一个控制玉米籽粒含水量基因ZmEIN2-1及其分子标记

一个控制玉米籽粒含水量基因zmein2-1及其分子标记
技术领域
1.本发明涉及控制玉米籽粒含水量基因zmein2-1，相关的分子标记及其在筛选或改良玉米籽粒含水量或脱水速率方面的应用，属于分子遗传学领域。


背景技术：

2.籽粒水分是影响玉米机械收获质量、安全贮藏和经济效益的关键因素。收获时的籽粒含水量对玉米收获、烘干、贮藏、运输和加工利用影响极大，含水量过高常使玉米种植者和经营者遭受经济损失，降低经济效益，还易引起籽粒霉变，影响玉米品质。此外，籽粒机收已经成为限制我国玉米生产的主要因素之一，而玉米籽粒机收最关键的环节就是收获时玉米籽粒含水量无法达到可以籽粒机收的≤25％的标准含水量(wang z,wang x,zhang l,liu x,di h,li t,jin x.qtl underlying field grain drying rate after physiological maturity in maize(zea mays l.)[j].euphytica,2012,185(3):521-528.)。所以对于收获时籽粒含水量低的玉米品种的选育非常重要。此外，低籽粒含水量可以缩短玉米的生长周期，这对于我国高纬度地区霜期前收获及黄淮海地区不影响小麦种植都有很大的生产意义。
[0003]
目前有一部分研究得到了一些控制玉米籽粒含水量及脱水速率的qtls，分布在玉米的10条染色体，其中位于1号染色体的qtl主要包括：q45dgm1-1、qhtgm1-1、qhtgm1-2和qauddc1-1(zhang j,zhang f,tang b,ding y,xia l,qi j,mu x,gu l,lu d,chen y.molecular mapping of quantitative trait loci for grain moisture at harvest and field grain drying rate in maize(zea mays l.)[j].physiol plant,2020,169(1):64-72)，mqtl1-1、mqtl1-2、mqtl1-3和mqtl1-4(li y,dong y,yang m,wang q,shi q,zhou q,deng f,ma z,qiao d,xu h.qtl detection for grain water relations and genetic correlations with grain matter accumulation at four stages after pollination in maize[j].plant biochem&physiol,2014,2(1):1-9.)以及qgwc1.1、qgwc1.2和qgdr1.2(liu j,yu h,liu y,deng s,liu q,liu b,xu m.genetic dissection of grain water content and dehydration rate related to mechanical harvest in maize[j].bmc plant biol,2020,20(1):118)。同时有研究通过关联分析克隆到了一个控制玉米水分的基因zmgar2(li w,yu y,wang l,luo y,peng y,xu y,liu x,wu s,jian l,xu j,xiao y,yan j.the genetic architecture of the dynamic changes in grain moisture in maize[j].plant biotechnol j,2021,19(6):1195-1205)。克隆控制该性状的不同基因，可以提供更多有效的基因资源和分子标记用于分子育种，选育和创制不同的快速脱水玉米材料。
[0004]
为此，本发明利用玉米关联群体及连锁群体，通过关联分析结合图位克隆定位到一个新的控制玉米籽粒含水量和脱水速率性状的基因zmein2-1，并鉴定到与之连锁的分子标记，利用上述基因、标记可以筛选玉米籽粒含水量或脱水速率性状，并培育含水量低、脱水快的玉米品种。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的之一在于提供一个影响玉米籽粒含水量性状的基因zmein2-1的核酸序列及其编码的氨基酸序列。
[0006]
本发明的目的之二在于提供了2个与玉米籽粒含水量性状紧密连锁的分子标记：indel_7/0和indel_303/000。
[0007]
本发明的目的之三在于公开一种利用分子标记鉴定和筛选玉米籽粒含水量或脱水速率性状的方法。
[0008]
本发明的目的之四在于公开一种改良玉米籽粒含水量或脱水速率性状的方法。
[0009]
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0010]
本发明提供一种蛋白在控制玉米籽粒含水量或脱水速率性状中的应用，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如seq id no.1、seq id no.17或seq id no.18任意一个所示。
[0011]
本发明还提供一种核酸在控制玉米籽粒含水量或脱水速率性状中的应用，其特征在于，所述的核酸编码上述的蛋白。
[0012]
