一株罗伊氏乳杆菌及其饲料和应用的制作方法

1.本发明属于饲用微生态制剂领域，涉及一株具有降低鸡蛋蛋黄中胆固醇功能的罗伊氏乳杆菌及其应用。


背景技术：

2.禽蛋中含有较高的优质蛋白和人体必需氨基酸和多种微量元素，具有较高的营养价值，蛋品质和蛋保质期直接影响人类健康和养殖效益。
3.随着动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病的发病率和死亡率不断上升，高血脂、高胆固醇等需要严格控制胆固醇摄入量人群对低胆固醇、高品质的禽蛋产品具有迫切需求，开发低胆固醇鸡蛋具有较大应用价值。近年来，微生态制剂在蛋鸡养殖中的应用愈加广泛，mohan等报道蛋鸡饲粮中添加嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和双歧杆菌的复合益生菌显著降低了蛋黄胆固醇含量。
4.本发明提供了一株可以降低鸡蛋蛋黄中胆固醇含量的罗伊氏乳杆菌，并深入探讨了其对蛋品质、血液生化指标、鸡蛋蛋黄中胆固醇含量的影响，为该罗伊氏乳杆菌在蛋鸡养殖和功能性食品开发中的应用提供实践指导。


技术实现要素：

5.为解决现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一株罗伊氏乳杆菌及其应用。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
7.一株罗伊氏乳杆菌，名称为dbn-skl01，于2020年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：cgmccno.19491。
8.本发明还提供了包含该罗伊氏乳杆菌dbn-skl01的微生态制剂。
9.本发明还提供了包含该罗伊氏乳杆菌dbn-skl01的的饲料。
10.进一步，所述饲料中所述罗伊氏乳杆菌的活菌数为1
×
109～5
×
10
11
cfu/kg，优选为5
×
10
10
cfu/kg.
11.本发明还提供了所述罗伊氏乳杆菌dbn-skl01在鸡养殖中的应用。
12.本发明还提供了所述罗伊氏乳杆菌dbn-skl01在改善鸡血液中丙氨酸氨基转移酶、血清总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、血清甘油三酯的应用；
13.具体为将所述罗伊氏乳杆菌dbn-skl01制备成改善鸡血液中丙氨酸氨基转移酶、血清总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、血清甘油三酯的药物或饲料。
14.本发明还提供了所述罗伊氏乳杆菌dbn-skl01在改善鸡产蛋品质中的应用。
15.本发明还提供了所述罗伊氏乳杆菌dbn-skl01在降低鸡蛋胆固醇含量的应用；
16.具体为将所述罗伊氏乳杆菌制备成降低鸡蛋胆固醇含量的药物或饲料。
17.本发明还提供了所述罗伊氏乳杆菌dbn-skl01的发酵工艺，通过如下培养基和发
酵条件进行发酵：
18.种子培养基组成为：葡萄糖5g/l、蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l、牛肉膏5g/l、氯化钠5g/l、碳酸钙2.5g/l，ph 6.5-7.0，121℃30min灭菌；
19.发酵培养基组成为：玉米淀粉：糖蜜(1:1)15g/l、豆粕20g/l、橘皮提取物15g/l、柠檬酸氢二铵2.0g/l、吐温80 1.0ml/l、乙酸钠5.0g/l、磷酸氢二钾2.0g/l、硫酸镁0.58g/l、硫酸锰0.25g/l，121℃高压灭菌30min；
