一种改善胃肠功能和睡眠障碍的益生菌组合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及微生物技术领域以及医药技术领域，具体涉及一种改善胃肠功能和睡眠障碍的益生菌组合物及其制备方法。


背景技术：

2.孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder，asd)简称孤独症是一组以社交沟通障碍、兴趣或活动范围狭窄以及重复刻板行为为主要特征的神经发育性障碍。到目前为止，尚无关于预防或治疗asd核心症状的有效药物的报道，孤独症正在成为限制儿童健康和成长的最重要原因之一。asd核心症状尚无有效药物可以治疗，因此，目前在循证医学证据的指导下，主要根据患儿的年龄、发育水平以及在家庭推行的适用性来选择适合的早期教育训练干预方法和抗精神病药物以改善asd核心症状，如社交沟通能力、重复刻板行为、生活自理能力等问题。但是，上述抗精神病药物药物存在较大的不良反应，并且多数患者及其家属对抗精神病药物存在顾虑，这些不仅给asd治疗带来了极大的困难，同时也给患者的生活带来了极大的困扰，限制了其应用范围。因此，目前国内外主要采用以教育为主的治疗方案，主要有应用行为分析疗法（applied behaviour analysis,aba），结构化教育（treatment and education of autistic and communication handicapped children,teacch）、人际关系发展干预（relationship development intervention,rdi）、地板时光（floor time）、早期丹佛模式（early start denver model,esdm）、ja训练、交互模仿训练（reciprocal imitation training, rit）、学龄前孤独症沟通干预（preschool autism communication trial, pact）、关键反应训练（pivotal response training, prt）、社交情绪调控交互支持（scerts模式）、社交故事（social story）、图片词汇交换系统（pecs）等。需要强调的是，除了早期综合干预之外，asd患儿常常伴有睡眠障碍、胃肠道问题、焦虑、过度活跃,注意力缺陷多动障碍等问题，这些问题通常认为不是由于疾病本身所引起的，常常被忽视，并缺乏针对性的干预。研究发现胃肠道和睡眠问题在asd儿童中很普遍，尤其是便秘更突出。mar
í
a等人发现约70%的asd患儿伴有胃肠道紊乱，其中47.4%患儿有便秘症状，而且患有胃肠道症状的asd患儿的核心症状变得更加严重；此外，睡眠深度和快动眼睡眠压力的变化已与情绪、焦虑、孤独症和精神分裂症有关。这些问题可能与asd核心症状有关，在asd治疗的过程应将这些问题纳入治疗的方案中。。
3.因此，需要提供一种能够改善胃肠功能和睡眠障碍的益生菌组合物及其制备方法，以解决上述现有存在的问题。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明提供一种能够改善胃肠功能和睡眠障碍的益生菌组合物及其制备方法，该益生菌组合物通过12种益生菌菌株的复配，在临床上能有效改善asd患者粪便形状、睡眠行为、晨起习惯、白天嗜睡程度等睡眠问题；同时有效改善asd患者腹痛、烧心、酸反
2017265，微生物分类命名为长双歧杆菌bifidobacterium longum tr17；所述突变体为对所述植物乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体；所述动物双歧杆菌冻干粉由动物双歧杆菌和/或其突变体制得；所述动物双歧杆菌命名为tr20，已在2017年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc no：m 2017266，微生物分类命名为动物双歧杆菌bifidobacterium animalis