列。
[0039]
在一个实施方式中，提供了基因编辑方法，其中，所述组合物包括载体形式的编码向导rna的dna和编码cas9蛋白的dna。
[0040]
本公开内容公开了在细胞中编辑包含靶dna的基因的方法，该方法包括使crispr/cas9复合物与靶dna接触，该crispr/cas9复合物包括：源自酿脓链球菌的cas9蛋白；以及靶向靶dna的向导rna，其中，向导rna具有选自于由seq id no:146至seq id no:216所组成的组中的序列。
[0041]
发明的有益效果
[0042]
在本公开内容中，公开了在低氧环境中具有高适应性的细胞及其制备方法。由于对低氧环境具有高适应性的细胞表现出在低氧环境中的高适应性和存活率，因此该细胞适合用于细胞疗法。
附图说明
[0043]
图1是用于检查在用靶向hhif3a基因的部分核苷酸序列的基因工程化组合物进行处理后基因修饰是否发生的实验数据。具体而言，通过向导核酸的变化检查插入缺失(indel)发生率。
[0044]
图2是用于检查在用靶向htlr4基因的部分核苷酸序列的基因工程化组合物进行处理后基因修饰是否发生的实验数据。具体而言，通过向导核酸的变化检查插入缺失(indel)发生率。
[0045]
图3是用于检查在用靶向hpai1基因的部分核苷酸序列的基因工程化组合物进行处理后基因修饰是否发生的实验数据。具体而言，通过向导核酸的变化检查插入缺失(indel)发生率。
[0046]
图4是用于检查在用靶向hhif1an基因的部分核苷酸序列的基因工程化组合物进行处理后基因修饰是否发生的实验数据。具体而言，通过向导核酸的变化检查插入缺失(indel)发生率。
[0047]
图5是用于检查在用靶向hphd2基因的部分核苷酸序列的基因工程化组合物进行处理后基因修饰是否发生的实验数据。具体而言，通过向导核酸的变化检查插入缺失(indel)发生率。
[0048]
图6和图10示出了通过用基因工程化组合物处理msc并用miseq筛选经处理的msc而获得的适用于实验的细胞。
[0049]
图7至图9和图11至图13是比较数据，分别示出了图6和图10中通过miseq选择的细胞中的mrna表达水平，其中，通过qrt-pcr比较mrna的表达水平。
[0050]
图14示出了通过用hhif1an基因工程化组合物处理msc并通过深度测序筛选经处理的msc而获得的适用于实验的细胞。
[0051]
图15是示出了图10中通过深度测序选择的细胞中的mrna表达水平的比较数据，其中，通过qrt-pcr比较mrna的表达水平。
[0052]
图16为通过对低氧条件下频繁发生的活性氧胁迫下msc增殖能力变化进行测量得到的数据，并为通过cck8测定对活细胞数进行计数的数据。
[0053]
图17为通过对低氧条件下频繁发生的活性氧胁迫下msc增殖能力变化进行测量得到的数据，并为对于h2o2的摩尔浓度为0μm和500μm的各情况而言的对其中hhif1an基因被敲除的msc的活细胞数和对照msc的活细胞数进行计数而得到的数据。
[0054]
图18是示出了根据实验例对间充质干细胞的hif1an基因进行工程化后通过深度
测序获得的插入缺失效率和框外率的比较结果的图。空白对照表示非基因工程化细胞，hif1an ko表示其中hif1an基因经工程化的细胞，shs231 ko表示其中shs231基因座经工程化的细胞，aavs1表示其中aavs1基因座经工程化的细胞，并且shs231 ko和aavs1用作对照。
[0055]
图19是示出了根据实验例对间充质干细胞的hif1an基因进行工程化后通过qrt-pcr测量的hif1an mrna表达水平间的比较结果的图。空白对照表示非基因工程化细胞，hif1an ko表示其中hif1an基因经工程化的细胞，shs231 ko表示其中shs231基因座经工程化的细胞，aavs1表示其中aavs1基因座经工程化的细胞，并且shs231 ko和aavs1用作对照。
[0056]
图20示出了通过cck-8测定对根据实验例制备的用hif1an基因进行工程化的间充质干细胞对snap(活性氮)的活力进行评价的结果。空白对照表示非基因工程化细胞，并且hif1an ko表示经hif1an基因工程化的细胞。
[0057]
图21至图22示出了brdu细胞增殖分析的结果，以确定根据实验例制备的用hif1an基因进行工程化的间充质干细胞的特征。空白对照表示非基因工程化细胞，hif1an ko表示其中hif1an基因经工程化的细胞，shs231 ko表示其中shs231基因座经工程化的细胞，并且shs231 ko用作对照。
[0058]
图23至图25示出了facs分析的结果，以确定根据实验例制备的用hif1an基因进行工程化的间充质干细胞的msc标志物。空白对照表示非基因工程化细胞，hif1an ko表示其中hif1an基因经工程化的细胞，shs231 ko表示其中shs231基因座经工程化的细胞，并且shs231 ko用作对照。
[0059]
图26至图27是对根据实验例制备的用hif1an基因进行工程化的间充质干细胞的群体倍增水平(pdl)和群体倍增时间(pdt)进行测量的测量结果。空白对照表示非基因工程化细胞，hif1an ko表示其中hif1an基因经工程化的细胞，shs231 ko表示其中shs231基因座经工程化的细胞，aavs1表示其中aavs1基因座经工程化的细胞，并且shs231 ko和aavs1用作对照。
[0060]
图28是根据实验例制备的用hif1an基因进行工程化的间充质干细胞的培养基中细胞因子分泌量的比较结果。空白对照表示非基因工程化细胞，hif1an ko表示其中hif1an基因经工程化的细胞，aavs1表示其中aavs1基因座经工程化的细胞，并且aavs1用作对照。
[0061]
图29至图30示出了实验例3在新msc库(msc stock)中的结果，以确定实验例结果的再现性。空白对照表示非基因工程化细胞，空白对照h2o
2 300μm 表示通过向非基因工程化细胞中添加300μm h2o2来产生氧化胁迫情况的细胞，hif1an ko表示其中hif1an基因经工程化的细胞，hif1an ko h2o
2 300μm 表示通过向经hif1an基因工程化的细胞中添加300μm h2o2来产生氧化胁迫情况的细胞。a：示出hif1an mrna表达水平之间的比较的图。b：示出细胞因子(vegf和il-8)mrna表达水平之间的比较的图。
[0062]
图31示出了实验例4-1的蛋白质印迹结果。空白对照表示非基因工程化细胞，sghif1an表示其中hif1an基因经工程化的细胞，sgaavs1表示其中aavs1基因座经工程化的细胞，并且sgaavs1用作对照。
具体实施方式
[0063]
术语定义
[0064]
约
[0065]
如本文所使用的，术语“约”是指接近某个量的程度，并且它指的是相对于参考量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化幅度为30％、25％、20％、25％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。
[0066]
a、t、c、g和u的含义
[0067]
如本文所使用的，符号a、t、c、g和u被解释为本领域普通技术人员所理解的含义。根据上下文和技术，这些符号可以各被恰当解释为dna或rna上的碱基、核苷或核苷酸。例如，当各符号意指碱基时，符号a、t、c、g和u可以分别解释为腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)或尿嘧啶(u)。当每个符号意指核苷时，符号a、t、c、g和u可分别解释为腺苷(a)、胸苷(t)、胞苷(c)、鸟苷(g)或尿苷(u)。当意指序列中的核苷酸时，符号a、t、c、g和u分别表示包含核苷的核苷酸。
[0068]“经工程化的”[0069]
如本文所使用的，术语“经工程化的”是用于将某种物质、分子等与具有已经天然存在的组成的物质、分子等区分开来的术语，并且术语“经工程化的”意指将人工修饰应用于物质、分子等。例如，在“经工程化的基因”的情况下，它是指对天然存在的基因的组成进行人工改变的基因。此外，该术语包括本领域技术人员能够识别的所有含义并且可以根据上下文进行适当解释。
[0070]
野生型
[0071]
术语“野生型”是指包含天然存在的核苷酸序列的基因并且由该基因表达的蛋白质具有正常的功能性质。野生型基因在群体中最为常见。当术语“野生型”在本文中与经人工操纵的(经工程化的)基因和/或细胞对比使用时，它意指与相应经工程化的基因相同种类的基因并包括“未人工工程化”和天然存在的核苷酸序列，以及包含所述基因的细胞。此外，该术语包括本领域技术人员能够识别的所有含义并且可以根据上下文进行适当解释。
[0072]
敲除
[0073]
如本文所使用的，表述“敲除”或“敲除基因”意指由野生型基因表达的蛋白质不能通过转录和/或翻译而产生。例如，包含敲除基因a的细胞可能不表达由野生型基因a表达的mrna和/或蛋白质。包含敲除基因a的细胞可以是其中细胞中存在的基因a中仅一个被敲除、或者基因a中的两个以上的基因被敲除的细胞。此外，该术语包括本领域技术人员能够识别的所有含义并且可以根据上下文进行适当解释。