在一些实施方案中，所述核酸的核苷酸序列或反向互补序列如seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.13、seq id no.14、seq id no.15或seq id no.16任意一个所示。
[0013]
本发明还提供一种分子标记，其特征在于，所述标记为seq id no.2所示序列第1044-1045位置处插入7个碱基agtatct；或seq id no.2所示序列第2506-2808位置处的303个碱基
[0014]
cttgatcaccaattcgcgaaagggcctctagctgagttggttaggtggtctgaatagcactcctcaggtcctgggttcgactccccgtgggagcgaatttcaggctgtggttaaaaaaatcccctcgtctgtcccacgccaaagcacaggtctaagactcagcccggtcgtggtcgttctcacatgggcttcgatgccgctgtgtatgggtggggtaggggttcgggggttttcttgacctgtgtgagaaggtatttttcttaatacaatacccggggctgtcttaccccccgcaggtcaagt。
[0015]
本发明还提供一种鉴定或辅助鉴定玉米籽粒含水量或脱水速率性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)检测待测材料中上述的分子标记；(2)如果检测结果为包含上述标记，待测材料将表现籽粒含水量高或脱水速率慢性状；如果检测结果为不包含上述标记，待测材料将表现籽粒含水量低或脱水速率快性状。
[0016]
在一些实施方案中，上述的分子标记的检测方法采用pcr扩增。
[0017]
在一些实施方案中，上述pcr扩增采用的引物对由seq id no.5/seq id no.6或seq id no.9/seq id no.10组成。
[0018]
在一些实施方案中，上述的包含上述标记的表现为pcr扩增产物如seq id no.7或seq id no.11所示；不包含上述标记的表现为pcr扩增产物如seq id no.8或seq id no.12所示。
[0019]
本发明还提供一种筛选具有低籽粒含水量或脱水速率快性状的玉米材料的方法，其特征在于，按照上述的方法检测待测材料中上述的分子标记，筛选不包含上述分子标记的材料。
[0020]
本发明还提供降低玉米籽粒含水量或提高脱水速率的方法，其特征在于，在待改良玉米材料中提高上述蛋白的表达和/或活性，选择玉米籽粒含水量低或脱水速率快的植
株。
[0021]
在一些实施方案中，所述增加蛋白表达的方法为使用高活性启动子驱动编码蛋白的核酸序列表达。
[0022]
在一些实施方案中，所述的高活性启动子为玉米ubiquitin启动子。
[0023]
在一些实施方案中，所述的玉米ubiquitin启动子序列如seq id no.19所示。
[0024]
本发明还提供上述的分子标记、方法在改良玉米籽粒含水量或脱水速率性状中的应用。
[0025]
与现有的技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的zmein2-1基因及其编码的蛋白具有调控玉米籽粒含水量或脱水速率性状的功能，该基因的功能是之前的公开资料中未报道的。本发明还提供了与zmein2-1紧密连锁的功能性分子标记indel_7/0和indel_303/000以及标记的检测方法，能够从玉米群体中特异地鉴定出具有不同籽粒含水量或脱水速率表现的基因型，并对玉米品种的籽粒含水量或脱水速率性状进行辅助鉴定和改良，从而获得低含水量或脱水速率快的玉米品种。通过超表达zmein2-1基因可以降低玉米籽粒含水量，提高脱水速率。
附图说明
[0026]
图1玉米籽粒含水量变化指数(以auddc_4_1为例)全基因组关联分析曼哈顿图。纵轴表示每个标记关联分析检验的p-value，取-log10；横轴表示染色体的位置。箭头表示目标snp。
[0027]
图2玉米籽粒含水量变化指数(以blup_auddc_4_3，13hn_auddc_5_4和14sy_auddc_4_3为例)qtl定位图。纵轴表示每个标记关联分析检验的lod值；横轴表示染色体的位置。
[0028]
图3 zmein2-1基因精细定位图。
[0029]
图4 zmein2-1基因结构、分子标记和靶标位点示意图。三角表示2个分子标记的位置和mu突变体的te插入位点；箭头表示靶标位点；atg：起始密码子；taa：终止密码子
[0030]
图5 indel_7/0分子标记导致蛋白结构变化
[0031]
图6野生型zmein2-1基因和编辑后基因的核酸序列及编码蛋白结构。wt：野生型；ko：基因编辑；下划线标识靶标序列；
“‑”
表示碱基缺失。
[0032]
图7 zmein2-1基因超表达载体图。
[0033]
图8两个超表达zmein2-1基因的转化事件基因表达量结果。wt：野生型；oe：超表达
具体实施方式
[0034]
提供以下定义和方法用以更好地界定本技术以及在本技术实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
[0035]
如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、