tr20；所述突变体为对所述植物乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体；所述副干酪乳杆菌冻干粉由副干酪乳杆菌和/或其突变体制得；所述副干酪乳杆菌命名为tr5c-1，已在2018年09月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc no：m 2018608，微生物分类命名为副干酪乳杆菌lactobacillus paracasei tr5c-1；所述突变体为对所述植物乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体；所述嗜热链球菌冻干粉由嗜热链球菌和/或其突变体制得；所述嗜热链球菌命名为tr14，已在2018年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc no：m 2018689，微生物分类命名为嗜热链球菌streptococcus thermophilus tr14；所述突变体为对所述植物乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体；所述嗜酸乳杆菌冻干粉由嗜酸乳杆菌和/或其突变体制得；所述嗜酸乳杆菌命名为tr03，已在2016年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc no：m 2016568，微生物分类命名为嗜酸乳杆菌lactobacillus acidophilus tr03；所述突变体为对所述植物乳杆菌进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体；保藏地址：中国武汉武汉大学。进一步的，按重量份包括罗伊氏乳杆菌tr02冻干粉12～20份、瑞氏乳杆菌tr11冻干粉8～12份、植物乳杆菌tr22冻干粉8～12份、干酪乳杆菌tr01冻干粉12～20份、鼠李糖氏乳杆菌tr08冻干粉12～20份、乳双歧杆菌tr101冻干粉12～20份、短双歧杆菌tr103冻干粉8～12份、长双歧杆菌tr17冻干粉4～6份、动物双歧杆菌tr20冻干粉12～20份、副干酪乳杆菌tr5c-1冻干粉4～6份、嗜热链球菌tr14冻干粉4～6份、嗜酸乳杆菌tr03冻干粉4～6份。
6.进一步的，所述罗伊氏乳杆菌tr02冻干粉中的活菌数为6
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g；和/或所述瑞氏乳杆菌tr11冻干粉中的活菌数为4
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g；和/或所述植物乳杆菌tr22冻干粉中的活菌数为4
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g；和/或所述干酪乳杆菌tr01冻干粉中的活菌数为6
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g；和/或所述鼠李糖氏乳杆菌tr08中的活菌数为6
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g；和/或所述乳双歧杆菌tr101冻干粉中的活菌数为6
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g；和/或所述短双歧杆菌tr103冻干粉中的活菌数为4
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g；和/或所述长双歧杆菌tr17冻干粉中的活菌数为2
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g；和/或所述动物双歧杆菌tr20冻干粉中的活菌数为6
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g；和/或所述副干酪乳杆菌tr5c-1冻干粉中的活菌数为2