[0074]
敲低
[0075]
如本文所使用的，术语“敲低”或“敲低基因”意指以低于野生型基因的量表达物质。例如，与野生型基因a表达的mrna相比，包含敲低基因a的细胞可表达更少量的mrna。具有敲低基因a的细胞可以是其中细胞中存在的基因a中仅一个被敲低、或者基因a中的两个以上的基因被敲低的细胞。此外，该术语包括本领域技术人员能够识别的所有含义并且可以根据上下文进行适当解释。
[0076]
表达水平
[0077]
如本文所使用的，术语“表达水平”是指表达产物(例如mrna和/或蛋白质)从特定基因产生的程度。通常，当细胞中特定基因的表达水平高时，由细胞中所含的特定基因产生的mrna和/或特定蛋白质的量、或者胞浆中表达产物的浓度高。相反，当细胞中特定基因的
表达水平低时，由细胞中所含特定基因产生的mrna和/或特定蛋白质的量、或胞浆中表达产物的浓度低。在本公开内容中，当遇到表述“表达水平高”或“表达水平低”时，可以将比较目标解释为同质的野生型细胞，除非比较目标另有指明。此外，作为比较参考的定量指标应在上下文中被解释为最合适的。例如，各个细胞的绝对量、相对量和/或浓度可以作为比较标准，但不限于此。例如，当表述第一细胞中基因a的表达水平高于第二细胞中基因a的表达水平时，第一细胞中基因a的表达产物(mrna、蛋白质等)的绝对量、相对量和/或浓度大于第二细胞中基因a的表达产物。此外，该术语包括本领域技术人员能够识别的所有含义并且可以根据上下文进行适当解释。
[0078]
背景-低氧环境中影响细胞存活的因素
[0079]
hif1蛋白
[0080]
已知的是，置于低氧环境中的细胞会表达大量的缺氧诱导因子1(hif1)蛋白以存活。hif1蛋白是基因转录调节因子，所述基因转录调节因子参与低氧环境中的血管生成(血管化)和能量代谢，从而在创造细胞可以在其中生存的环境中发挥作用。hif1具有hif1α和hif1β作为其亚基。hif1α和hif1β分别由hif1a和hif1b基因编码。因此，为了使细胞在低氧环境中存活，hif1蛋白的表达水平或hif1蛋白亚基的表达水平必须高，或者其活性必须保持高。
[0081]
抑制hif1蛋白功能的因子-fih1
[0082]
fih-1是由hif1an基因编码的蛋白质，并且是参与hif1α翻译后控制的蛋白质。更具体而言，fih-1是天冬酰胺酰羟化酶。fih-1通过干扰hif1α和p300/cbp(核受体激活因子)之间的相互作用来降低hif1活性。此外，fih-1发挥作用以在hif1α合成后诱导hif1α在细胞中降解。由于fih-1甚至在严重缺氧的情况下工作，因此它对应于与低氧环境中的细胞存活直接相关的蛋白质。
[0083]
抑制hif1蛋白功能的因子-phd2
[0084]
phd2是与fih-1同时参与hif1α翻译后控制的蛋白质。更具体而言，phd2是脯氨酰羟化酶。phd2发挥作用以在hif1α合成后诱导hif1α在细胞中降解。
[0085]
抑制hif1蛋白功能的因子-hif3a
[0086]
hif3a是参与hif1α转录控制的蛋白质。hif3a在干扰hif1α基因的转录中起作用。
[0087]
其它-影响细胞在低氧环境中存活的因素
[0088]
tlr4已知为参与对伤口的固有免疫应答的因子。在低氧环境中，激活的tlr4发挥作用以诱导促凋亡信号传导，从而诱导凋亡。pai1是负向调节间充质干细胞(msc)的细胞外基质附着的因子。已知pai1在低氧环境中表达增加，并且还已知影响干细胞的自体移植存活。
[0089]
背景-crispr/cas系统
[0090]
概述
[0091]
crispr/cas系统是在原核生物体中发现的免疫系统，并包括cas蛋白和向导rna。cas蛋白或向导rna的配置详细描述于国际公布号wo2018/231018，其为已公开的文献。如本文所使用的，术语“cas蛋白”是可被解释为用于crispr/cas系统中的核酸酶的通用术语。但是，为了描述方便，下文将以dna切割过程(其中crispr/cas9系统最为常用)为例进行简要描述。
[0092]
cas9蛋白
[0093]
在crispr/cas9复合物中，具有切割核酸的核酸酶活性的蛋白质称为cas9蛋白质。cas9蛋白对应于crispr/cas系统分类中的2类ii型。cas9蛋白的实例包括酿脓链球菌、嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)、链球菌属(streptococcus sp.)、始旋链霉菌(streptomyces pristinaespiralis)、绿色产色链霉菌(streptomyces viridochromogenes)、绿色产色链霉菌、玫瑰链孢囊菌(streptosporangium roseum)和玫瑰链孢囊菌来源的cas9。其中，最常用于研究目的的cas9蛋白是源自酿脓链球菌的cas9蛋白。
[0094]
向导rna
[0095]
在crispr/cas9复合物中，具有诱导crispr/cas9复合物以识别包含在靶核酸中的特定序列的功能的rna被称为向导rna。向导rna在功能上分为1)支架序列部分和2)向导序列部分。支架序列部分是与cas9蛋白相互作用的部分，并且是结合至cas9蛋白以形成复合物的部分。通常，支架序列部分包括tracrrna和crrna重复序列部分，并且支架序列依据使用何种cas9蛋白来确定。向导序列部分是能够互补结合至靶核酸中具有预定长度的核苷酸序列部分的部分。向导序列部分是可经人工修饰的碱基部分，并且由感兴趣的靶核苷酸序列确定。
[0096]
通过crispr/cas9复合物切割靶核酸的过程
[0097]
当crispr/cas9复合物与靶核酸接触时，cas9蛋白识别预定长度的核苷酸序列。当向导rna的一部分(向导序列部分)互补结合至与pam序列相邻的部分时，靶核酸被crispr/cas9复合物切割。
[0098]
在这种情况下，被cas9蛋白识别的一定长度的核苷酸序列称为原间隔区邻近基序(pam)序列，它是根据cas9蛋白的类型或来源而确定的序列。例如，源自酿脓链球菌的cas9蛋白可以识别靶核酸中的5'-ngg-3'序列。在这种情况下，n是腺苷(a)、胸苷(t)、胞苷(c)和鸟苷(g)之一。
[0099]
为了使crispr/cas9复合物切割靶核酸，向导rna的向导序列部分必须互补地结合至与pam序列相邻的序列部分。因此，向导序列部分是根据靶核酸的序列确定的，具体而言，是根据与pam序列相邻的序列部分。
[0100]
当crispr/cas9复合物切割靶核酸时，靶核酸的pam序列部分和/或与向导序列互补的序列部分中的某个位置被切割。
[0101]
靶链和非靶链
[0102]
crispr/cas9复合物具有对双链dna的切割活性。在双链dna中，将具有结合至向导序列部分的原间隔区的链称为靶链(ts)。与靶链互补并具有不结合至向导序列部分的原间隔区的链称为非靶链(nts)。向导序列部分可以互补地结合双链dna的靶链(ts)中包含的原间隔区序列部分。双链dna的非靶链(nts)中包含的原间隔区序列和向导序列是等同序列。具体而言，它们之间的唯一区别在于向导序列是rna序列，而包含在非靶链(nts)中的原间隔区序列是对应的dna序列。
[0103]
现有技术的局限
[0104]
近年来，已经广泛研究了所谓的“细胞疗法”，其中细胞本身被用作治疗剂用于治疗、诊断和/或预防疾病的目的。用于细胞治疗中的细胞是能够表达治疗物质的细胞或具有
完整功能的细胞。用于细胞治疗的细胞被直接给予至患病位点、受损组织或受损器官以治疗疾病或使受损组织或器官再生。为了实现该目的，作为细胞治疗剂给予的细胞必须在该细胞被给予至的位点长时间存活以发挥其正常功能。但是，当在体外对治疗用细胞等进行选择和增殖来制备细胞治疗剂，然后给予至机体时，存在细胞不适应机体环境并迅速死亡的问题。凋亡的原因是i)体外培养环境与机体的内部环境不同，ii)机体的内部处于低氧环境(缺氧)，iii)体内营养不足，iv)所给予的细胞不能附着至体内的ecm，或v)发生免疫应答。其中，典型的凋亡是由于缺氧所致。因此，常规的细胞治疗剂无法保证在体内有足够的存活时间，产生了难以达到治疗疾病和组织再生的目的的问题。
[0105]
对低氧环境具有高适应性的细胞
[0106]
概述
[0107]
本文公开了对低氧环境具有高适应性的细胞。细胞的类型不受特别限制，只要该细胞可以用作细胞治疗剂即可。该细胞的特征在于，表达抑制hif1蛋白表达的物质的野生型基因经人工工程化。因此，与野生型细胞的hif1表达负调节因子相比，该细胞中hif1表达的负调节因子的表达水平降低。结果，存在如下特征，其中，维持在该细胞中的hif1蛋白的表达水平和/或活性水平高于野生型细胞的hif1蛋白的表达水平和/或活性水平。本文公开的对低氧环境具有高适应性的细胞在低氧环境中具有高适应性或活力，并因此适于在细胞治疗中使用。
[0108]
在一个实施方式中，本文提供的对低氧环境具有高适应性的细胞可以是经工程化的细胞。在一个实施方式中，经工程化的细胞可以是经工程化的间充质干细胞。