种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或iupac-iub生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”、“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。
[0036]
术语“性状”是指植物或特定的植物材料或细胞的生理、形态、生化或物理特性。在一些情况下，此特性对人眼是可见的，诸如种子或植株大小，或者可通过生物化学技术测量，诸如检测种子或叶的蛋白质、淀粉或油含量，或者通过观察代谢或生理过程，例如通过测量对水剥夺或特定盐或糖或氮浓度的耐受性，或者通过观察一个或多个基因的表达水平，或者通过农艺观察结果诸如渗透胁迫耐受性或收率。
[0037]“转基因”是指其基因组因异源核酸(诸如重组dna构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植株部分或植株。本文所用的术语“转基因”包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性繁殖而产生的那些，并且不涵盖通过常规植物育种方法或通过自然发生的事件(诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)进行的基因组(染色体或染色体外)改变。
[0038]“植物”包括对整株植物、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及它们的子代的标引。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚芽、分生区域、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。“子代”包含植物的任何后续世代。
[0039]
在本技术中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。“受试植物”或“受试植物细胞”是指遗传改造已经生效的植物或植物细胞，或者如此改造的植物或细胞的子代细胞，该子代细胞包含所述改造。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供用于测量受试植物或植物细胞表型改变的参考点。
[0040]
阴性或对照植物可以包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即与遗传改造起始材料具有相同基因型的植物或细胞，所述遗传改造产生受试植物或细胞；(b)与所述起始材料具有相同基因型但已用空构建体(即用对目的性状无已知效果的构建体，诸如包含标物基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)是受试植物或植物细胞的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)与所述受试植物或植物细胞在遗传上一致但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或(e)受试植物或植物细胞自身，其处于目的基因不被表
达的条件下。
[0041]
本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，以用于改造或者工程化农业上感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在的基因序列。
[0042]
在一些实施方案中，可以对本技术的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的单子叶密码子偏好性对本技术的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本技术中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据单子叶植物偏好密码子替换本技术中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在dayhoff等人(1978)atlas of protein sequence and structure(蛋白序列和结构图集)(natl.biomed.res.found.,washington,d.c)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组dna片段或cdna片段群(即基因组文库或cdna文库)。所述杂交探针可以是基因组dna片段、cdna片段、rna片段或其它寡核苷酸，并且可以用诸如32p的可检测基团或其它可检测标志物来标记。因而，例如，可以通过标记基于实施方案序列的合成寡核苷酸制备杂交探针。制备杂交探针和构建cdna及基因组文库的方法通常为本领域已知。可以在严紧条件下进行所述序列的杂交。如本文所用，术语“严紧条件”或“严紧杂交条件”表示如下条件，即在该条件下，相对于与其它序列杂交，探针将以可检测的更大程度(例如，背景的至少2倍、5倍或10倍)与其靶序列杂交。严紧条件是序列依赖性的并且在不同环境中有所不同。通过控制杂交严紧性和/或控制清洗条件，可以鉴定与所述探针100％互补的靶序列(同源探针法)。可选择地，可以调节严紧条件，以允许一些序列错配，以便检测较低的相似度(异源探针法)。通常，探针长度少于约1000或500个核苷酸。通常，严紧条件是如下的条件，即在该条件中，盐浓度为ph 7.0至8.3下，少于约1.5m na离子，通常约0.01m至1.0m na离子浓度(或其它盐)，并且温度条件为：当用于短探针时(例如10到50个核苷酸)，至少约30℃；当用于长探针时(例如大于50个核苷酸)，至少约60℃。还可以通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现严紧条件。示例性的低严紧条件包括37℃下使用30％至35％的甲酰胺缓冲液、1m nacl、1％sds(十二烷基硫酸钠)杂交，50℃至55℃下在1