20.发酵条件：接种量10％，温度：37℃，装液系数：0.5-0.8，罐压：0.03-0.05mpa，发酵过程中维持ph 6.5，搅拌转速50rpm，发酵终活菌数：6.42～7.84
×
109cfu/ml。
21.本发明相对于现有技术的有益效果在于：
22.本发明的罗伊氏乳杆菌具有安全性高，可显著降低鸡蛋蛋黄中胆固醇含量的有益效果。经过试验验证，可显著降低鸡蛋蛋黄中胆固醇的含量，并且能但显著降低了鸡血液中丙氨酸氨基转移酶、血清总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、血清甘油三酯及蛋黄中胆固醇的含量。
附图说明
23.图1为罗伊氏乳杆菌dbn-skl01菌落形态；
24.图2为罗伊氏乳杆菌dbn-skl01耐胃酸能力；
25.图3为罗伊氏乳杆菌dbn-skl01耐胆盐能力；
26.图4为罗伊氏乳杆菌dbn-skl01生长曲线；
具体实施方式
27.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
28.实施例1：罗伊氏乳杆菌dbn-skl01的筛选
29.从健康仔猪回肠中分离筛选到一株罗伊氏乳杆菌dbn-skl01，其菌落形态如图1所示，16srna测序结果如下：
30.16s扩增区域鉴定：
[0031][0032][0033]
如图2和图3所示，罗伊氏乳杆菌dbn-skl01具有良好的耐酸能力，相比于正常ph值，模拟胃酸溶液ph值4.0处理仅减缓其生长速度，但不会对其致死；模拟胃酸溶液ph值2.0处理6h存活率在95％以上；其对0.3％的胆盐耐受性良好，处理8h存活率＞95％；0.5％胆盐浓度处理8h存活率可＞93％。这说明罗伊氏乳杆菌dbn-jp具有较好的耐酸耐胆盐能力，具有作为饲用益生菌开发的潜力。
[0034]
罗伊氏乳杆菌dbn-skl01 1000l发酵罐发酵工艺如下：
[0035]
种子培养基(g/l)：葡萄糖5，蛋白胨10，酵母膏5，牛肉膏5，氯化钠5，碳酸钙2.5，ph6.5-7.0，121℃30min灭菌。
[0036]
发酵培养基(g/l)：玉米淀粉：糖蜜(1:1)15，豆粕20，橘皮提取物15，柠檬酸氢二铵[(nh4)2hc6h5o7]2.0，吐温80 1.0ml/l，乙酸钠(ch3coona
·
3h2o)5.0，磷酸氢二钾(k2hpo4·
3h2o)2.0，硫酸镁(mgso4·
7h2o)0.58，硫酸锰(mnso4·
h2o)0.25，121℃高压灭菌30min。
[0037]
温度：37℃，装液系数：0.5-0.8，罐压：0.03-0.05mpa，过程自动调控ph值为6.5，接种量10％，搅拌转速50rpm，如图4所示，发酵活菌数：6.42～7.84
×
109cfu/ml。
[0038]
实施例2罗伊氏乳杆菌冻干粉的制备
[0039]
发酵培养基：mrs培养基；
[0040]
培养条件：35-40℃，厌氧培养40-50h；发酵液4000rpm离心30min取菌泥，加入冻干保护剂，制成与离心前发酵液浓度相同的菌悬液。
[0041]
将菌悬液倒入冻干机的物料干燥盘中，预冻时间2-3小时，当机器达到第二级制冷时，抽真空开始进行冻干，此时冻干机的冷井中温度为-80℃，冻干时间18-24h。所述冻干保护剂组成为：脱脂奶粉10％，谷氨酸钠1.5％，l-半胱氨酸0.5％，乳糖2％，糊精10％。本技术为行业内常规技术。
[0042]
下述实施例中，蛋鸡基础日粮配方如表1
[0043]
表1基础饲粮水平及营养组成
[0044][0045]
下述实施例中蛋品质相关指标的检测方法为：蛋形指数、蛋壳颜色、蛋壳强度、蛋白高度、哈夫单位、蛋黄颜色、蛋壳厚度使用多功能蛋品质分析测定仪测定。
[0046]