[0109]
在一个实施方式中，经工程化的细胞包含在野生型基因中具有插入缺失的至少一个经工程化的基因，所述野生型基因选自于由表达抑制hif1蛋白表达的物质的hif1an、hif3a、phd2、tlr4和pai1所组成的组。在一个实施方式中，经工程化的细胞中由野生型基因转录的mrna的表达水平可能低于野生型细胞中由野生型基因转录的mrna的表达水平。在一个实施方式中，经工程化的细胞中hifα的表达水平可能高于野生型细胞中hifα的表达水平。
[0110]
在一个实施方式中，经工程化的细胞可以包含至少一种经工程化的基因，所述经工程化的基因选自于由经工程化的hif1an基因、经工程化的hif3a基因、经工程化的phd2基因、经工程化的tlr4基因和经工程化的pai1基因所组成的组。
[0111]
细胞类型
[0112]
在一个实施方式中，本文公开的对低氧环境具有高适应性的细胞是体细胞(例如，卵丘细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、巨噬细胞、单核细胞、肌细胞、b淋巴细胞、t淋巴细胞、树突状细胞、nk细胞、调节性t细胞)、生殖细胞、胚胎干细胞、神经干细胞、间充质干细胞和成体干细胞(包括来自脂肪、子宫、骨髓、肝、肌肉、胎盘、神经、脐带血或皮肤(上皮)的组织的组织源性干细胞)、和/或诱导多能干细胞(ipsc)。在一个实施方式中，细胞可以是间充质干细胞。在一个实施方式中，细胞可以是源自骨髓、脂肪组织、脐带、胎盘、羊水和/或脐带血的间充质干细胞。在一个实施方式中，细胞可以是骨髓来源的间充质干细胞。
[0113]
细胞基因型1
–
待工程化的基因
[0114]
对低氧环境具有高适应性的细胞的特征在于，它是通过对表达抑制hif1蛋白的转
录、表达和/或活性的物质的野生型基因进行人工编辑而获得的。换言之，该细胞含有表达抑制hif1蛋白的转录、表达和/或活性的物质的经工程化的基因。
[0115]
在一个实施方式中，经人工编辑的野生型基因可以是hif1an、hif3a、phd2、tlr4和/或pai1基因。在这种情况下，野生型基因可以是人基因，但不限于此。在一个实施方式中，细胞可以含有经工程化的hif1an基因、经工程化的hif3a基因、经工程化的phd2基因、经工程化的tlr4基因和/或经工程化的pai1基因。在这种情况下，经工程化的基因的序列与对应于该经工程化的基因的野生型基因的原始序列不同。具体而言，经工程化的hif1an基因的序列与野生型hif1an基因的序列不同。具体而言，经工程化的hif3a基因的序列与野生型hif3a基因的序列不同。具体而言，经工程化的phd2基因的序列与野生型phd2基因的序列不同。具体而言，经工程化的tlr4基因的序列与野生型tlr4基因的序列不同。具体而言，经工程化的pai1基因的序列与野生型pai1基因的序列不同。
[0116]
细胞基因型2
–
待工程化的基因
[0117]
经工程化的基因的特征在于，它具有与相应的野生型基因的序列不同的序列。经工程化的基因可能无法表达未工程化的野生型基因可以表达的物质。在经工程化的基因中，在野生型基因中表达的物质可能较少表达。
[0118]
在一个实施方式中，经工程化的基因可以处于野生型基因的突变的形式。在这种情况下，突变可能不是自然界存在的突变，而是人工产生的突变。
[0119]
在一个实施方式中，经工程化的基因可以是被敲除的相应的野生型基因。
[0120]
在一个实施方式中，经工程化的基因可以是被敲低的相应的野生型基因。
[0121]
在一个实施方式中，经工程化的基因可以是如下形式：其中，与相应的野生型基因相比，一个或多个核苷酸被插入、缺失、置换和/或倒置。
[0122]
在一个实施方式中，经工程化的基因可以是在相应的野生型基因中具有插入缺失的基因。在这种情况下，插入缺失是通过细胞中的非同源末端连接(nhej)机制产生的，并且野生型基因中的一个或多个核苷酸可以通过nhej机制而被插入、缺失和/或置换。在这种情况下，表述“在基因中包含插入缺失”是指野生型基因中一个或多个核苷酸的插入、缺失和/或置换，和/或其结果。
[0123]
例如，在野生型a基因中具有插入缺失的经工程化的a基因可以具有在野生型a基因的任何位置插入的一个或多个核苷酸。或者，例如，在野生型a基因中具有插入缺失的经工程化的a基因可以具有在野生型a基因中的任何位置缺失的一个或多个核苷酸。又或者，例如，在野生型a基因中具有插入缺失的经工程化的a基因可以是野生型a基因中任意位置的一个或多个核苷酸被置换的形式。
[0124]
细胞基因型3
–
对靶基因中的区域进行工程化的实例
[0125]
如上所述，本文提供的对低氧环境具有高适应性的细胞的特征在于，表达抑制hif1蛋白的转录、表达和/或活性的物质的野生型基因已被人工编辑。这意味着野生型基因中的一个或多个区域已被工程化。在这种情况下，野生型基因中的经工程化的区域不受特别限制，只要是能够实现上述目的的区域即可。
[0126]
在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞可以是野生型基因中的外显子区、内含子区和/或调节区被编辑的形式。在这种情况下，野生型基因可以选自于由hif1an、hif3a、phd2、tlr4和pai1所组成的组。
[0127]
在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞可以包含一种或多种经工程化的基因，所述经工程化的基因是如下的形式：其中，选自于由hif1an、hif3a、phd2、tlr4和pai1基因所组成的组的一个或多个野生型基因中的选自外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、
……
、外显子n中的一个或多个区域被人工编辑。在这种情况下，n是任意整数。在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞可以包含一种或多种经工程化的基因，所述经工程化的基因是如下的形式：其中，选自于由hif1an、hif3a、phd2、tlr4和pai1基因所组成的组的一个或多个野生型基因中的选自内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、
……
、内含子m中的一个或多个区域被人工编辑。在这种情况下，m是任意整数。
[0128]
在一个实施方式中，所述细胞可以包含经工程化的hif1an基因，该基因是野生型hif1an基因中的外显子1被人工工程化的形式。在一个实施方式中，所述细胞可以包含经工程化的hif3a基因，该基因是野生型hif3a基因中的选自于由外显子2、外显子3、外显子4、外显子5和外显子6所组成的组中的一个或多个区域被人工编辑的形式。在一个实施方式中，所述细胞可以包含经工程化的phd2基因，该基因是野生型phd2基因中的外显子1被人工工程化的形式。在一个实施方式中，所述细胞可以包含经工程化的tlr4基因，该基因是其中野生型tlr4基因中选自于由外显子1、外显子2和外显子3所组成的组中的一个或多个区域被人工编辑的形式。在一个实施方式中，所述细胞可以包含经工程化的pai1基因，该基因是其中野生型pai1基因中的外显子2被人工工程化的形式。
[0129]
在一个实施方式中，当经工程化的细胞包含在hif1an基因中具有插入缺失的经工程化的基因时，所述插入缺失位于hif1an基因的外显子1中。当经工程化的细胞包含在hif3a基因中具有插入缺失的经工程化的基因时，所述插入缺失位于选自于由hif3a基因的外显子2、外显子3、外显子4、外显子5和外显子6所组成的组的一个或多个区域中。当经工程化的细胞包含在phd2基因中具有插入缺失的经工程化的基因时，所述插入缺失位于phd2基因的外显子1区域。当经工程化的细胞包含在tlr4基因中具有插入缺失的经工程化的基因时，所述插入缺失位于选自于由tlr4基因的外显子1、外显子2和外显子3所组成的组的一个或多个区域中。当经工程化的细胞包含在pai1基因中具有插入缺失的经工程化的基因时，所述插入缺失位于pai1基因的外显子2中。
[0130]
细胞基因型4-待改造的序列的实例
[0131]
在一个实施方式中，本文提供的对低氧环境具有高适应性的细胞可以是具有hif1an基因的细胞，所述hif1an基因中选自seq id no:1至seq id no:9的一个或多个序列被人工编辑。在一个实施方式中，细胞可以包含经工程化的hif1an基因，并且经工程化的hif1an基因的序列可能不包括选自seq id no:1至seq id no:9的一个或多个序列。换言之，经工程化的hif1an基因的序列中与选自seq id no:1至seq id no:9的一个或多个序列相同的序列可能不存在。
[0132]
在一个实施方式中，本文提供的对低氧环境具有高适应性的细胞可以是具有hif3a基因的细胞，所述hif3a基因中选自seq id no:10至seq id no:34的一个或多个序列被人工编辑。在一个实施方式中，细胞可以包含经工程化的hif3a基因，并且经工程化的hif3a基因的序列可能不包括选自seq id no:10至seq id no:34的一个或多个序列。换言之，经工程化的hif3a基因的序列中与选自seq id no:10至seq id no:34的一个或多个序列相同的序列可能不存在。