×
至2
×
ssc(20
×
ssc＝3.0m nacl/0.3m柠檬酸三钠)中清洗。示例性的中度严紧条件包括37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0m nacl、1％sds中杂交，55℃至60℃下在0.5
×
至1
×
ssc中清洗。示例性的高严紧条件包括37℃下在50％甲酰胺、1m nacl、1％sds中杂交，60℃至65℃下在0.1
×
ssc中最后清洗至
少约20分钟。任选地，清洗缓冲液可以包含约0.1％至约1％sds。杂交持续时间通常少于约24小时，通常为约4小时至约12小时。特异性通常依赖杂交后的清洗，关键因素在于最后清洗溶液的离子强度和温度。dna-dna杂合体的tm(热力学熔点)可以近似自meinkoth and wahl(1984)anal.biochem.138:267-284的公式：tm＝81.5℃ 16.6(logm) 0.41(％gc)-0.61(％甲酰胺)-500/l；其中m是一价阳离子的克分子浓度，％gc是dna中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分数，“甲酰胺％”是杂交溶液的甲酰胺百分数，而l是杂合体的碱基对长度。tm是(确定的离子强度和ph下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。通常将清洗至少进行至达到平衡，并且达到低的杂交背景水平，诸如进行2小时、1小时或30分钟。每1％的错配对应使tm降低约1℃；因而，可以调节tm、杂交和/或清洗条件，从而与所需一致性的序列杂交。例如，如果需要≥90％一致性的序列，可以将tm降低10℃。通常，将严紧条件选择为比确定离子强度和ph下的特异序列及其互补序列的tm低约5℃。然而，在非常严紧的条件下，可以在比所述tm低4℃下进行杂交和/或清洗；在中度严紧条件下，可以在比所述tm低6℃下进行杂交和/或清洗；在低严紧条件下，可以在比所述tm低11℃下进行杂交和/或清洗。
[0043]
在一些实施方案中，还包括核苷酸序列及其编码的氨基酸序列的片段。如本文所用，术语“片段”指实施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相应全长蛋白的生物学活性，并因而具有蛋白活性。突变体蛋白包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性的连续氨基酸残基。一些实施方案还包括转化的植物细胞或转基因植物，其包含至少一种实施方案的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用表达载体转化植物，所述表达载体包含至少一种实施方案的核苷酸序列以及与其可操作地连接的在植物细胞中驱动表达的启动子。转化的植物细胞和转基因植物表示基因组内包含异源多核苷酸的植物细胞或植物。一般来说，所述异源多核苷酸在转化的植物细胞或转基因植物的基因组内稳定地整合，以致将所述多核苷酸传递给后代。可以将所述异源多核苷酸单独地或作为表达载体的一部分整合进基因组。在一些实施方案中，本技术涉及的植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物细胞，其为完整的植物或者植物的部分，诸如胚胎，花粉，胚珠，种子，叶，花，枝，果实，果仁，穗，穗轴，壳，秸秆，根，根尖，花药等等。本技术还包括源于本技术的转基因植物或其子代、并因而至少部分地包含本技术的核苷酸序列的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚胎以及花、茎、果实、叶以及根。
[0044]
在核酸扩增的情况下术语“扩增”是其中产生附加拷贝的选择核酸(或其转录形式)的任何过程。一般的扩增方法包括基于多种聚合酶的复制方法，包括聚合酶链反应(pcr)、连接酶介导的方法如连接酶链反应(lcr)以及基于rna聚合酶的扩增(例如通过转录)方法。
[0045]
当等位基因与性状连锁时，以及当存在的等位基因是期望的性状或性状形式将发生在包含等位基因的植株中的指示时，等位基因与性状“关联”。
[0046]
本文所用术语“数量性状基因座”或“qtl”指在至少一种遗传背景下(例如在至少一个育种种群或子代中)，具有与表型性状的差异表达关联的至少一个等位基因的多态基因座。qtl能够通过单基因机制或多基因机制发挥作用。
[0047]
本文所用术语“qtl定位”指采用类似单基因定位的方法将qtl定位在遗传图谱上，