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g；和/或所述嗜热链球菌tr14冻干粉中的活菌数为2
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g；和/或所述嗜酸乳杆菌tr03冻干粉中的活菌数为2
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g。
7.一种上述的改善胃肠功能和睡眠障碍的益生菌组合物的制备方法，包括以下步骤：（1）称取各原料备用；
（2）将除罗伊氏乳杆菌tr02、干酪乳杆菌tr01、鼠李糖氏乳杆菌tr08、乳双歧杆菌tr101和动物双歧杆菌tr20冻干粉外的各原料混合均匀，得到混合小料，待用；（3）将除罗伊氏乳杆菌tr02、干酪乳杆菌tr01、鼠李糖氏乳杆菌tr08冻干粉外的剩余原料与步骤（2）所得混合小料混合均匀，得到混合半成品；（4）将步骤（3）所得混合半成品进行沸腾制粒，过筛，得到沸腾制粒半成品；（5）将步骤（4）所得沸腾制粒半成品与罗伊氏乳杆菌tr02、干酪乳杆菌tr01、鼠李糖氏乳杆菌tr08冻干粉混合均匀，得到总混合半成品；（6）将步骤（5）所得总混合半成品进行包装，即得益生菌组合物。
8.进一步的，所述步骤（4）中，沸腾制粒过程采用粘合剂。
9.进一步的，所述粘合剂为纯水、玉米淀粉、麦芽糊精中的至少一种。
10.进一步的，步骤（3）中，混合转速为10-30rpm，混合时间为5-15min；步骤（4）中，沸腾制粒时，进风温度80-90℃，排风变频50-80%，物料温度50-60℃，雾化压力2.5-3.5bar，喷浆供浆泵转速60-80rpm；步骤（4）中，过筛时，筛网选择20-40目标准筛；步骤（5）中，混合转速为15-35rpm；混合时间为10-20min；步骤（6）中，包装时，充入氮气，残氧量为3-10%；步骤（1）～（6）全部在gmp车间中恒温恒湿环境中进行，温度为18-26℃，湿度为25-40%。
11.进一步的，步骤（6）中，所述益生菌组合物的水分含量为2-5%，水分活度为0.1-0.3aw。
12.一种上述的改善胃肠功能和睡眠障碍的益生菌组合物的应用，应用于制备具有改善胃肠功能和睡眠障碍作用的产品中，所述产品中，总的活菌数为不低于1
×
109cfu/ml或1
×
109cfu/g。
13.进一步的，所述产品包含食品、药品或保健品；所述药品包含药物载体和/或药用辅料。
14.本发明的上述技术方案至少包括以下有益效果：1、益生菌组合物具有改善胃肠功能和睡眠障碍的作用，具体体现在显著改善临床确诊的asd患者粪便形状；显著改善临床确诊的asd患者睡眠行为和晨起习惯；显著改善临床确诊的asd患者白天嗜睡程度；显著改善临床确诊的asd患者腹痛、烧心、酸反流、上腹部紧抽感、恶心和呕吐症状；显著改善临床确诊的asd患者腹鸣、腹胀、嗳气、排气增多、排便减少和稀便症状；本发明的益生菌组合物在制备治疗孤独症谱系障碍儿童睡眠和肠道症状的产品中，具有巨大的应用前景；本发明所使用的益生菌，目前均已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，因此，本发明提供的配方对人体而言，相对健康，无副作用；2、本发明的组合物将12种益生菌进行复配，有利于益生菌在肠道中的定植和生长，能提高其改善asd患者肠道健康的能力；3、本发明的组合物组合组，通过菌种间的协同作用，可以减少益生菌的用量，提高安全性，扩大应用范围；4、本发明的组合物之间发挥协调作用，能有效改善asd患者的临床症状，具有治疗孤独症谱系障碍儿童睡眠和肠道症状的的功能；
5、本发明所制备的组合物可明显的治疗孤独症谱系障碍胃肠功能和睡眠障碍症状，且制备方法简单，可批量生产。
附图说明
15.图1为本发明实施例中服用益生菌组合物前后asd患者大便形态改变情况图；图2为本发明实施例中服用益生菌组合物前后asd患者睡眠改变情况图；图3为本发明实施例中服用益生菌组合物前后asd患者胃肠道不适改变情况图；图4为服用益生菌组合物前后asd患者胃肠道功能改变情况。
具体实施方式