[0133]
在一个实施方式中，本文提供的对低氧环境具有高适应性的细胞可以是具有phd2基因的细胞，所述phd2基因中选自于由seq id no:35至seq id no:38所组成的组中的一个或多个序列被人工编辑。在一个实施方式中，细胞可以包含经工程化的phd2基因，并且经工程化的phd2基因的序列可能不包括选自于由seq id no:35至seq id no:38所组成的组中的一个或多个序列。换言之，经工程化的phd2基因的序列中与选自于由seq id no:35至seq id no:38所组成的组中的一个或多个序列相同的序列可能不存在。
[0134]
在一个实施方式中，本文提供的对低氧环境具有高适应性的细胞可以是具有tlr4基因的细胞，所述tlr4基因中选自seq id no:39至seq id no:59的一个或多个序列被人工编辑。在一个实施方式中，细胞可以包含经工程化的tlr4基因，并且经工程化的tlr4基因的序列可能不包括选自seq id no:39至seq id no:59的一个或多个序列。换言之，经工程化的tlr4基因的序列中与选自seq id no:39至seq id no:59的一个或多个序列相同的序列可能不存在。
[0135]
在一个实施方式中，本文提供的对低氧环境具有高适应性的细胞可以是具有pai1基因的细胞，所述pai1基因中选自seq id no:60至seq id no:71的一个或多个序列被人工编辑。在一个实施方式中，细胞可以包含经工程化的pai1基因，并且经工程化的pai1基因的序列可能不包括选自seq id no:60至seq id no:71的一个或多个序列。换言之，经工程化的pai1基因的序列中与选自seq id no:60至seq id no:71的一个或多个序列相同的序列可能不存在。
[0136]
细胞表型1-经工程化的基因的表达产物的减少
[0137]
在本文公开的对低氧环境具有高适应性的细胞中，对表达抑制hif1蛋白表达的物质的野生型基因进行人工工程化，使野生型基因不能表达该物质或表达较少量的该物质。因此，与相应的野生型细胞相比，该细胞表现出hif1表达负调节因子的更低的表达水平。
[0138]
在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞包含至少一种经工程化的基因，所述经工程化的基因在选自于由野生型hif1an、hif3a、phd2、tlr4和pai1基因所组成的组的基因中具有插入缺失。在这种情况下，经工程化的基因中表达的mrna序列可能不同于野生型基因中表达的mrna序列。在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞可以包含在野生型hif1an基因中具有插入缺失的经工程化的hif1an基因，并且经工程化的hif1an基因中的mrna序列可以不同于野生型基因中表达的mrna序列。在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞包含在野生型hif3a基因中具有插入缺失的经工程化的hif3a基因，并且经工程化的hif3a基因中表达的mrna序列可以不同于野生型hif3a基因中表达的mrna序列。在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞包含在野生型phd2基因中具有插入缺失的经工程化的phd2基因，并且经工程化的phd2基因中表达的mrna序列可以不同于野生型phd2基因中表达的mrna序列。在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞包含在野生型tlr4基因中具有插入缺失的经工程化的tlr4基因，并且经工程化的tlr4基因中表达的mrna序列可以不同于野生型tlr4基因中表达的mrna序列。在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞包含在野生型pai1基因中具有插入缺失的经工程化的pai1基因，并且经工程化的pai1基因中表达的mrna序列可以不同于野生型pai1基因中表达的mrna序列。
[0139]
在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞包含至少一种经工程化的基
因，所述经工程化的基因在选自于由野生型hif1an、hif3a、phd2、tlr4和pai1基因所组成的组的基因中具有插入缺失。在这种情况下，经工程化的基因中表达的mrna序列可以与野生型基因中表达的mrna序列相同。在这种情况下，在对低氧环境具有高适应性的细胞中，经工程化的基因中表达的mrna的表达水平可能低于野生型细胞中表达的mrna的表达水平。在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞包含在野生型hif1an基因中具有插入缺失的经工程化的hif1an基因，经工程化的hif1an基因中表达的mrna序列可以与野生型hif1an基因中表达的mrna序列相同。此外，在对低氧环境具有高适应性的细胞中，经工程化的hif1an基因中表达的mrna的表达水平可能低于野生型hif1an基因中表达的mrna的表达水平。在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞可以包含在野生型hif3a基因中具有插入缺失的经工程化的hif3a基因，并且经工程化的hif3a基因中表达的mrna序列可以与野生型hif3a基因中表达的mrna序列相同。在这种情况下，在对低氧环境具有高适应性的细胞中，经工程化的hif3a基因中表达的mrna的表达水平可能低于野生型hif3a基因中表达的mrna的表达水平。在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞可以包含在野生型phd2基因中具有插入缺失的经工程化的phd2基因，并且经工程化的phd2基因中表达的mrna序列可以与野生型phd2基因中表达的mrna序列相同。在这种情况下，在对低氧环境具有高适应性的细胞中，经工程化的phd2基因中表达的mrna的表达水平可能低于野生型phd2基因中表达的mrna的表达水平。在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞可以包含在野生型tlr4基因中具有插入缺失的经工程化的tlr4基因，并且经工程化的tlr4基因中表达的mrna序列可以与野生型tlr4基因中表达的mrna序列相同。在这种情况下，在对低氧环境具有高适应性的细胞中，经工程化的tlr4基因中表达的mrna的表达水平可能低于野生型细胞中野生型tlr4基因中表达的mrna的表达水平。在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞可以包含在野生型pai1基因中具有插入缺失的经工程化的pai1基因，并且经工程化的pai1基因中表达的mrna序列可以与野生型pai1基因中表达的mrna序列相同。在这种情况下，在对低氧环境具有高适应性的细胞中，经工程化的pai1基因中表达的mrna的表达水平可能低于野生型细胞中野生型pai1基因中表达的mrna的表达水平。
[0140]
在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞可以是其中由hif1an、hif3a、phd2、tlr4和/或pai1表达的mrna的量减少的细胞。在一个实施方式中，在对低氧环境具有高适应性的细胞中，hif1an、hif3a、phd2、tlr4和/或pai1表达的mrna的表达水平低于野生型细胞中由hif1an、hif3a、phd2、tlr4和/或pai1表达的mrna的表达水平。
[0141]
在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞可以是其中由hif1an、hif3a、phd2、tlr4和/或pai1表达的蛋白的量减少的细胞。在一个实施方式中，在对低氧环境具有高适应性的细胞中，由hif1an、hif3a、phd2、tlr4和/或pai1表达的蛋白的表达水平低于野生型细胞中由hif1an、hif3a、phd2、tlr4和/或pai1表达的蛋白的表达水平。
[0142]
在一个实施方式中，当对低氧环境具有高适应性的细胞包含在hif1an基因中具有插入缺失的经工程化的hif1an基因时，由该细胞中包含的hif1an基因表达的mrna和/或fih-1的浓度可能低于野生型细胞中的浓度。在一个实施方式中，当对低氧环境具有高适应性的细胞包含在hif1an基因中具有插入缺失的经工程化的hif1an基因时，由该细胞中包含的hif1an基因表达的mrna和/或fih-1的表达水平可能低于野生型细胞中的表达水平。