确定qtl与遗传标记间的距离(以重组率表示)。根据标记数目的不同，可分为单标记、双标记和多标记几种方法。根据统计分析方法的不同，可分为方差与均值分析法、回归及相关分析法、矩估计及最大似然法等。根据标记区间数可分为零区间作图、单区间作图和多区间作图。此外，还有将不同方法结合起来的综合分析方法，如qtl复合区间作图(cim)多区间作图(mim)、多qtl作图、多性状作图(mtm)等。
[0048]
本文所用术语“分子标记”指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性dna片段。
[0049]
本文所用术语“主效基因”指由单个基因决定某一性状的基因称为主效基因，本文所述术语“微效基因”指对于同一性状的表型来讲，几个非等位基因中的每一个都只有部分的影响，这样的几个基因称为累加基因或多基因。在累加基因中每一个基因只有较小的一部分表型效应，所以又称为微效基因。
[0050]
本文所用术语“自交系”指在人工控制自花授粉情况下，经若干代，不断淘汰不良的穗行，选择农艺性状较好的单株进行自交，从而获得农艺性状较整齐一致、遗传基础较单纯的系。
[0051]
本文所用术语“回交”指子一代和两个亲本的任一个进行杂交的方法。
[0052]
本文所用术语“杂交”或“杂交的”指经由授粉产生子代的配子融合(例如细胞、种子或植株)。该术语包括有性杂交(一株植株被另一株植株授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠来自相同植株时)。术语“杂交”指经由授粉产生子代的配子融合行为。
[0053]
本文所用术语“回交”指其中杂交子代反复与其中一个亲本回交的过程。在一个回交方案中，“供体”亲本指具有将被渗入的期望基因或基因座的亲本植株。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或多次)指将基因或基因座渗入其中的亲本植株。初始杂交产生f1代；然后，术语“bc
1”指轮回亲本的第二次使用，“bc
2”指轮回亲本的第三次使用等。
[0054]
本文所用术语“紧密连锁”指两个连锁基因座间重组的发生频率为等于或小于约10％(即在基因图谱上的分离频率不超过10cm)。换句话说，紧密连锁的基因座至少90％的情况下共分离。当标记基因座显示与期望性状(例如病原体抗性)共分离(连锁)的显著概率时，它们在本发明中尤其有用。紧密连锁的基因座如标记基因座和第二基因座可显示10％或更低、优选约9％或更低，更优选约8％或更低，更优选约7％或更低，更优选约6％或更低，更优选约5％或更低，更优选约4％或更低，更优选约3％或更低，更优选约2％或更低的基因座内重组频率。在高度优选的实施方案中，关联基因座显示约1％或更低的重组频率，例如约0.75％或更低，更优选约0.5％或更低，更优选约0.25％或更低的重组频率。位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10％(例如约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、或更低)的两个基因座也称为彼此“接近”。在某些情况下，两个不同标记能够具有相同的基因图谱坐标。在那种情况下，两个标记彼此足够接近使得它们之间的重组发生频率低至无法检测。
[0055]
厘摩(“cm”)是重组频率的量度单位。1cm等于经过单代杂交在一个基因座上的标记将与在第二基因座上的标记分离的1％的概率。
[0056]“有利等位基因”是在特定位点的等位基因，它赋予或有助于农学上所期望的表型，例如提高的玉米长籽粒含水量性，并允许对具有农学上所期望表型的植株的鉴定。标记
的“有利”等位基因是与有利表型共分离的标记等位基因。
[0057]“基因图谱”是对给定物种中一个或多个染色体上的基因座间的基因连锁关系的描述，一般以图表或表格形式描述。就每个基因图谱而言，基因座之间的距离通过它们间的重组频率进行测量，并且基因座之间的重组可使用多种标记进行检测。基因图谱是作图的种群、使用的标记的类型、以及不同种群间各个标记的多态性潜力的产物。一个基因图谱与另一个基因图谱在基因座之间的顺序和遗传距离可能不同。然而，使用常见标记的通用框能够将一个图谱与另一个图谱的信息关联。本领域的普通技术人员可使用常见标记的框架来鉴定在各个个体基因图谱上的标记位置和受关注的基因座。
[0058]“基因图谱位置”是在相同连锁群上，相对于围绕的遗传标记在基因图谱上的位置，其中能够在给定种群中发现指定标记。
[0059]“基因作图”是限定基因座的连锁关系的方法，该方法通过使用遗传标记、标记的种群分离、以及重组频率的标准遗传原则进行。
[0060]“遗传重组频率”是两个基因座之间的交换事件(重组)的频率。在标记和/或减数分裂后性状的分离后可观察到重组频率。
[0061]
术语“基因型”是个体(或个体组)在一个或多个基因座上的基因组成，它与可观察到的性状(表型)形成对照。基因型由一个或多个已知基因座的等位基因限定，个体已经从其亲本中继承所述基因座。术语基因型可被用于指个体在单个基因座上的基因组成，在多个基因座上的基因组成，或者更一般的，术语基因型可被用于指个体在其基因组中的所有基因的基因组成。
[0062]“种质”指个体(例如植株)、一组个体(例如植株品系、品种或家族)、或来源于品系、品种、物种或培养物的克隆的或从其中得到的遗传物质。种质可为生物或细胞的部分，或者可从生物或细胞中分离得到。种质通常提供遗传物质与特异性分子构成，该分子构成提供生物或细胞培养物的一些或全部遗传性状的物理基础。如本文所用，种质包括可从中生长出新植株的细胞、种子或组织，或者植株部分如叶、茎、花粉、或细胞，它们能够被培养成整个植株。