16.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图1-4，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
17.一种益生菌组合物，包括罗伊氏乳杆菌tr02冻干粉12～20份、瑞氏乳杆菌tr11冻干粉8～12份、植物乳杆菌tr22冻干粉8～12份、干酪乳杆菌tr01冻干粉12～20份、鼠李糖氏乳杆菌tr08冻干粉12～20份、乳双歧杆菌tr101冻干粉12～20份、短双歧杆菌tr103冻干粉8～12份、长双歧杆菌tr17冻干粉4～6份、动物双歧杆菌tr20冻干粉12～20份、副干酪乳杆菌tr5c-1冻干粉4～6份、嗜热链球菌tr14冻干粉4～6份、嗜酸乳杆菌tr03冻干粉4～6份。所述罗伊氏乳杆菌tr02冻干粉中的活菌数为6
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g。所述瑞氏乳杆菌tr11冻干粉中的活菌数为4
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g。所述植物乳杆菌tr22冻干粉中的活菌数为4
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g。所述干酪乳杆菌tr01冻干粉中的活菌数为6
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g。所述鼠李糖氏乳杆菌tr08中的活菌数为6
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g。所述乳双歧杆菌tr101冻干粉中的活菌数为6
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g。所述短双歧杆菌tr103冻干粉中的活菌数为4
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g。所述长双歧杆菌tr17冻干粉中的活菌数为2
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g。所述动物双歧杆菌tr20冻干粉中的活菌数为6
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g。所述副干酪乳杆菌tr5c-1冻干粉中的活菌数为2
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g。所述嗜热链球菌tr14冻干粉中的活菌数为2
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g。所述嗜酸乳杆菌tr03冻干粉中的活菌数为2
×
108cfu/g-1
×
10
12
cfu/g一种益生菌组合物的制备方法，包括以下步骤：（1）称取各原料备用；（2）将除罗伊氏乳杆菌tr02、干酪乳杆菌tr01、鼠李糖氏乳杆菌tr08、乳双歧杆菌tr101和动物双歧杆菌tr20冻干粉外的各原料混合均匀，得到混合小料，待用；再将除外的剩余原料与步骤上述所得混合小料混合均匀；（3）将除3种益生菌（罗伊氏乳杆菌tr02、干酪乳杆菌tr01、鼠李糖氏乳杆菌tr08冻干粉）冻干粉外的剩余原料与步骤(2)所得混合小料混合均匀，得到混合半成品；混合转速控制在10-30rpm，优选20rpm，混合时间控制在5-15min，优选10min；（4）将步骤(3)所得混合半成品进行沸腾制粒，过筛，得到沸腾制粒半成品；沸腾制粒过程采用粘合剂，所述粘合剂为纯水、玉米淀粉、麦芽糊精中的至少一种；沸腾制粒时，进
风温度80-90℃，排风变频50-80％，物料温度50-60℃，雾化压力25-35bar，喷浆供浆泵转速60-80rpm；沸腾制粒后产物进行过筛，筛网选择20-40目标准筛；（5）将步骤(4)所得沸腾制粒半成品与3种益生菌冻干粉混合均匀，得到总混合半成品；混合转速控制在15-35rpm，优选25rpm，混合时间控制在10-20min，优选15min；（6）将步骤(5)所得总混合半成品用条包灌装机包装，即得益生菌组合物；包装时应该充入氮气，残氧量控制在3-10％；包装所用包材，采用铝塑包材；所述益生菌组合物的水分含量控制在2-5％，水分活度控制在0.1-0.3aw。