[0143]
细胞表型2-与待工程化基因表达产物减少相关的定量指标的实例
[0144]
在一个实施方式中，在对低氧环境具有高适应性的细胞中，由hif1an、hif3a、phd2、tlr4和/或pai1基因表达的mrna的表达水平与野生型细胞中的表达水平相比为约0.9倍、约0.85倍、约0.8倍、约0.75倍、约0.7倍、约0.65倍、约0.6倍、约0.55倍、约0.5倍、约0.45倍、约0.4倍、约0.35倍、约0.3倍、约0.25倍、约0.2倍、约0.15倍、约0.10倍、约0.05倍、约0.04倍、约0.03倍、约0.02倍或约0.01倍或更少倍。在一个实施方式中，与野生型细胞相比，对低氧环境具有高适应性的细胞可以表现出在前一语句中选择的两个数值范围内的mrna表达水平。例如，对低氧环境具有高适应性的细胞可表现出在野生型细胞的mrna表达水平的约0.6倍至约0.7倍范围内的mrna表达水平。
[0145]
在一个实施方式中，在对低氧环境具有高适应性的细胞中，由hif1an、hif3a、phd2、tlr4和/或pai1基因表达的蛋白的表达水平与野生型细胞中的表达水平相比为约0.9倍、约0.85倍、约0.8倍、约0.75倍、约0.7倍、约0.65倍、约0.6倍、约0.55倍、约0.5倍、约0.45倍、约0.4倍、约0.35倍、约0.3倍、约0.25倍、约0.2倍、约0.15倍、约0.10倍、约0.05倍、约0.04倍、约0.03倍、约0.02倍或约0.01倍或更少倍。在一个实施方式中，与野生型细胞相比，对低氧环境具有高适应性的细胞可以表现出在前一语句中选择的两个数值范围内的蛋白表达水平。例如，对低氧环境具有高适应性的细胞可表现出在野生型细胞的蛋白表达水平的约0.6倍至约0.7倍范围内的蛋白表达水平。
[0146]
在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞表现出与野生型细胞中的表达水平相比为约0.9倍、约0.85倍、约0.8倍、约0.75倍、约0.7倍、约0.65倍、约0.6倍、约0.55倍、约0.5倍、约0.45倍、约0.4倍、约0.35倍、约0.3倍、约0.25倍、约0.2倍、约0.15倍、约0.10倍、约0.05倍、约0.04倍、约0.03倍、约0.02倍或约0.01倍或更少倍的fih-1表达水平。在一个实施方式中，与野生型细胞相比，对低氧环境具有高适应性的细胞可以表现出在前一语句中选择的两个数值范围内的fih-1表达水平。例如，对低氧环境具有高适应性的细胞可表现出在野生型细胞的fih-1表达水平的约0.6倍至约0.7倍范围内的fih-1表达水平。
[0147]
细胞表型3-关于hifα表达
[0148]
本文公开的对低氧环境具有高适应性的细胞具有高的细胞内hif1α表达水平或表现出高的hif1α活性。
[0149]
在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞可能具有比野生型细胞更高的hif1α表达水平。在这种情况下，hif1α表达水平可以是细胞中hif1α的量和/或浓度，但不限于此。
[0150]
在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞可以表现出比野生型细胞更高的hif1α活性。
[0151]
细胞表型4-与hif1α表达相关的定量指标的实例
[0152]
在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞表现出的hif1α表达水平为野生型细胞中hif1α表达水平的约1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2.0倍、约2.1倍、约2.2倍、约2.3倍、约2.4倍、约2.5倍、约2.6倍、约2.7倍、约2.8倍、约2.9倍、或约3.0倍或更多倍。在一个实施方式中，与野生型细胞相比，对低氧环境具有高适应性的细胞可以表现出在前一语句中选择的两个数值范围内的hif1α表达水平。例如，对低氧环境具有高适应性的细胞可表现出在野生型细胞的hif1α表达水平的约1.1倍至约1.5倍的范围内的hif1α表达水平。
[0153]
在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞表现出的hif1α活性水平为野生型细胞中hif1α活性水平的约1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2.0倍、约2.1倍、约2.2倍、约2.3倍、约2.4倍、约2.5倍、约2.6倍、约2.7倍、约2.8倍、约2.9倍、或约3.0倍或更多倍。在一个实施方式中，与野生型细胞相比，对低氧环境具有高适应性的细胞可以表现出在前一语句中选择的两个数值范围内的hif1α活性水平。例如，对低氧环境具有高适应性的细胞可表现出在野生型细胞的hif1α活性水平的约1.1倍至约1.5倍的范围内的hif1α活性水平。
[0154]
细胞特征1-低氧环境中的高活力
[0155]
本文公开的对低氧环境具有高适应性的细胞的特征在于，它们在低氧环境中表现出改善的适应性或活力。在这种情况下，术语“低氧环境”意指含有低浓度氧气(o2)的气态环境。结果，当将对低氧环境具有高适应性的细胞注入活的生物体(例如人)的体内时，细胞显示出改善的适应性或活力。
[0156]
在一个实施方式中，本文公开的对低氧环境具有高适应性的细胞的特征在于，其在低氧环境中比野生型细胞存活更长的时间。
[0157]
细胞特征2-低氧环境下高存活率的定量指标的实例
[0158]
在一个实施方式中，低氧环境可以意指其中o2浓度为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、或约21％或更少的气态环境。在一个实施方式中，低氧环境可以是模拟低氧环境的人工创建的环境。在一个实施方式中，低氧环境可以是其中通过使用h2o2人为诱导而通常在低氧环境中发生的活性氧化胁迫(ros)的环境。
[0159]
在一个实施方式中，当将野生型细胞和本文公开的对低氧环境具有高适应性的细胞中的一种或多种细胞置于相同的低氧环境中一定时间段时，本文公开的对低氧环境具有高适应性的细胞中的活细胞数比野生型细胞中活细胞数高约1.01倍、约1.02倍、约1.03倍、约1.04倍、约1.05倍、约1.06倍、约1.07倍、约1.08倍、约1.09倍、约1.1倍、约1.15倍、约1.2倍、约1.25倍、约1.3倍、约1.35倍、约1.4倍、约1.45倍、约1.5倍、约1.55倍、约1.6倍、约1.65倍、约1.7倍、约1.75倍、约1.8倍、约1.85倍、约1.9倍、约1.95倍、约2.0倍、约2.1倍、约2.2倍、约2.3倍、约2.4倍、约2.5倍、约2.6倍、约2.7倍、约2.8倍、约2.9倍、约3.0倍、约4倍、约5倍、或约10倍、或更多倍。在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的活细胞的数量可以大于活的野生型细胞的数量，其程度处于前一语句中选择的两个数值的范围内。在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的活细胞的数量可以比活的野生型细胞的数量高1.5至2.5倍。
[0160]
在一个实施方式中，一定时间段可以是约10分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时、约98小时、约120小时、约1周、约2周、约3周、约4周、或约一个月或更长时间。在一个实施方式中，预定时间可以是在紧接在前的语句中选择的两个数值范围内的值。例如，预定时间可以在约3小时至约12小时的范围内。
[0161]
细胞特征3-细胞因子分泌
[0162]
本文公开的对低氧环境具有高适应性的细胞可以是分泌大量特定细胞因子或特定生长因子的细胞。
[0163]
在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞可具有比野生型细胞更高的细胞因子分泌水平。在一个实施方式中，与野生型细胞相比，对低氧环境具有高适应性的细胞可以具有更高的vegf和/或il-8分泌水平。在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞可以包含经工程化的hif1an基因，并且可以具有比野生型细胞更高的vegf和/或il-8分泌水平。
[0164]
在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞可表现出比野生型细胞更高的低氧环境下的细胞因子分泌水平。在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞可具有比野生型细胞更高的低氧环境下的vegf和/或il-8分泌水平。在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞可以包含经工程化的hif1an基因，并且可以表现出高于野生型细胞的在低氧环境下的vegf和/或il-8分泌水平。
