一种可促进伪狂犬病毒增殖的猪源MLKL基因缺失细胞株及其应用

一种可促进伪狂犬病毒增殖的猪源mlkl基因缺失细胞株及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种可促进伪狂犬病毒增殖的猪源mlkl基因缺失细胞株及其应用。


背景技术：

2.猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，prv)属于疱疹病毒科，α-疱疹病毒亚科，具有143kb的双链线性dna，编码70多种蛋白质。prv的自然宿主是猪，但它可以感染大多数哺乳动物，包括猪、牛、马、啮齿动物和狗，对养殖业危害巨大。近年来，多次发现人类感染prv的情况发生。prv在猪外周神经系统的三叉神经节中可建立终身潜伏感染。在某些情况下，prv可重新激活，继而导致prv在猪场的反复流行，难以控制和根除。目前，猪伪狂犬病的防控以疫苗接种为重要手段，其中以prv bartha-k61为代表。因此，提高prv bartha-k61病毒产量对疫苗生产具有重要意义。
3.程序性细胞坏死是一种炎性细胞死亡形式，在对抗病毒感染中起着重要作用。程序性细胞坏死的发生依赖于受体相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3，ripk3)和混合谱系激酶结构域样(mixed lineage kinase domain-like，mlkl)的信号级联反应。mlkl是ripk3的功能底物，即在细胞坏死中被ripk3激活的下游蛋白。在mlkl磷酸化被激活后，寡聚体形成，这些寡聚体被转移到细胞质和细胞内膜上，导致细胞坏死。因此，研究mlkl与提高prv bartha-k61病毒产量之间的关系，对于防控猪伪狂犬病具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种可促进伪狂犬病毒增殖的猪源mlkl基因缺失细胞株及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，利用crispr/cas9基因编辑技术对pk-15细胞的mlkl基因对应的染色体序列进行双sgrna剪切，通过单克隆纯化获得了mlkl基因缺失的pk-15细胞株，为prv bartha-k61等疫苗株的培养滴度提高提供了新的策略。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种用于敲除猪源mlkl基因的sgrna，所述sgrna包括sgrna1和sgrna2，所述sgrna1的引物序列为sgrna1-f：5
′‑
caccggtaagtatgcagaagattcc-3
′
和sgrna1-r：5
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aaacggaatcttctgcatacttacc-3
′
；所述sgrna2的引物序列为sgrna2-f：5
′‑
caccgggcctggatattgtggaagc-3
′
和sgrna2-r：5
′‑
aaacgcttccacaatatccaggccc-3
′
。
7.本发明还提供一种敲除猪源mlkl基因的方法，包括以下步骤：
8.(1)将所述的sgrna1和sgrna2的引物退火后形成双链；
9.(2)将合成的双链插入sgrna骨架表达质粒载体上并转化，挑取单克隆菌株，提取携带双sgrna的重组质粒，经测序鉴定获取测序正确的sgrna重组质粒；
10.(3)将所述sgrna重组质粒转染猪肾上皮细胞，得到敲除猪源mlkl基因的猪肾上皮
细胞。
11.本发明还提供一种猪源mlkl基因缺失细胞株的构建方法，采用有限稀释法对中所得的敲除猪源mlkl基因的猪肾上皮细胞进行传代、筛选，得到猪源mlkl基因缺失细胞株。
12.本发明还提供利用所述的构建方法制备的猪源mlkl基因缺失细胞株。
13.本发明还提供一种所述的用于敲除猪源mlkl基因的sgrna在敲除mlkl基因中的应用。
14.本发明还提供一种所述的猪源mlkl基因缺失细胞株在促进病毒增殖中的应用。
15.优选的是，所述病毒为伪狂犬病毒。
16.本发明还提供一种定点敲除猪源mlkl基因的产品，包括如下任一项产品：
17.(1)所述的用于敲除猪源mlkl基因的sgrna；
18.(2)所述的sgrna重组质粒；
19.(3)所述的猪源mlkl基因缺失细胞株。
20.优选的是，所述产品包括试剂盒和试剂。
21.本发明公开了以下技术效果：