18.步骤(1)～(6)全部在十万级gmp车间中恒温恒湿环境中进行，温度控制在18-26℃，湿度控制在25-40％。
19.一种改善胃肠功能和睡眠障碍的益生菌组合物的应用，应用于制备具有改善胃肠功能和睡眠障碍作用的产品中，所述产品中，总的活菌数为不低于1
×
109cfu/ml或1
×
109cfu/g。所述产品包含食品、药品或保健品；所述药品包含药物载体和/或药用辅料。
20.实施例1：益生菌组合物对asd患者大便形态的影响本发明一种具有治疗女性外阴炎症的益生菌组合物，益生菌组合物包括如下活菌数原料：罗伊氏乳杆菌tr02冻干粉中的活菌数为6
×
10
10
cfu/g、瑞氏乳杆菌tr11冻干粉中的活菌数为4
×
108cfu/g、植物乳杆菌tr22冻干粉中的活菌数为4
×
108cfu/g、干酪乳杆菌tr01冻干粉中的活菌数为6
×
108cfu/g、鼠李糖氏乳杆菌tr08中的活菌数为6
×
108cfu/g、乳双歧杆菌tr101冻干粉中的活菌数为6
×
108cfu/g、短双歧杆菌tr103冻干粉中的活菌数为4
×
108cfu/g、长双歧杆菌tr17冻干粉中的活菌数为2
×
108cfu/g、动物双歧杆菌tr20冻干粉中的活菌数为6
×
108cfu/g、副干酪乳杆菌tr5c-1冻干粉中的活菌数为2
×
108cfu/g、嗜热链球菌tr14冻干粉中的活菌数为2
×
108cfu/g、嗜酸乳杆菌tr03冻干粉中的活菌数为2
×
108cfu/g。
21.选择郑州大学第三附属医院(河南省妇幼保健院)确诊收治入院的119例asd儿童患者，进行6个月的干预试验，即用药3个月，停药3个月；儿童患者每日服用实施例1的益生菌组合物4g，干预前的大便形态记录即为t0，干预3个月后的大便形态记录即为t1，干预6个月后的大便形态记录即为t2。根据布里斯托大便分类法记录每个asd患儿的大便分类，分别是1型：一颗颗硬球（很难通过）；2型：香肠状，但表面凹凸；3型：香肠状，但表面有裂痕；4型：像香肠或蛇一样，且表面很光滑；5型：断边光滑的柔软块状（容易通过）。如图1所示：t0时，1型的占比为17.8%，2型的占比为55.6%，3型的占比为20%,4型的占比为4.4%；干预3个月后（t1），1型的占比降低至2.56%，2型的占比降低至23.1%，3型的占比升高为71.8%；干预6个月后（t2），1型的占比降低至0.0%，2型的占比降低至0.0%，4型的占比升高为83.3%。以上实验表明，本发明提供的益生菌组合物可显著改善asd患者的大便异常情况，有助于改善asd相关便秘。
22.实施例2：益生菌组合物对asd患者睡眠情况的影响选择郑州大学第三附属医院(河南省妇幼保健院)确诊收治入院的119例asd儿童患者，进行6个月的干预试验，即用药3个月，停药3个月；儿童患者每日服用实施例1的益生菌组合物10g，干预前的睡眠情况记录即为t0，干预3个月后的睡眠情况记录即为t1，干预6个月后的睡眠情况记录即为t2。根据儿童睡眠习惯问卷中文版（cshq），分别从8个不同的层面反映儿童的睡眠问题，分别是
①
就寝习惯；
②
入睡潜伏期；
③
睡眠持续时间；
④
睡眠焦虑；
⑤
夜醒；
⑥
异态睡眠；
⑦
睡眠呼吸障碍；
⑧
白天嗜睡；如图2所示：t0时，就寝习惯总分22.7
±
2.95，睡眠行为总分30.75
±
3.69，夜间隔问题总分4.24
±
1.16，晨起习惯总分21.62
±
3.8，白天嗜睡程度总分4.68
±
1.03；总分83.17
±
5.52；干预3个月后（t1），就寝习惯总分20.27
±
2.96，睡眠行为总分28.65
±
3.14，夜间隔问题总分4.24
±
1.16，晨起习惯总分21.62
±
3.8，白天嗜睡程度总分4.68
±
1.03；总分75.22
±
6.64；相比较t0时期，具有统计学意义，示asd儿童的睡眠障碍好转；停药3个月后，就寝习惯总分19.58
±
2.14，睡眠行为总分27.361