[0165]
细胞特征4-细胞因子分泌的定量指标的实例
[0166]
在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞可以分泌特定细胞因子，所述细胞因子的量比野生型细胞的量高约1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2.0倍、约2.1倍、约2.2倍、约2.3倍、约2.4倍、约2.5倍、约2.6倍、约2.7倍、约2.8倍、约是2.9倍、或约3.0倍或更多倍。在一个实施方式中，与野生型细胞相比，对低氧环境具有高适应性的细胞可以分泌特定细胞因子，所述细胞因子的量在前一语句中选择的两个数值的范围内。例如，分泌量可以高1.1到1.5倍。在这种情况下，特定的细胞因子可以是vegf和/或il-8，但不限于此。
[0167]
细胞的用途
[0168]
本文公开的对低氧环境具有高适应性的细胞可用于细胞治疗。
[0169]
在一个实施方式中，对低氧环境具有高适应性的细胞可用于预防以下疾病、缓解症状、使细胞再生或治疗以下疾病：癌症、阿尔茨海默氏病、关节炎(包括例如骨关节炎(由衰老引起的退行性关节疾病)、类风湿性关节炎和银屑病关节炎(它们是自身免疫性疾病)、以及感染引起的化脓性关节炎)。在另一实施方式中，细胞可用于以下的预防、缓解症状、再生或治疗：糖尿病视网膜病变，受损的骨、软骨、皮肤和器官(如心肌)，成骨不全症(oi)、克罗恩瘘、糖尿病足溃疡、心肌梗死、亨廷顿氏病、帕金森氏病、lou gehrig’s病、活动性佝偻病、佩吉特病(变形性骨炎)、进行性骨化纤维发育不良、额关节病和肠病性关节炎。
[0170]
用于产生对低氧环境具有高适应性的细胞的基因工程化组合物
[0171]
概述
[0172]
本文公开的用于产生对低氧环境具有高适应性的细胞的基因工程化组合物被配置为能够使用crispr/cas系统对细胞中的工程化靶基因进行编辑。该基因工程化组合物被设计以对合适的细胞内靶序列进行识别和编辑，从而可以表现出对低氧环境具有高适应性的上述细胞的基因型和/或表型。在一个实施方式中，基因工程化组合物可以包括cas9蛋白或编码所述cas9蛋白的dna，以及向导rna或编码所述向导rna的dna。在一个实施方式中，cas9蛋白可以是酿脓链球菌来源的cas9蛋白。在一个实施方式中，向导rna的序列可以是选自于由seq id no:146至seq id no:216所组成的组中的序列。
[0173]
crispr/cas系统组分1-cas9蛋白
[0174]
本文公开的用于产生对低氧环境具有高适应性的细胞的基因工程化组合物包括cas9蛋白或编码所述cas9蛋白的dna。在这种情况下，cas9蛋白可以是天然存在的cas9蛋
白，或者是其中天然存在的cas9蛋白的一个或多个结构域经人工修饰的cas9蛋白。在一个实施方式中，cas9蛋白可以具有cas9蛋白中包括的一些或所有结构域的失活功能。在一个实施方式中，cas9蛋白可以是酿脓链球菌来源的cas9蛋白。
[0175]
crispr/cas系统组分2
–
向导rna
[0176]
本文公开的用于产生对低氧环境具有高适应性的细胞的基因工程化组合物包括向导rna或编码所述向导rna的dna。在这种情况下，向导rna可以结合至cas9蛋白以形成crispr/cas复合物。向导rna的结构可大致分为支架部分和向导序列部分。支架部分可以与cas9蛋白相互作用并结合至cas9蛋白，并且其成分(序列)可以根据包含在基因工程化组合物中的cas9蛋白的类型而有所不同。向导序列部分是能够与包含在细胞中的工程化靶基因中的特定序列部分形成互补结合的部分，并且允许crispr/cas复合物对特定序列部分和/或与特定序列部分相邻的部分进行编辑。向导序列部分被设计为能够与预定的靶序列互补结合。
[0177]
在一个实施方式中，工程化靶基因可以是hif1an、hif3a、phd2、tlr4和/或pai1基因。
[0178]
在一个实施方式中，支架部分可以包括tracrrna和crrna重复序列部分。在一个实施方式中，tracrrna的序列可以是seq id no：144的序列。在一个实施方式中，tracrrna的序列可以是与seq id no：144的序列匹配至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的序列。在一个实施方式中，crrna重复序列可以是seq id no：145的序列。在一个实施方式中，crrna重复序列可以是与seq id no：145的序列匹配至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％的序列。在一个实施方式中，支架部分的序列可以是seq id no：143的序列。在一个实施方式中，支架部分的序列可以是与seq id no：143的序列匹配至少约50的序列％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％的序列。
[0179]
在一个实施方式中，向导序列部分可以是rna序列，所述rna序列对应于与在工程化靶基因中包含的原间隔区邻近基序(pam)序列相邻的dna序列。在一个实施方式中，pam的序列可以是5'-ngg'-3'。
[0180]
向导rna序列的实例
[0181]
在一个实施方式中，向导rna的向导序列部分可以是选自于由seq id no:72至seq id no:142所组成的组中的序列。在一个实施方式中，向导rna的序列可以是选自于由seq id no:146至seq id no:216所组成的组中的序列。
[0182]
crispr/cas系统组分的形式
[0183]
包含在基因工程化组合物中的crispr/cas系统中的各组分的形式没有特别限制，只要该组分可以形成crispr/cas复合物并由此在将基因工程化组合物引入细胞中时人工操纵靶基因即可。
[0184]
在一个实施方式中，基因工程化组合物可以包括核糖核蛋白(rnp)，cas9蛋白和向导rna结合于其中。在一个实施方式中，基因工程化组合物可以具有载体，所述载体包含编码cas9蛋白的dna和编码向导rna的dna。在一个实施方式中，基因工程化组合物可以具有单一载体，所述单一载体包含编码cas9蛋白的dna和编码向导rna的dna。在一个实施方式中，单一载体可以是质粒和/或病毒载体。在一个实施方式中，病毒载体可以是选自于由逆转录
病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒、痘病毒和单纯疱疹病毒所组成的组中的一种病毒载体。
[0185]
用于产生对低氧环境具有高适应性的细胞的细胞内基因工程化方法
[0186]
概述
[0187]
本公开内容公开了用于产生对低氧环境具有高适应性的细胞的细胞内基因工程化方法。具体而言，其是如下的方法：通过对表达抑制hif1蛋白的表达的物质的基因进行编辑来获得期望的细胞，以制备对低氧环境具有高适应性的上述细胞。在一个实施方式中，基因工程化方法可以包括将基因工程化组合物引入包含靶基因的细胞中。在这种情况下，基因工程化组合物可以是标题为“用于产生对低氧环境具有高适应性的细胞的基因工程化组合物”的小节中描述的基因工程化组合物。在一个实施方式中，基因工程化方法可以包括使crispr/cas9复合物与靶基因接触。在这种情况下，在crispr/cas9复合物中，酿脓链球菌来源的cas9蛋白和具有选自于由seq id no:146至seq id no:216所组成的组中的序列的向导rna可以形成复合物。
[0188]
进行基因工程化方法的环境
[0189]
在这种情况下，基因工程化方法可以在体外进行。另外，由于可以将上述对低氧环境具有高适应性的细胞用作细胞治疗剂，因此可以对从生物体分离(离体)的细胞进行基因工程化方法。在一个实施方式中，可以在体外或离体对从生物体分离的细胞进行基因工程化方法。在这种情况下，生物体可以是人生物体，但不限于此。
[0190]
靶基因
[0191]
在基因工程化方法中，作为待工程化的靶标的基因被称为靶基因。待经受基因工程化的基因是表达抑制hif1蛋白的转录、表达和/或活性的物质的野生型基因。靶基因可以是“细胞基因型1-待工程化的基因”小节中描述的基因。
[0192]
用于基因工程化的组合物
[0193]
本文公开的基因工程化方法中使用的基因工程化组合物可以是与标题为“用于产生对低氧环境具有高适应性的细胞的基因工程化组合物”小节中描述的相同的基因工程化组合物。在一个实施方式中，用于基因工程化方法的基因工程化组合物可以包括：酿脓链球菌来源的cas9蛋白或编码所述cas9蛋白的dna；以及具有选自于由seq id no:146至seq id no:216所组成的组中的序列的一种或多种向导rna或编码所述一种或多种向导rna的dna。
[0194]
用于引入基因工程化组合物的手段的实例
[0195]
在本文公开的基因工程化方法中，可以以各种方式将基因工程化组合物引入细胞中。该方式没有特别限制，只要能够达到用crispr/cas复合物对靶基因进行编辑的目的即可。