下述实施例中蛋黄中胆固醇含量的检测方法为：取蛋品质试验后的新鲜蛋黄样品，称取2.5g放入25ml容量瓶中，加入生理盐水定容至刻度线，摇匀，制备10％蛋黄稀释液，并使用胆固醇试剂盒测定蛋黄中胆固醇的含量，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
[0047]
下述实施例中血清参数指标的测定方法为：对试验鸡进行翅下静脉采血，室温倾斜放置20min后，3 000r/min离心15min后分离血清，分装血清后于-20℃下保存测定以下指标。采用全自动生化分析仪测定血清生化指标:总蛋白、球蛋白、白蛋白、天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、血清总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯。
[0048]
下述实施例中所有数据采用ibm spass statistics 24统计软件进行单因素方差分析(one-way anova)，运用duncan’s法进行多重比较，结果用平均值
±
标准误差表示，以p《0.05判断差异显著性。
[0049]
实施例3罗伊氏乳杆菌添加量对鸡蛋蛋黄中胆固醇含量的影响
[0050]
选取蛋鸡产蛋高峰期健康蛋鸡800羽，随机分为4组，每组4个重复，每个重复50只。a组：对照组，仅添加基础饲粮；b组：添加罗伊氏乳杆菌dbn-skl01活菌数5
×
109cfu/kg基础日粮；c组：添加罗伊氏乳杆菌dbn-skl01活菌数5
×
10
10
cfu/kg基础日粮；d组：添加罗伊氏乳杆菌dbn-skl01活菌数5
×
10
11
cfu/kg基础日粮；预饲期3天，正式期49天。按照试验鸡场的常规管理程序进行免疫和日常管理，试验在同一栏舍内进行，饲养方式为四层阶梯式散养，每日两遍给饲，即上午8:00，下午4:00。固定专人饲喂，自由采食，自动饮水器饮水，随时观察鸡群的生产情况，发现疾病及时治疗。
[0051]
蛋黄中胆固醇含量分析：试验结束后，每个重复取20枚蛋，使用elisa试剂盒分析鸡蛋黄中胆固醇含量。
[0052]
表2添加不同浓度罗伊氏乳杆菌dbn-skl01对蛋黄中胆固醇含量的影响
[0053][0054]
与对照组相比，在蛋鸡饲粮中添加5
×
10
10
cfu/kg罗伊氏乳杆菌dbn-skl01可显著降低鸡蛋蛋黄中胆固醇的含量(p＜0.05)；添加量为5
×
10
11
cfu/kg与5
×
10
10
cfu/kg对鸡蛋中胆固醇的影响差异不显著(p＞0.05)。
[0055]
实施例4罗伊氏乳杆菌添加量对鸡蛋蛋黄中胆固醇含量及血液生化指标的影响
[0056]
选取蛋鸡产蛋高峰期健康蛋鸡800羽，随机分为4组，每组4个重复，每个重复50只。a组：添加罗伊氏乳杆菌dbn-skl01活菌数1
×
10
10
cfu/kg基础日粮；b组：添加罗伊氏乳杆菌dbn-skl01活菌数5
×
10
10
cfu/kg基础日粮；c组：添加罗伊氏乳杆菌dbn-skl01活菌数9
×
10
10
cfu/kg基础日粮；d组：对照组，仅添加基础饲粮；预饲期3天，正式期49天。按照试验鸡场的常规管理程序进行免疫和日常管理，试验在同一栏舍内进行，饲养方式为四层阶梯式散养，每日两遍给饲，即上午8:00，下午4:00。固定专人饲喂，自由采食，自动饮水器饮水，随时观察鸡群的生产情况，发现疾病及时治疗。
[0057]
试验结束后，每个重复取20枚蛋，测定蛋品质相关指标及蛋黄和血清中总胆固醇含量。
[0058]
表3添加不同浓度罗伊氏乳杆菌dbn-skl01对蛋品质的影响
[0059][0060][0061]
与对照组相比，蛋鸡饲粮中罗伊氏乳杆菌dbn-skl01含量为1.0
×
10