±
2.71，夜间隔问题总分4.14
±
0.73，晨起习惯总分20.94
±
2.82，白天嗜睡程度总分4.25
±
0.5；总分72.25
±
4.30；相比较t0时期，具有统计学意义，示asd儿童的睡眠障碍好转，但是与t1时期相比仅总分具有统计学差异，其余各项均无统计学差异，示服用益生菌3月后，对睡眠具有改善作用，并且此作用持续停药3个月后。
23.实施例3：益生菌组合物对asd胃肠道不适情况的影响选择郑州大学第三附属医院(河南省妇幼保健院)确诊收治入院的119例asd儿童患者，进行6个月的干预试验，即用药3个月，停药3个月；儿童患者每日服用实施例1的益生菌组合物4g，干预前的睡眠情况记录即为t0，干预3个月后的睡眠情况记录即为t1，干预6个月后的睡眠情况记录即为t2。如图3所示：t0时，腹痛的asd患儿占比为11.11%；干预3个月后（t1），腹痛占比下降至7.69%；干预6个月后（t2），腹痛占比下降至0%。t0时，烧心的asd患儿占比为13.33%；干预3个月后（t1），烧心占比下降至5.12%；干预6个月后（t2），烧心占比下降至0%。t0时，酸反流的asd患儿占比为13.33%；干预3个月后（t1），酸反流占比下降至5.12%；干预6个月后（t2），酸反流占比下降至5.55%。t0时，上腹部紧抽感的asd患儿占比为8.88%；干预3个月后（t1），上腹部紧抽感占比下降至2.56%；干预6个月后（t2），上腹部紧抽感占比下降至0%。t0时，恶心呕吐的asd患儿占比为33.33%；干预3个月后（t1），恶心呕吐占比下降至15.38%；干预6个月后（t2），恶心呕吐占比下降至5.56%。t0时，腹鸣的asd患儿占比为24.44%；干预3个月后（t1），腹鸣占比下降至7.69%；干预6个月后（t2），腹鸣占比下降至5.56%。t0时，腹胀的asd患儿占比为57.78%；干预3个月后（t1），腹胀占比下降至30.78%；干预6个月后（t2），腹胀占比下降至16.67%。以上实验表明，本发明提供的益生菌组合物可显著改善asd患者的胃肠道不适情况，有助于改善asd相关症状。
24.实施例4：益生菌组合物对asd胃肠道功能情况的影响选择郑州大学第三附属医院(河南省妇幼保健院)确诊收治入院的119例asd儿童患者，进行6个月的干预试验，即用药3个月，停药3个月；儿童患者每日服用实施例1的益生菌组合物4g，干预前的睡眠情况记录即为t0，干预3个月后的睡眠情况记录即为t1，干预6个月后的睡眠情况记录即为t2。如图4所示：t0时，排气增多的asd患儿占比为42.22%；干预3个月后（t1），排气增多占比下降至25.64%；干预6个月后（t2），排气增多占比下降至11.11%。t0时，排便减少的asd患儿占比为35.56%；干预3个月后（t1），排气增多占比下降至25.64%；干预6个月后（t2），排气增多占比下降至16.67%。t0时，稀便的asd患儿占比为15.56%；干预3个月后（t1），排气增多占比下降至5.19%；干预6个月后（t2），排气增多占比下降至5.56%。t0时，排便紧迫感的asd患儿占比为40%；干预3个月后（t1），排气增多占比下降至35.9%；干预6个月后（t2），排气增多占比下降至33.33%。t0时，排便不尽感的asd患儿占比为55.56%；干预3个月后（t1），排气增多占比下降至41.02%；干预6个月后（t2），排气增多占比下降至33.33%。以上实验表明，本发明提供的益生菌组合物可显著改善asd患者的胃肠道功能情
况，有助于改善asd相关症状。
25.实施例5：益生菌冻干粉的制备将罗伊氏乳杆菌tr02、瑞氏乳杆菌tr11、植物乳杆菌tr22、干酪乳杆菌tr01、鼠李糖氏乳杆菌tr08、副干酪乳杆菌tr5c-1、乳双歧杆菌tr101以1％的接种量接种于10ml液体mrs培养基中，在37℃恒温培养箱中培养16h(一代种子液)。一代种子液以1%的接种量接种于100ml液体mrs培养基中，在 37℃恒温培养箱中培养16h(二代种子液)。二代种子1％的接种量接种于10l含有液体mrs 培养基的发酵罐中，150rpm，ph 6.0，37℃培养16h，收集菌液，8000rpm离心10min收集菌体，用0.9%生理盐水洗涤一次，加入四倍菌泥量的含有脱脂乳粉、葡萄糖、甘油的保护剂中重悬，真空冷冻干燥，菌粉真空包装。制得的菌粉活菌数可达2