[0063]“标记”是用作参考点的核苷酸序列或其编码产物(例如蛋白)。对于用于检测重组的标记，它们需要在被监测的种群内检测差异或多态性。对于分子标记，这意味着dna水平的差异是由于多核苷酸序列差异(例如ssr、rflp、flp和snp)。基因组可变性可为任何一种起源，例如插入、缺失、复制、重复元件、点突变、重组事件或转座因子的存在和序列。分子标记可来源于基因组或表达的核酸(例如est)，并且也可指用作探针或引物对的核酸，所述引物对能够通过使用基于pcr的方法扩增序列片段。
[0064]
对应于种群成员之间的遗传多态性的标记能够通过本领域已建立的方法进行检测。这些方法包括例如dna测序、基于pcr的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性检测(rflp)、同工酶标记检测、通过等位基因特异性杂交进行的多核苷酸多态性检测(ash)、植株基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单重复序列检测(ssr)、单核苷酸多态性检测(snp)或扩增片段长度多态性检测(aflp)。已经建立的方法也已知用于检测表达序列标签(est)和来源于est序列的ssr标记以及随机扩增的多态性dna(rapd)。
[0065]“标记等位基因”或者“标记基因座的等位基因”可以指种群中位于标记基因座的多个多态性核苷酸序列的其中一个，它就标记基因座而言是多态的。
quantitative traits in maize[j].molecular breeding,2011,28(4):511-526.)。通过5个环境的籽粒含水量的测量，得到了5个阶段的玉米籽粒含水量(gm)的表型值：分别是授粉后34天，40天，46天，52天，58天，记为34dap，40dap，45dap，52dap，58dap。同时应用最优先性无偏估计方法(blup)计算出5个环境的blup表型值，并且通过表型值推算出了籽粒含水量变化指数(auddc；评估方法参照：yang j,carena m and uphaus j.area under the dry down curve(auddc):a method to evaluate rate of dry down in maize[j].crop sci.,2010,50(6):2347-2354.)，分别记为auddc_2_1，auddc_3_2，auddc_4_3，auddc_5_4，auddc_3_1，auddc_4_2，auddc_5_3，auddc_4_1，auddc_5_2，auddc_5_1(其中数字表示5个阶段的籽粒含水量，例如：auddc_2_1就是第二次籽粒含水量(40dap)和第一次籽粒含水量(34dap)之间的auddc值)。利用关联群体1.25m snp标记的基因型数据以及通过该基因型推算出的群体结构和亲缘关系(基因型数据来自liu h,luo x,niu l,xiao y,chen l,liu j,wang x,jin m,li w,zhang q,yan j.distant eqtls and non-coding sequences play critical roles in regulating gene expression and quantitative trait variation in maize[j].mol plant,2017,10(3):414-426)，使用混合线性模型，对上述15个性状进行全基因组关联分析，以阈值为p≤2.0
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10-6
的标准下，鉴定到snp位点chr1.s_264272396与blup_gm(blup_34_dap，blup_46_dap)，blup_auddc(blup_auddc_4_1，blup_auddc_3_1，blup_auddc_5_1，blup_auddc_4_2，blup_auddc_2_1，blup_auddc_4_3，blup_auddc_3_2，blup_auddc_5_2)，
[0075]
14jl_gm(14jl_40_dap，14jl_46_dap)和14jl_blup(14jl_auddc_3_1，14jl_auddc_2_1，14jl_auddc_3_2，14jl_auddc_4_1，14jl_auddc_4_2，14jl_auddc_5_1)性状显著关联(表1；图1)。同时我们利用一个k22
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dan340构建的ril群体，表型数据收集方法同关联分析实验部分，之后利用高密度的遗传连锁图谱(pan q,li l,yang x,tong h,xu s,li z,li w,muehlbauer gj,li j,yan j.genome-wide recombination dynamics are associated with phenotypic variation in maize[j].new phytol,2016,210(3):1083-1094)定位了一个qtl位点，位于1号染色体bin1.09的主效qtl，定位到该qtl的位点的性状主要包括13hn_gm(13hn_52dap，13hn_58dap)，13hn_auddc(13hn_auddc_5_3，13hn_auddc_5_4)，14sy_gm(14sy_46_dap),14sy_auddc(14sy_auddc_3_1，14sy_auddc_3_2，14sy_auddc_4_1，14sy_auddc_4_2，14sy_auddc_4_3，14sy_auddc_5_1，14sy_auddc_5_2，14sy_auddc_5_3，14sy_auddc_5_4)，14wh_auddc(14wh_auddc_5_2，14sy_auddc_3_1)和blup_auddc(blup_auddc_4_3)(表2；图2)，该qtl与关联分析相关联的snp为相同位点，命名为qdr1-2。