[0196]
在一个实施方式中，将基因工程化组合物引入细胞可以通过选自如下的一种或多种手段进行：电穿孔、脂质体转染、显微注射、基因提取物、脂质体、阳性脂质体、engeneic递送媒介(edv)、质粒、病毒载体、纳米颗粒、蛋白质易位结构域(ptd)融合蛋白方法、免疫脂质体、聚阳离子或脂质-核酸缀合物、裸dna、人工病毒粒、以及用于增强dna制剂吸收的方法。在一个实施方式中，当基因工程化组合物包括cas9蛋白和向导rna结合于其中的核糖核蛋白时，可以通过电休克或电穿孔将所述基因工程化组合物引入细胞中。
[0197]
逐个组分的crispr/cas系统组分介绍
[0198]
当crispr/cas系统的各个组分被独立地包含在基因工程化组合物中时，基因工程化方法可以包括向细胞中单独引入crispr/cas系统的各个组分的过程。在这种情况下，可以将crispr/cas系统的各个组分同时或以任何顺序序贯引入细胞中。在一个实施方式中，当基因工程化组合物包括作为分开的组分的向导rna和编码cas蛋白的dna时，基因工程化方法可以包括将编码cas蛋白的dna和向导rna同时引入细胞中的过程。在一个实施方式中，当基因工程化组合物包括作为分开的组分的向导rna和编码cas蛋白的dna时，基因工程化方法可以包括将编码cas蛋白的dna和向导rna以任意顺序序贯引入细胞中的过程。在一个实施方式中，当基因工程化组合物在两个以上的不同载体中包含编码cas蛋白的dna和编码向导rna的dna时，基因工程化方法可以包括将各个载体同时引入细胞中的过程。在一个实施方式中，当基因工程化组合物在两个以上的不同载体中包含编码cas蛋白的dna和编码向导rna的dna时，基因工程化方法可以包括以任意顺序序贯引入各个载体的过程。
[0199]
基因工程化组合物的介绍
[0200]
本文公开的用于产生对低氧环境具有高适应性的细胞的基因工程化方法可以包括将基因工程化组合物引入细胞的过程。
[0201]
crispr/cas复合物与靶基因之间的接触
[0202]
本文公开的用于产生对低氧环境具有高适应性的细胞的基因工程化方法可以包括使crispr/cas复合物与靶基因接触的过程。
[0203]
进行基因工程化方法1的结果-基因编辑位点
[0204]
当进行本文公开的用于产生对低氧环境具有高适应性的细胞的基因化工程方法时，基因编辑发生在细胞内靶基因的特定部分。在这种情况下，表述“基因编辑发生在特定部分”意指该特定部分和/或与其相邻的部分被crispr/cas复合物编辑。
[0205]
在一个实施方式中，作为进行基因工程化方法的结果，基因编辑可以发生在细胞中靶基因内的靶序列的一部分或与其相邻的部分中。在一个实施方式中，作为进行基因工程化方法的结果，基因编辑可以发生在细胞中hif1an、hif3a、phd2、tlr4和/或pai1基因中包括的靶序列的一部分中。
[0206]
在一个实施方式中，作为进行基因工程化方法的结果，基因编辑可以发生在细胞中的hif1an、hif3a、phd2、tlr4和/或pai1基因内的外显子区、内含子区和/或调节区中。在一个实施方式中，作为进行基因工程化方法的结果，基因编辑可以发生在选自细胞中hif1an、hif3a、phd2、tlr4和/或pai1基因中的外显子1、外显子2、外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、
……
、和外显子n中的一个或多个区域中。在这种情况下，n是任意整数。在一个实施方式中，作为进行基因工程化方法的结果，基因编辑可以发生在选自细胞中hif1an、hif3a、phd2、tlr4和/或pai1基因中的内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、
……
、和内含子m的一个或多个区域中。在这种情况下，m是任意整数。在一个实施方式中，作为进行基因工程化方法的结果，基因编辑可以发生在细胞中的靶基因包含的选自于由seq id no:1至seq id no:71所组成的组的序列中。
[0207]
进行基因工程化方法的结果2-基因编辑的方面
[0208]
当进行本文公开的用于产生对低氧环境具有高适应性的细胞的基因工程化方法时，基因编辑发生在细胞内靶基因的特定部分。作为基因编辑的结果，靶基因的表达产物的表达水平低于野生型细胞的表达水平。在这种情况下，表达产物可以是mrna或特定蛋白质。
[0209]
在一个实施方式中，作为进行基因工程化方法的结果，在靶基因中的特定部分和/或与其相邻的部分中，一个或多个核苷酸可以被插入、缺失、被其它核苷酸置换和/或倒置。在一个实施方式中，作为进行基因工程化方法的结果，插入缺失可发生在靶基因内的特定部分和/或与其相邻的部分中。在这种情况下，特定部分可以是标题为“进行基因工程化方法的结果1-基因编辑位点”的小节中例示的部分。在一个实施方式中，作为进行基因工程化方法的结果，可以敲除靶基因。在一个实施方式中，作为进行基因工程化方法的结果，可以敲低靶基因。
[0210]
包含对低氧环境具有高适应性的细胞的药物组合物
[0211]
本文公开了药物组合物，所述药物组合物包含对低氧环境具有高适应性的细胞。该药物组合物包含对低氧环境具有高适应性的细胞作为活性成分，并可用于目标疾病的诊断、症状缓解、再生和/或治疗。
[0212]
在一个实施方式中，可以向机体给予药物组合物以替换受损细胞，或治疗或再生受损组织或器官等，并且可以容易地被本领域技术人员使用。
[0213]
在一个实施方式中，药物组合物还可以包括药学上可接受的运载体。在这种情况下，药学上可接受的运载体是润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、助悬剂、防腐剂、乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐/酯、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油、盐水、磷酸缓冲盐水(pbs)和/或培养基，但不限于此。
[0214]
在一个实施方式中，药物组合物或作为药物组合物的活性成分的细胞可以在低氧环境中培养。具体而言，药物组合物或细胞可以在低氧环境中在体外或体内进行预处理。
[0215]
在一个实施方式中，药物组合物可以配制成肠胃外剂型。在这种情况下，肠胃外给予包括鼻腔给予、滴眼给予、静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射、透皮给予、皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射、脑组织注射、海马体注射、尾壳核(caudate putamen，cpu)内注射、关节内注射、软骨内注射或胸内注射等，但不限于此。
[0216]
在一个实施方式中，为了将药物组合物配制成用于肠胃外给予的制剂，可以将作为活性成分的细胞和稳定剂或缓冲剂与水一起混合以制备溶液或混悬剂。此外，药物组合物可配制成安瓿或小瓶单位剂型。在一个实施方式中，药物组合物可以包含佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂，以及治疗上有用的其它物质。药物组合物可以通过混合、制粒或包衣来配制，这些是常规方法。
[0217]
使用对低氧环境具有高适应性的细胞的治疗方法
[0218]
本文公开了使用对低氧环境具有高适应性的细胞或包含该细胞的药物组合物的治疗方法。当向活的受试者(例如人)的体内给予对低氧环境具有高适应性的细胞时，它们可以提供显著的治疗效果，同时在给予位点的低氧环境中存活长的时间。在这种情况下，治疗效果可以是减少每次给予的剂量或增加给予之间的间隔。
[0219]
本公开内容提供了通过向目标位点给予包含对低氧环境具有高适应性的细胞作为活性成分的药物组合物来用于诊断目标疾病、缓解症状、使损伤细胞再生或治疗目标疾病的方法。
[0220]
在一个实施方式中，药物组合物可以单独使用或与例如手术、放射疗法、激素疗法、化学疗法和使用生物反应调节剂的方法等方法组合使用。
[0221]
在一个实施方式中，药物组合物的合适剂量由例如制剂方法、给予方法、患者的年龄、体重、性别和医疗状况、食物、给予时间、给予途径、排泄率和应答敏感度等因素确定。普通技术从业者可以容易地确定和开出对期望的治疗或预防有效的剂量。
[0222]
实施例
[0223]
实验例
[0224]
在下文中，将参考实验例和实施例更详细地描述本公开内容提供的发明。这些实施例仅用于对本公开内容进行说明，并且对于本领域普通技术人员将显而易见的是，本公开内容的范围不应被解释为受这些实施例的限制。
[0225]
实验例1：对低氧环境具有高适应性的细胞的制备
[0226]
实验例1-1：间充质干细胞的培养
[0227]
源自人骨髓的msc购自lonza(walkersville，maryland，usa)。将msc在37℃和5％co2条件下在含有10％胎牛血清(fsb，gibco)和0.05mg/ml庆大霉素(thermo fisher scientific)的mem alpha 1x培养基(gibco，rockville，md)中进行培养。