×
10
12
cfu/g，可用于含有植物乳杆菌1701的具有抗氧化和缓解非酒精性脂肪肝功能相关药品、保健品、食品、饮料或发酵剂产品的制作和生产。
26.将短双歧杆菌tr103、长双歧杆菌tr17、动物双歧杆菌tr20、嗜热链球菌tr14、嗜酸乳杆菌tr03以1%的接种量接种于10ml液体mrs培养基中，在37℃恒温培养箱中培养24h(一代种子液)。一代种子液以1%的接种量接种于100ml液体mrs培养基中，在37℃恒温培养箱中培养24h(二代种子液)。二代种子1%的接种量接种于10l含有液体mrs培养基的发酵罐中，150rpm，ph 6 .0，37℃培养18h，收集菌液，8000rpm离心10min收集菌体，用0.9%生理盐水洗涤一次，加入四倍菌泥量的含有脱脂乳粉、葡萄糖、甘油的保护剂中重悬，真空冷冻干燥，菌粉真空包装。制得的菌粉活菌数可达1
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1011cfu/g至2
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1012cfu/g。
27.将以上制得的冻干菌粉过筛，筛网选择15目标准筛，即获得冻干粉。
28.上述液体mrs培养基的配方为葡萄糖20g、牛肉膏13.5g、胰蛋白胨4.5g、大豆蛋白胨6.5g、酵母粉6.5g、醋酸钠3g、柠檬酸氢二铵1g、磷酸氢二钾3g、硫酸镁0.6g、半胱氨酸盐酸盐0.4g、吐温-80 1ml、一水合硫酸锰0.25g，水1000ml；调整其ph为6.5。
29.实施例6：益生菌组合物的制备一种益生菌组合物，包括罗伊氏乳杆菌tr02冻干粉16份、瑞氏乳杆菌tr11冻干粉10份、植物乳杆菌tr22冻干粉8份、干酪乳杆菌tr01冻干粉12份、鼠李糖氏乳杆菌tr08冻干粉14份、乳双歧杆菌tr101冻干粉14份、短双歧杆菌tr103冻干粉10份、长双歧杆菌tr17冻干粉4份、动物双歧杆菌tr20冻干粉15份、副干酪乳杆菌tr5c-1冻干粉5份、嗜热链球菌tr14冻干粉4份、嗜酸乳杆菌tr03冻干粉6份。所述冻干粉由实施例 5制得，其中的活菌数均为1
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1010cfu/g。
30.一种益生菌组合物的制备方法，包括以下步骤：（1）称取各原料备用；（2）将除罗伊氏乳杆菌tr02、干酪乳杆菌tr01、鼠李糖氏乳杆菌tr08、乳双歧杆菌tr101和动物双歧杆菌tr20冻干粉外的各原料混合均匀，得到混合小料，待用；再将除外的剩余原料与步骤上述所得混合小料混合均匀；（3）将除3种益生菌（罗伊氏乳杆菌tr02、干酪乳杆菌tr01、鼠李糖氏乳杆菌tr08冻干粉）冻干粉外的剩余原料与步骤(2)所得混合小料混合均匀，得到混合半成品；混合转速控制在25rpm，混合时间控制在12min；（4）将步骤(3)所得混合半成品进行沸腾制粒，过筛，得到沸腾制粒半成品；沸腾制粒过程采用粘合剂，所述粘合剂为纯水、玉米淀粉、麦芽糊精中的至少一种；沸腾制粒时，进
风温度90℃，排风变频70％，物料温度60℃，雾化压力32bar，喷浆供浆泵转速74rpm；沸腾制粒后产物进行过筛，筛网选择30目标准筛；（5）将步骤(4)所得沸腾制粒半成品与3种益生菌冻干粉混合均匀，得到总混合半成品；混合转速控制在28rpm，混合时间控制在16min；（6）将步骤(5)所得总混合半成品用条包灌装机包装，即得益生菌组合物；包装时应该充入氮气，残氧量控制在6％；包装所用包材，采用铝塑包材；所述益生菌组合物的水分含量控制在3％，水分活度控制在0.18aw。
31.步骤(1)～(6)全部在十万级gmp车间中恒温恒湿环境中进行，温度控制在23℃，湿度控制在35％。
32.以上是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。