通过图位克隆，将qtl区间缩小到60kb，区间内有两个基因(图3)，关联分析最显著的snp所在的那个基因作为候选基因，命名为zmein2-1。
[0076]
表1显著snp(chr1.s_264272396)与性状关联分析结果
[0077][0078]
表2 qtl(qdr1-1)基本信息
[0079][0080]
实施例2基因结构和功能位点分析
[0081]
zmein2-1基因在b73参考基因组编号为zm00001eb054060，该基因位于chr1:270891072-270897163，共6092bp。序列如seq id no.2所示。该基因的功能注释为乙烯不敏感，尚没有研究表明该功能与玉米脱水速率有关。zmein2-1基因共有3个转录本，序列如seq id no.3(转录本t1)、seq id no.13(转录本t2)和seq id no.15(转录本t3)所示。其中，转录本1含有8个外显子，其中6个为编码外显子(结构如图4所示)，编码区序列如seq id no.4所示，编码的氨基酸序列如seq id no.1所示。
[0082]
通过对关联群体中不同性状表现材料的整个基因区进行测序和pcr鉴定，发现该基因有2个变异位点。第一个变异位点位于chromosome 1:270892115-270892116(seq id no.2所示序列1044-1045)位置处，在第1个外显子上，有一个7bp的插入缺失：agtatct(位置如图4所示)。7个碱基插入该位置会导致基因转录提前终止，与水分含量性状显著相关。因
此该变异可开发为分子标记indel_7/0，用以辅助鉴定玉米籽粒含水量和脱水速率。其中含有7个碱基的基因型indel_7的玉米籽粒水分含量较高，脱水较慢；不含有7个碱基的基因型indel_0的玉米籽粒水分较低，脱水较快。
[0083]
第二个变异位点位于chromosome1:270893584-270893886(seq id no.2所示序列2506-2808)位置处，在第4个和第5个外显子之间的内含子上，是一个303bp的插入缺失：
[0084]
cttgatcaccaattcgcgaaagggcctctagctgagttggttaggtggtctgaatagcactcctcaggtcctgggttcgactccccgtgggagcgaatttcaggctgtggttaaaaaaatcccctcgtctgtcccacgccaaagcacaggtctaagactcagcccggtcgtggtcgttctcacatgggcttcgatgccgctgtgtatgggtggggtaggggttcgggggttttcttgacctgtgtgagaaggtatttttcttaatacaatacccggggctgtcttaccccccgcaggtcaagt(位置如图4所示)。通过t-test分析，发现该标记与表型blup_auddc_4_1显著关联(表3)。因此该变异可开发为分子标记indel_303/000，用以辅助鉴定玉米籽粒含水量和脱水速率。其中含有303个碱基的基因型indel_303的玉米籽粒水分含量较高，脱水较慢；不含有303个碱基的基因型indel_000的玉米籽粒水分较低，脱水较快。
[0085]
表3分子标记indel_303/000影响玉米籽粒水分及其变化(blup_auddc_4_1)
[0086][0087]
auddc_4_1值越高，表明籽粒含水量越高，脱水速率越低。
[0088]
实施例3玉米籽粒含水量相关分子标记检测方法
[0089]
根据indel_7/0和indel_303/000位置处附近的基因组序列，可采用pcr方法鉴定该分子标记。indel_7/0位置处pcr鉴定使用的引物对如seq id no.5和seq id no.6所示。indel_303/000位置处pcr鉴定使用的引物对如seq id no.9和seq id no.10所示。
[0090]
分子标记检测采用如下的方法：
[0091]
(1)玉米基因组dna提取：
[0092]
1.取玉米叶片1.5g左右于液氮中研磨，转入2ml离心管中。
[0093]
2.加预热至65℃的ctab提取缓冲液750μl，迅速混匀。在65℃水浴锅内水浴30分钟左右，中途不时小心柔和摇动2-3次离心管。
[0094]
3.取出离心管，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，在摇床上摇动试管10分钟，直到溶液分层，下层为墨绿色，上层为浅黄色。
[0095]
4.室温12000rpm离心10分钟，将上清转移到1.5ml离心管中。
[0096]
5.向上清液中加入2/3体积预冷的异丙醇，小心混匀。放入-20度冰柜中放置30分钟。