10
cfu/kg～9.0
×
10
10
cfu/kg时，对鸡蛋蛋形指数、蛋壳颜色、蛋壳强度、蛋白高度、哈夫单位、蛋黄颜色和蛋壳厚度等指标影响不显著(p＞0.05)。
[0062]
表4不同添加量对蛋鸡血液生化指标和蛋黄中胆固醇的影响
[0063][0064]
与对照组相比，蛋鸡饲粮中罗伊氏乳杆菌dbn-skl01含量为1.0
×
10
10
cfu/kg～9.0
×
10
10
cfu/kg时，对蛋鸡血液中总蛋白、白蛋白、球蛋白、天门冬氨酸氨基转移酶、低密度脂蛋白胆固醇的含量影响不显著(p＞0.05)；但显著降低了血液中丙氨酸氨基转移酶、血清总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、血清甘油三酯及蛋黄中胆固醇的含量(p＜0.05)。
[0065]
当蛋鸡饲粮中罗伊氏乳杆菌dbn-skl01含量为1.0
×
10
10
cfu/kg时，与对照组相比，蛋鸡血液中丙氨酸氨基转移酶显著降低7.42％(p＜0.05)、血清总胆固醇显著降低11.23％(p＜0.05)、高密度脂蛋白胆固醇降低12.20％(p＜0.05)、血清甘油三酯显著降低23.90％(p＜0.05)、蛋黄中胆固醇的含量显著降低12.14％(p＜0.05)；与蛋鸡饲粮中罗伊氏乳杆菌dbn-skl01含量为5.0
×
10
10
cfu/kg组和罗伊氏乳杆菌dbn-skl01含量为9.0
×
10
10
cfu/kg组相比，除血清总胆固醇显著高于其它两组(p＜0.05)，其它各项指标差异不显著(p＞0.05)。
[0066]
当蛋鸡饲粮中罗伊氏乳杆菌dbn-skl01含量为5.0
×
10
10
cfu/kg时，与对照组相比，蛋鸡血液中丙氨酸氨基转移酶显著降低9.44％(p＜0.05)、血清总胆固醇显著降低17.11％(p＜0.05)、高密度脂蛋白胆固醇降低20.33％(p＜0.05)、血清甘油三酯显著降低20.09％(p＜0.05)、蛋黄中胆固醇的含量显著降低13.69％(p＜0.05)；与蛋鸡饲粮中罗伊氏乳杆菌dbn-skl01含量为1.0
×
10
10
cfu/kg组相比，血清总胆固醇含量显著降低6.63％(p＜0.05)，其它指标差异不显著；与罗伊氏乳杆菌dbn-skl01含量为9.0
×
10
10
cfu/kg组相比，各项指标差异不显著(p＞0.05)。
[0067]
当蛋鸡饲粮中罗伊氏乳杆菌dbn-skl01含量为9.0
×
10
10
cfu/kg时，与对照组相比，蛋鸡血液中丙氨酸氨基转移酶显著降低8.25％(p＜0.05)、血清总胆固醇显著降低21.39％(p＜0.05)、高密度脂蛋白胆固醇降低15.45％(p＞0.05)、血清甘油三酯显著降低25.02％(p＜0.05)、蛋黄中胆固醇的含量显著降低13.95％(p＜0.05)；与蛋鸡饲粮中罗伊氏乳杆菌dbn-skl01含量为1.0
×
10
10
cfu/kg组相比，血清总胆固醇含量显著降低11.45％(p＜0.05)，其它指标差异不显著；与罗伊氏乳杆菌dbn-skl01含量为5.0
×
10
10
cfu/kg组相比，各项指标差异不显著(p＞0.05)。
[0068]
综上所述，在蛋鸡饲粮中添加罗伊氏乳杆菌dbn-skl01含量为1.0
×
10
10
cfu/kg～9.0
×
10
10
cfu/kg均可有效降低蛋黄中胆固醇含量，综合考虑蛋鸡血清中总胆固醇含量、高密度脂蛋白胆固醇、蛋黄中胆固醇含量指标及使用成本，罗伊氏乳杆菌dbn-skl01在蛋鸡饲粮中最优添加量为5.0
×
10
10
cfu/kg。
[0069]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。