22.本发明利用crispr/cas9基因编辑技术对pk-15细胞的mlkl基因对应的染色体序列进行双sgrna剪切，通过单克隆纯化获得了mlkl基因缺失的pk-15细胞株(pk-15mlkl-ko)，该细胞株接种伪狂犬病毒(prv)后，与正常pk-15细胞相比能持续促进病毒增殖；该细胞株不仅可用于prv弱毒疫苗bartha k61株的增殖，还可以促进prv野毒gd-wh株的增殖，可为prv的培养提供良好的种子细胞。本发明为prv bartha-k61等疫苗株的培养滴度提高提供了新的策略。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1为本发明px459-sgrna1和ez-sgrna2重组质粒双酶切产物电泳图；m为dna分子量标准(dl5000)，1为ez-sgrna2质粒双酶切产物，2为px459-sgrna1质粒双酶切产物；
25.图2为本发明px459-sgrna1-sgrna2质粒测序结果图；
26.图3为本发明猪源mlkl基因缺失pk-15细胞染色体dna的pcr扩增产物电泳图；m为dna分子量标准(dl2000)，1为pk-15细胞染色体dna的pcr产物，2为猪源mlkl基因缺失pk-15细胞染色体dna的pcr产物；
27.图4为本发明猪源mlkl基因缺失pk-15细胞染色体dna的pcr扩增产物测序结果；
28.图5为本发明猪源mlkl基因缺失pk-15细胞mlkl蛋白表达的western blot鉴定结果；
29.图6为本发明prv gd-wh株在猪源mlkl基因缺失pk-15细胞的病毒滴度；
30.图7为本发明prv bartha-k61在猪源mlkl基因缺失pk-15细胞的病毒滴度。
具体实施方式
31.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
32.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
33.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
34.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
35.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
36.实施例1一种可促进伪狂犬病毒增殖的猪源mlkl基因缺失细胞株的构建、筛选方法
37.1、材料与方法
38.细胞、病毒与质粒：猪肾上皮细胞(porcine kidney epithelial cells,pk-15)购自中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，保藏编号：gdc0061；prv bartha-k61疫苗株(prv bartha-k61)购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：cvcc av249；prv gd-wh株(prv gd-wh)广东省农业科学院动物卫生研究所猪病研究室分离并保存；大肠杆菌trans10感受态细胞购自全式金公司；crispr/cas9载体质粒px459 pspcas9-2apuro-mcs和辅助载体质粒ez-guidexh均购自addgene公司。
39.试剂和抗体：限制性核酸内切酶bbsⅰ、hindiii、xhoi均购自new england biolabs公司；t4 dna ligase、t4 dna ligase buffer购自takara bio公司；lipofectamine 3000转染试剂购自thermo fisher scientific公司；本研究使用的商业抗体包括：hrp标记的山羊抗兔igg多克隆抗体、hrp标记的山羊抗小鼠igg多克隆抗体、兔抗mlkl多克隆隆抗体、小鼠抗gaph单克隆抗体均购自beyotime biotechnology公司。
40.2、试验方法
41.2.1猪源mlkl基因的crispr/cas9双grna载体的构建：
42.根据猪源mlkl基因对应的染色体序列(gene id:100736836)，设计两对特异性sgrna1和sgrna2，sgrna1的引物序列为：
43.sgrna1-f(seq id no:1)：5
′‑
caccggtaagtatgcagaagattcc-3
′
；
44.sgrna1-r(seq id no:2)：5
′‑
aaacggaatcttctgcatacttacc-3
′
；
45.sgrna2的引物序列为：