[0097]
6.然后4℃，12000rpm离心10分钟。
[0098]
7.倒去上清液体，再加入1ml的75％乙醇，浸泡5分钟。再重复洗涤一次。然后将液体倒去，将离心管子放置30min，在常温吹干，加200μl水溶解dna。
[0099]
8.用1％琼脂糖检测dna质量，并测定dna浓度。dna放置在-20℃冰箱备用。
[0100]
(2)pcr体系和程序为：
[0101]
pcr体系：
[0102][0103]
pcr程序：
[0104][0105]
(3)凝胶成像
[0106]
1％琼脂糖凝胶上检测。
[0107]
indel_7/0位置处pcr使用的引物对如seq id no.5和seq id no.6所示。基因型为indel_7的材料扩增出84bp的条带(序列如seq id no.7所示)，这些材料表现为籽粒含水量高，脱水速率慢；基因型为indel_0的材料扩增出77bp的条带(序列如seq id no.8所示)这些材料表现为籽粒含水量低，脱水速率快。
[0108]
indel_303/000位置处使用的引物对如seq id no.9和seq id no.10所示。基因型为indel_303的材料扩增出935bp的条带(序列如seq id no.11所示)，这些材料表现为籽粒含水量高，脱水速率慢；基因型为indel_000的材料扩增出632bp的条带(序列如seq id no.12所示)，这些材料表现为籽粒含水量低，脱水速率快。
[0109]
使用上述方法检测了多个自交系材料，结果显示对该标记的检测能够很好地区分不同材料间的籽粒含水量或脱水速率性状。部分材料标记检测结果和脱水性状数据见表4。
[0110]
表4部分材料的标记检测结果和脱水性状
[0111][0112]
实施例4失活zmein2-1蛋白，改变玉米籽粒含水量和脱水速率
[0113]
zmein2-1基因具有控制玉米籽粒含水量和脱水速率的功能，为了进一步验证基因对籽粒含水量和脱水速率的调控方式，本发明利用crispr-cas9基因编辑技术对该基因进行敲除。通过蛋白结构预测，该基因编码蛋白含有nramp-like结构域(图6)。针对基因组序列，在第5个外显子和第6个外显子处设计两个靶标，分别为gtaatgttccccaagttgag和gcaggttcagagaagatttc(靶标位置见图4)，合成sgrna(sgrna_1和sgrna_2)，并构建基因编辑载体。将载体转化玉米品种kn5585，最终获得了一个基因被成功编辑的转化体，该转化体丢失了714个碱基，并且同时插入了76个碱基，基因翻译提前终止，导致蛋白结构域丢失，编辑后的蛋白结构见图6。该基因编辑材料在海南三亚和吉林公主岭两个环境下调查了auddc和含水量变化等性状数据，证实该基因编辑后，玉米籽粒含水量升高，脱水速率变慢(表5和表6)。
[0114]
表5 zmein2-1基因编辑影响玉米籽粒水分变化
[0115][0116][0117]
wt：野生型；ko：基因编辑
[0118]
表6 zmein2-1基因编辑影响玉米籽粒含水量
[0119][0120]
wt：野生型；ko：基因编辑
[0121]
另外，通过筛选玉米突变体库，从中获得了ein2-1基因5’utr区域插入转座子的一个突变体(图4)。检测发现，该突变体和野生型材料表型上存在差异，突变体籽粒含水量变高，脱水变慢(表7和表8)。
[0122]
表7 zmein2-1基因突变体影响玉米籽粒水分变化
[0123][0124]
wt：野生型；mu：突变体
[0125]
表8 zmein2-1基因突变体影响玉米籽粒含水量
[0126][0127]
wt：野生型；mu：突变体
[0128]
实施例5超表达ein2-1基因降低玉米籽粒含水量，提高脱水速率
[0129]
ein2-1基因敲除后，玉米籽粒含水量升高，脱水变慢。因此，为了降低玉米籽粒含水量，提高玉米籽粒脱水速率，可以通过超表达该基因的方式实现。
[0130]
超表达可选择强启动子(如ubiquitin，或actin，或35s等)驱动ein2-1基因(seq id no.2所示的基因组序列，或seq id no.3或seq id no.13或seq id no.15所示的cdna序列，或seq id no.4或seq id no.14或seq id no.16所示的编码区序列)表达。本实施例选择玉米强启动子ubiquitin(seq id no.19)驱动含有编码区的一段基因组序列(具体为seq id no.2的210-4530位置序列)表达，构建超表达载体(载体图如图7所示)。将超表达载体转化玉米自交系kn5585，对获得的转化苗进行检测，鉴定出两个目的基因稳定超表达的转化事件zmein2-1#oe1和zmein2-1#oe2，基因表达量结果如图8所示。调查籽粒的含水量和脱水速率后发现，超表达玉米植株籽粒含水量降低，脱水速率变快(表9和表10)。
[0131]
表9 zmein2-1基因超表达影响玉米籽粒水分变化
[0132][0133]
oe1：超表达材料1；wt1：野生型对照1；oe2：超表达材料2；wt2：野生型对照2。
[0134]
表10 zmein2-1基因超表达影响玉米籽粒含水量
[0135][0136]
oe1：超表达1；wt1：野生型对照1；oe2：超表达材料2；wt2：野生型对照2；na：未检测。
[0137]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。