[0228]
实验例1-2：向导rna的制备
[0229]
根据制造商的说明，使用mega short script t7试剂盒(ambion)在体外转录rna。通过对两个互补寡核苷酸进行退火和延伸制备sgrna的模板。
[0230]
各个靶标的sgrna的向导结构域在下表1至表5中示出。
[0231]
表1
[0232][0233]
表2
[0234][0235]
表3
[0236][0237]
表4
[0238]
[0239][0240]
表5
[0241][0242]
连接至各个向导结构域的核苷酸序列(crrna重复序列、接头(gaaa)和tracrrna)为5
′‑
gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt-3
′
(seq id no：143)。
[0243]
sgrna的全长序列在下表6至12中示出。
[0244]
表6
[0245][0246]
表7
[0247][0248]
表8
[0249]
[0250][0251]
表9
[0252][0253]
表10
[0254][0255]
表11
[0256][0257]
表12
[0258]
[0259][0260]
实验例1-3：转染
[0261]
根据制造商的说明，用程序ew-104使用amaxa p1 primary cell 4d nucleofector试剂盒转导msc。具体而言，将与离体转录的sgrna(4μg)预混合的cas9蛋白(4μg)在室温下孵育10分钟，然后转导至4
×
105个细胞中。
[0262]
实验例1-4：靶向深度测序
[0263]
使用phusion聚合酶(new england biolabs)扩增涵盖靶片段和潜在非靶片段的基因组dna。使用illumina miseq使pcr扩增子产物经受配对末端测序。
[0264]
实验例1-5：qrt-pcr
[0265]
使用rneasy mini kit(qiagen)获得总rna样品，并使用revertra ace qpcr rt试剂盒(toyobo)由1μg总rna合成cdna。使用power sybr green pcr master mix(applied biosystems)和steponeplus实时pcr系统(applied biosystems)对合成的cdna进行定量rt-pcr。pcr温度、时间和循环数如下。dna变性在95℃进行10分钟，引物退火在55℃至60℃进行30秒，并且聚合在72℃进行30秒。通过重复40个循环实现扩增。使用β-肌动蛋白(actb)作为归一化对照。
[0266]
实验例2：对低氧环境具有高适应性的细胞的活力的测量
[0267]
实验例2-1：活性氧胁迫下活力的测量
[0268]
对于在低氧条件下常见的活性氧化胁迫(ros)，对msc增殖能力的变化进行测量。在过氧化物(h2o2)处理诱导ros前24小时，在96孔板的各孔中培养1
×
104个细胞。24小时后，将500μm过氧化物(h2o2)添加到无血清培养基并孵育。为了在h2o2处理后24小时检查细胞活力，用cck-8细胞增殖试剂盒(usa)测量细胞活力。
[0269]
实验结果在图16中示出。
[0270]
实验例2-2：针对活性氮(snap)的细胞活力测量
[0271]
为了根据s-亚硝基-n-乙酰基-dl-青霉胺(snap，n3398)(sigma)的浓度检查细胞活力的变化，使用细胞计数试剂盒-8(cck-8)对各组的活细胞数进行计数。将在96孔板中生长的细胞用浓度在0至500μm范围内的snap进行处理，然后培养24h。接着，向各孔加入10μl cck-8溶液，随后反应2h。用elisa酶标仪在450nm处测量吸光度。
[0272]
实验结果在图20中示出。
[0273]
实验例3：对低氧环境具有高适应性的细胞的表征
[0274]
实验例3-1：实验受试细胞
[0275]
如下制备实验受试细胞。将实验例1-1中培养的人骨髓来源的间充质干细胞用实验例1-2中制备的hhif1an基因化工程组合物进行处理，然后通过深度测序筛选出适合本实
验例的细胞。作为本实验中的对照，使用shs231 ko和/或aavs1，其中，shs231 ko是其中shs231遗传序列位置经工程化的细胞，并且aavs1是其中aavs1遗传序列位置经工程化的细胞。
[0276]
实验例3-2：brdu细胞增殖测定
[0277]
在收获实验例3-1中选择的细胞之前，用10μm brdu处理细胞1小时。用brdu处理后，将细胞在4℃用pbs中稀释的3％甲醛固定1小时，然后收获，然后在室温下用1％triton x-100处理5分钟。将细胞离心，用pbs洗涤，并在室温下用4n hcl处理10分钟以使dna双链解旋，然后用pbs洗涤。在室温下用封闭溶液(处于pbs中的30％fbs、1％bsa、0.01％吐温20)处理30分钟后，收获细胞。使在pbs中稀释100倍的抗brdu小鼠igg在4℃下反应30分钟。反应产物用在pbs中稀释的0.2％吐温20进行洗涤，进行离心并收集。收集的细胞最后用pbs稀释并通过流式细胞术进行分析。
[0278]
brdu细胞增殖测定的结果在图21至图22中示出。
[0279]
实验例3-3：facs分析
[0280]
在用磷酸缓冲盐水(pbs)洗涤实验例3-1中选择的msc两次后，使用0.05％胰蛋白酶-edta对细胞进行分离，然后以1,000rpm离心5分钟。将细胞悬浮于100μl facs染色缓冲液中，与抗体混合，4℃反应1小时，用pbs洗涤2次，并悬浮于500μl pbs中，随后进行facs分析。
[0281]
facs分析的结果在图23至图25中示出。
[0282]
实验例3-4：通过细胞因子阵列验证蛋白质组学数据
[0283]
使用人xl细胞因子阵列试剂盒(cat.no.ary022，r&d systems，usa)实施细胞因子阵列。根据制造商的说明实施方法。阵列膜首先浸泡在4孔多孔培养皿中于阵列缓冲液6中，并在摇摆平台振荡器中封闭1小时。封闭后，将期望的样品体积的阵列膜在摇摆平台振荡器中于2℃至8℃孵育过夜。然后，将阵列膜用1
×
洗涤缓冲液洗涤3次10分钟。然后，每孔加入1.5ml经稀释的检测抗体混合物，并在振荡器中孵育1小时。然后，阵列膜再次用1
×
洗涤缓冲液洗涤3次。洗涤后，将阵列膜与2ml1
×
链霉亲和素-hrp孵育30分钟。最后，将1ml chemi reagent mix均匀施加至各个膜，并经受放射自显影。用图像分析软件(image j)扫描和分析x射线胶片的像素密度。
[0284]
分析结果在图28中示出。
[0285]
实验例3-5：群体倍增水平(pdl)和群体倍增时间(pdt)的测量
[0286]
为了检查细胞的生长，在传代之前和之后测量细胞的数量。将收获细胞数(c
t
)除以接种细胞数(ci)所得的值作为生长率，并使用下式计算pdl(n)。
[0287][0288]
通过将孵育时间(hr)除以pdl获得的值表示为群体倍增时间(pdt)。
[0289]
pdl和pdt测量结果在图26和图27中示出。
[0290]
实验例4：结果再现实验
[0291]
实验例4-1：结果再现实验
[0292]
为了检查实验例3的结果的再现性，用新msc库重复实验例1至实验例3的实验。重
复实验的结果在图29至图30中示出。
[0293]
实验例4-2：蛋白质印迹分析
[0294]
为了创造低氧环境，将干细胞(msc)在其中氧气浓度保持在1％的低氧室中进行培养。为了进行蛋白质印迹，收集msc，然后用含有pbs的裂解缓冲液；1％triton x-100；以及磷酸酶抑制剂混合物ii、iii和完整蛋白酶抑制剂混合物进行处理。处理后，将裂解物在4℃下以100,000g离心20分钟。收集离心所得物的上清液(不溶于非离子去污剂)。对于总裂解物，收获细胞，用pbs洗涤两次，并用pierce ripa缓冲液(150mm nacl、50mm tris、ph 8.0、1％np40、1％sds和0.5％脱氧胆酸钠和蛋白酶抑制剂混合物；thermo scientific)在冰上裂解30分钟。使用bca蛋白质测定试剂盒(thermo scientific)测量蛋白质浓度。将等量的蛋白质(10μg到20μg)溶解在8％到16％的sds-page中并转移至硝酸纤维素(nc)膜。用tbst(tris-缓冲溶液-吐温20；10mm tris-hcl[ph 7.6]、150mm nacl和0.05％吐温-20)洗涤后，将膜用5％脱脂奶封闭1小时，然后与供应商推荐的稀释剂中的适当的一抗一起进行孵育。膜用tbst进行洗涤，并用hrp缀合的二抗对一抗进行检测。通过化学发光(pierce，usa)对免疫印迹信号进行可视化。
[0295]
蛋白质印迹分析的结果在图31中示出。
[0296]
工业适用性
[0297]
本公开内容提供了在低氧条件下具有高适应性的细胞及其制备方法。在低氧条件下具有高适应性的细胞可以用作细胞治疗剂。通过用于产生在低氧环境下具有高适应性的细胞的方法，可以生产工业上可使用的在低氧环境下具有高适应性的细胞。