46.sgrna2-f(seq id no:3)：5
′‑
caccgggcctggatattgtggaagc-3
′
；
47.sgrna2-r(seq id no:4)：5
′‑
aaacgcttccacaatatccaggccc-3
′
。
48.引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。将合成后sgrna引物退火形成双链，分别与经bbsⅰ酶切的crispr/cas9载体px459和辅助载体ez-guidexh通过t4 dna ligase(16℃)连接过夜，获得px459-sgrna1和ez-sgrna2质粒。以hindiii、xhoi对获得的两个重组质粒进行双酶切，结果如图1所示。回收后将线性化酶切产物16℃连接过夜，随后转化至trans10感受态细胞中，通过氨苄抗性平板筛选挑取单克隆，进行菌落pcr筛选，获得携带双grna的crispr/cas9质粒px459-sgrna1-sgrna2，并测序鉴定，结果如图2所示。
49.2.2猪源mlkl基因的缺失和单克隆细胞株的筛选
50.转染前，将生长状态良好的pk-15细胞接种至6孔细胞培养板中培养，当细胞密度达到70％～80％时，按照lipofectamine 3000转染试剂说明书将5μg上述构建好的px459-sgrna1-sgrna2质粒转染至pk-15细胞中。转染24h后，更换含有0.7μg/ml嘌呤霉素、10％胎牛血清和1％青链霉素的dmem培养基中进行加压筛选。连续筛选5d，观察到阴性对照组细胞全部死亡。将得到的阳性细胞继续培养一周后消化成单个细胞，使用有限稀释法将药物筛选得到的阳性细胞稀释至96孔板中继续培养，约两周后挑选出生长状态良好的单克隆细胞进行鉴定。
51.2.3猪源mlkl基因缺失的鉴定
52.从96孔板中挑选出生长状态良好的单克隆细胞进行扩大培养，连续传代到p10代后进行pcr、测序和western blot对猪源mlkl基因的稳定敲除效果进行鉴定。具体如下：
53.取部分细胞提取细胞dna，使用针对敲除靶点设计的特异性引物对猪源mlkl基因对应的染色体序列进行pcr扩增，引物序列为mlkl-f(seq id no:5)：5
′‑
gccatctcttacctcccctga-3
′
和mlkl-r(seq id no:6)：5
′‑
aaactaaggctggaagggagca-3
′
。
54.反应体系为：
55.表1 pcr反应体系
[0056][0057]
反应程序为：94℃预变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s为一个循环，运行35个循环，最后72℃延伸8min，4℃保存。
[0058]
采用凝胶电泳检测pcr扩增产物，结果如图3所示：mlkl基因缺失细胞株染色体dna的扩增片段长度为502bp，而正常细胞染色体dna的扩增片段长度为1149bp。
[0059]
pcr扩增产物送至生工生物科技有限责任公司进行测序，检测碱基插入或者缺失情况，结果如图4所示，mlkl基因缺失细胞株染色体dna存在647bp的缺失。
[0060]
进一步的，通过western blot检测mlkl蛋白水平的表达，结果如图5所示，猪源
mlkl基因缺失的pk-15mlkl-ko细胞株不存在mlkl的蛋白表达。
[0061]
实施例2猪源mlkl基因缺失细胞株对prv增殖的促进作用分析
[0062]
以moi＝10的prv gd-wh和prv bartha-k61分别感染pk-15和pk-15mlkl-ko细胞，并置于37℃、5％co2培养箱吸附1h。吸附结束后弃去接种物，用pbs清洗细胞3次，更换为维持培养基进行培养。按照12h、24h、36h不同时间点收取细胞上清病毒液，将病毒液反复冻融三次，离心取上清液，将上清液分别10倍梯度稀释，感染96孔板中的pk-15细胞，病毒感染后共观察4d，记录各孔的病变情况。按照reed-muench法测定各上清液的prv gd-wh株和prv bartha-k61株滴度。
[0063]
结果如图6和图7所示，猪源mlkl基因缺失的pk-15mlkl-ko细胞株可明显促进prv gd-wh和prv bartha-k61的增殖滴度。
[0064]
由上可知，实施例1成功获得了猪源mlkl基因缺失的pk-15细胞株，该细胞株对prv gd-wh株和prv bartha-k61株的增殖具有明显的促进作用。
[0065]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。